一种基于乳铁蛋白活性的新型生物材料的制备方法与流程

本发明涉及一种生物材料，具体是一种基于乳铁蛋白活性的新型生物材料的制备方法。

背景技术：

随着现代社会人口老龄化问题的加剧，骨创伤、骨肿瘤以及其它骨骼疾病的发病率居高不下，直接导致了大量的骨折和骨缺损患者。据统计，我国每年骨缺损患者超过500万人，其中因骨质疏松引起的脊柱和四肢骨骼等的骨折患者人数在200万人以上，因骨肿瘤切除、人工关节周围骨溶解、脊柱融合等需进行骨移植手术的患者约40万例，而这些患者大多面临着植骨治疗。

目前，传统植骨治疗手段主要包括自体骨移植和异体骨移植。自体骨移植一直称为行业的“金标准”，但其来源有限，供体骨形状和结构不合适，又会对患者造成二次创伤，使用受到一定限制。而异体骨移植也存在免疫排斥反应以及携带疾病的可能，直接影响植骨治疗的效果。因此研究开发生物相容性好生物性能接近自体骨组织，无免疫排斥反应的人造骨组织一直是再生医学领域研究和探索的热点。而随着医学工程的发展，骨组织工程的出现逐渐引起了广泛的关注。其主要原理是将种子细胞种植于复合了细胞因子的支架材料上，形成三维复合体，植入骨缺损部位，在生物材料逐步降解的同时，种植的骨细胞不断增殖，并分泌细胞外基质，逐渐完成自体骨替代植入骨的过程，最后达到修复骨缺损的目的。因此，支架材料、种子细胞和生长因子是骨组织工程的重要组成部分。

2、国内外在该领域的研究现状

羟基磷灰石（hap）作为骨组织的重要组成成分，是目前公认的最具潜力的骨组织替代材料，但单一的羟基磷灰石机械性差，作为骨替代材料的可靠性差。纳米技术的应用使羟基磷灰石在生物、化学、力学等方面都有了显著变化。人体骨组织中的羟基磷灰石主要是纳米针状单晶体结构，沿一定的方位分布在胶原组织中。因此，根据天然骨组织的形成机制，采用仿生的方法制备的成分、结构与天然骨相似的hap/col类骨修复材料既具有良好的力学性能，也可以作为骨生长因子的良好载体。

骨组织是一种受损后仍能恢复的组织，新骨的形成主要包括破骨细胞的再吸收和成骨细胞分泌类骨质基质及矿化等过程。关于hap/col的成骨机理，hayashik等提出植入体内的hap材料在缺损处为修复早期的微血管形成及宿主内骨系细胞的附着提供支撑，hap晶体的刺激使骨细胞活跃而围绕hap颗粒并以其为中心形成成骨区，即多中心成骨，在骨盐沉积过程中由hap提供晶核以加速钙化成骨。weinleanderm等提出了hap与骨质可进行离子交换，hap表面的负电荷可选择性地使钙、磷离子在其表面沉积，从而刺激新骨的生长。hap降解产生的钙及磷酸根离子可被周围新生骨组织利用，刺激和促进更多新骨生成。而col不仅可以诱导矿物沉积，还可诱导组织产生趋化因子，促进细胞生长和骨修复。胶原纤维中的纤维蛋白在凝血酶的作用下可聚合成可塑性良好的纤维蛋白凝胶，以弥补hap在可塑性上的缺陷。

张兴栋等在实验研究的基础上提出了钙磷陶瓷诱导骨发生的机制假说，羟基磷灰石骨诱导的步骤如下：钙磷陶瓷植入机体非骨部位，吸附bmps等内源性骨生长因子，诱使间充质细胞向材料内趋化和迁移。骨生长因子作用于间充质细胞相应受体，经细胞信号转导系统，引起级联放大效应和相关基因表达，并使间充质干细胞分化为骨母细胞，分泌骨粘连素等骨细胞间特异性的粘连分子。骨母细胞将具有类似自然骨特定化学组成和三维多孔结构的陶瓷错位识别为自然骨，停泊、黏附于其内表面，进而骨母细胞自分泌bmp等生长因子引起自身及相应细胞分化、增殖、成熟为骨。

因而，生长因子是骨组织的发育、维持、再生等过程中的重要调节物质。目前在骨组织工程中应用较多的骨生长因子有骨形态发生蛋白（bmp）、胰岛素样生长因子（igf）、表皮细胞生长因子（egf）、成纤维细胞生长因子（fgf）、转化生长因子-β（tgf-β）、血管内皮生长因子（vegf）等。但这几种骨生长因子现阶段主要还是通过基因工程学和分子生物学等技术手段获得，不但其生产设备繁复，而且其制备工艺也相当复杂，因此造成其制作成本高，价格昂贵，难以大规模生产，限制了其在实验及临床中的广泛应用。

而lf是一种80kda左右的铁结合糖蛋白，广泛分布于哺乳动物乳汁和其他多种组织及其分泌液中，人乳中lf浓度约为1.0～3.2mg/ml，其含量仅次于酪蛋白，占普通母乳总蛋白的20%，易于获取。并且有研究表明，lf对成骨细胞的增值有良好的促进作用，且该作用呈剂量依赖关系。另外已有报道lf对体外骨细胞的影响和作用机制以及局部注射lf对骨细胞的影响和作用机制，这些研究确定了lf是一种新型的骨生长因子，它对成骨细胞和破骨细胞的总作用效果是增加了骨含量，即促进了骨形成又抑制了骨吸收。

grey等人也研究报道了lf对于鼠前体成骨细胞dna的合成具有促进作用，说明lf对于成骨样细胞的有丝分裂具有促进作用。使用mapk抑制剂对鼠成骨样前体细胞进行预处理后，发现对lf诱导的成骨细胞有丝分裂受到了抑制作用，说明lf是通过调控mapk信号转导通路，从而促进成骨细胞增殖与分化的，并且能够显著地抑制成骨细胞的凋亡。lf可以减少由于依托皂苷所导致的成骨细胞凋亡率达60%。对鼠骨髓的培养发现lf可呈剂量依赖地抑制破骨细胞的生成，而且当lf浓度为100μg/ml时作用最大，可以完全地抑制破骨细胞的生成。因此大量实验研究表明，lf不仅具有抗菌、抗炎、调控骨再生预防骨质流失等多种生物活性，还可促进成骨细胞增殖抑制成骨细胞凋亡，从而可作为一种新型的骨生长因子应用于骨组织工程。

在生物材料领域，蛋白质的吸附是植入材料与组织相互作用的第一步，所以蛋白质与生物材料的相互作用是骨组织工程的设计关键。羟基磷灰石作为骨修复材料植入体内时，其表面吸附的生长因子对骨重建具有至关重要的作用。本发明从hap/col与lf的相互作用机制入手，将来源较广的lf负载于hap/col植入材料上，实现骨生长因子的缓慢释放，从而提高hap/col复合材料的成骨活性，获得一种具有较高生物活性的新型骨组织工程复合材料。

目前已知的骨生长因子主要有：包括bmp在内的转化生长因子家族（tgfs）、成纤维细胞生长因子（fgf）、血小板衍生生长因子（pdgf）、血管内皮生长因子（vegf）、胰岛素样生长因子（igf）等。但这些内源性的骨生长因子主要通过两种方法获得，一种是从体液或血液等组织分离提取，但生长因子在体内的属于微量多肽或蛋白，提取困难。另一种是通过基因工程学和分子生物学等技术手段获得，不但其生产设备繁复，而且其制备工艺也相当复杂，因此造成其制作成本高，价格昂贵，难以大规模生产，限制了其在实验及临床中的广泛应用。并且骨生长因子的半衰期较短，容易在体内降解和被体液稀释，达不到理想的效应浓度，但如果采用首次大剂量给药，容易导致局部毒性和血管瘤样病变，也限制了其应用范围。

技术实现要素：

本发明是一种基于乳铁蛋白活性的新型复合生物材料的制备方法，该产品具有良好的生物相容性，与常规材料相比具有更高的成骨活性。

本发明的技术方案是这样实现的：一种基于乳铁蛋白活性的新型生物材料的制备方法，其特征在于，步骤如下：

将hap/col粉末加入乳铁蛋白溶液中，hap/col粉末的加入量为乳铁蛋白质量的的0.2%～1%，30～40℃反应5～30h，过滤离心，取上清液，并用超纯水对复合物粉末冲洗去除杂质，采用冷冻干燥的方式对得到的hap-lf复合材料进行干燥处理。

进一步地，羟基磷灰石/胶原粉末的制备方法：取80～120ml胶原蛋白溶液，逐滴加入1～2mol/l的ca(no3)2搅拌10～30min后滴加0.5～1mol/l的(nh4)2hpo4溶液，控制反应温度10℃以下，继续搅拌30～90min，以0.5～1mol/l氢氧化钠滴定溶液ph至6～8，同时收集白色沉淀，蒸馏水反复洗涤沉淀，冻干后制得羟基磷灰石/胶原粉末，其中，滴加的ca(no3)2和(nh4)2hpo4的体积比为=1:1。

进一步地，所述的胶原蛋白溶液为：将胶原溶于0.04～0.06mol/l的醋酸溶液中，制备0.5～1%酸性胶原溶液，低温下添加na2hpo4·12h2o使终浓度为0.01～0.03mol/l，用2～3mol/l的naoh溶液调ph至中性备用。

进一步地，所述乳铁蛋白溶液的制备方法为：将乳铁蛋白粉末溶于ph为4～8的磷酸盐缓冲溶液中，使终浓度为0.2～5mg/ml，经过充分搅拌溶解之后，将溶液通过0.1～0.45µm孔径的膜，收集透过液备用。

本发明的有益效果为：（1）将具有成骨活性的乳铁蛋白作为一种新型的骨生长因子应用于骨组织工程领域，解决了目前各种骨生长因子获取较难，价格昂贵的问题。（2）利用乳铁蛋白与羟基磷灰石/胶原蛋白复合材料之间的相互作用，实现了乳铁蛋白的缓慢释放，解决了负载生长因子半衰期短的问题。（3）一定程度得提高了羟基磷灰石/胶原蛋白植入材料的促成骨活性，解决了单一生物材料生物活性较低的问题。

说明书附图

图1本发明的工艺流程图。

图2水热法合成hap扫描电镜图。

图3羟基磷灰石氮气吸附脱附曲线（a）图。

图4bjh孔径分布(b)图。

图5hap/col对lf的吸附曲线。

图6两种hap/col结合lf后的tg-dtg曲线；（a）hap/col,(b)hap/col-lf,(c)lf。

图7hap,hap-lf以及lf的红外表征图。

图85hap/col-lf复合物在pbs中的释放率。

图9hap-lf不同时间点对成骨细胞活力的影响对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解释说明。

（1）羟基磷灰石的合成：采用caco3和cahpo4·2h2o的混合物为前驱物，通过水热合成得到晶粒完整、分散性好、端面粒度在100nm以下的ha粉体。

（2）hap/col复合材料的制备：取80～120ml胶原蛋白溶液，逐滴加入1～2ml磷酸，搅拌10～30min后滴加0.02～0.04mol/l氯化钙溶液，继续搅拌30～90min，以0.5～1mol/l氢氧化钠滴定溶液ph至6～8，同时收集白色沉淀，冻干后制得羟基磷灰石/胶原粉末。

（3）乳铁蛋白溶液的配置：将乳铁蛋白粉末溶于ph为4～8的磷酸盐缓冲溶液(pbs)中，使终浓度为0.2～5mg/ml，经过充分搅拌溶解之后，将溶液通过0.1～0.45µm孔径的膜，收集透过液备用。

（4）hap/col-lf复合物的制备：将hap/col粉末加入乳铁蛋白溶液中，羟基磷灰石与乳铁蛋白量的比为0.2%～1%，30～40℃，800～1200r/min反应5～30h。

（5）过滤离心：反应结束后，3000～10000r/min离心5分钟，去上清，并用2ml超纯水对复合物粉末冲洗1～5遍，以去除hap-lf复合物之外的其它杂质。

（6）产品干燥：采用冷冻干燥的方式对得到的hap-lf复合材料进行干燥处理。干燥后粉末中水分含量小于5%。

本发明所得到的hap-lf新型复合生物材料相关的研究方法如下：

（1）合成羟基磷灰石的扫描电镜观察

用吸耳球吹走待测的天然hap表面的灰尘，去离子水洗净样品后，放于恒温干燥箱中干燥，待样品彻底干燥后用导电胶将样品贴于扫描电境的载物台表面，再将载物台放入扫描电镜的真空腔内，调节镜头的位置和焦距，逐一对待测样品进行检测。

（2）合成羟基磷灰石的比表面积表征

采用全自动比表面孔径分析仪asap2020对合成的羟基磷灰石的比表面积进行分析。样品烘干后，取0.6g装入样品管进行预处理，预处理温度为150℃。其次抽真空，抽气真空值为500μmhg。而后进行吸附脱附分析，150℃反应6h，升温速率为10℃/min。

（3）hap/col-lf复合物中lf装载量的测定

根据反应前后溶液中蛋白含量的差来计算，溶液中蛋白浓度的测定采用bca法。按照说明书的具体方法，将反应前蛋白溶液的浓度记为c1，体积为v，反应后溶液中蛋白的浓度记为c2，冲洗掉蛋白的量为w1，羟基磷灰石的量为w2，则复合物中lf的装载量w%为：

装载量还可通过热重分析的方法进行测定，反应前后hap/col与hap/col-lf质量下降之间的差值即为lf装载于hap/col上的量。利用热重分析仪对所制备的hap/col以及hap/col-lf的有机物及无机物的含量百分比及分解温度进行分析。热重分析测试是在流动的氮气气氛下进行，升温速率为20℃/min，温度范围为20～800℃。

（4）hap/col-lf复合材料的红外表征

将待测的天然羟基磷灰石试样和溴化钾在恒温干燥箱中加热100℃干燥数小时，然后将待测试样和溴化钾按照1:100的比例放入玛瑙研钵，充分研磨，使两者混合均匀。取适量研磨后的混合物倒入红外专用压片模具中，加压28mpa，保持1分钟后取出，混合物加入量以最终压制的圆片为半透明状为宜。将压制的圆片状样品置于傅里叶变换红外光谱仪上，采用透射法测定其红外光谱，扫描时设定扫描间隔为4cm^-1，扫描次数为64次，扫描范围从400cm^-1至4000cm^-1，扫描背景后对样品进行扫描，并对所得谱图进行校正，即得到样品的红外光谱图。将待测试样的红外光谱图及其具体数据与羟基磷灰石标准图谱进行比较，确定待测试样的成分。

（5）lf体外释放率的测定

将hap/col-lf复合物置于ph7～8的pbs缓冲溶液中，每24h取500μl于离心管中，采用bca的方法测其中蛋白含量。

（6）hap/col-lf复合材料的成骨活性

采用mtt法分析hap/col-lf复合物对成骨细胞增殖活性的影响，具体实验步骤如下：将成骨细胞消化计数，将细胞浓度调整为每孔l×10⁵个/ml，然后将细胞接种于96孔培养板。在培养48h后进行检测。吸除培养液，用pbs反复清洗除去死细胞，每孔加入含有0.5%mtt的α-mem100μl，于37℃，5%co2培养箱中孵育4h；在下观察出现黑色网状物后终止孵育，弃去培养液；每孔加入150μldmso，振荡10min后用酶联免疫检测仪在波长490nm处测定其吸光值，用od值表示。

实验结果：

（1）合成羟基磷灰石的扫描电镜观察

对水热法合成的羟基磷灰石试样进行扫描电镜观察，结果如2所示。水热合成的羟基磷灰石呈针状，长在100-150nm之间，宽在20-30nm之间。

（2）合成羟基磷灰石的比表面积表征

水热合成的羟基磷灰石的比表面积和孔径分布分析如图3和图4所示。a和b为纳米级羟基磷灰石的氮气吸附-脱附曲线图和孔径分布图。氮气吸附-脱附的曲线不重合，有明显的滞后环，属于典型的ⅳ型吸附曲线，表明羟基磷灰石样品具有介孔结构。由氮气吸附-脱附曲线，经bet分析可知，合成的羟基磷灰石的比表面积为84.48m²/g。由b材料的孔径分布图可知，合成的羟基磷灰石中的孔主要分布在2-4nm和20-30nm之间。但根据合成的羟基磷灰石的形貌可以判断出2-4nm左右的介孔属于颗粒内孔而20-40nm左右的介孔可能是颗粒间孔。

（3）hap/col-lf复合物中lf的装载量

由图5可知，lf在hap/col上的吸附量逐渐趋向于一个极值，说明hap/col和lf之间存在着吸附平衡。在37℃条件下，hap/col对lf的饱和吸附量约为91.10μg.mg^-1。

hap/col-lf复合物的热重分析如图6所示。由图6的tg曲线可知，hap/col材料失重5.2%，hap/col-lf失重17.844%。单一材料与复合蛋白后的材料最终重量变化之差即为材料上吸附蛋白的量。同时由图6dtg曲线可知，在升温过程中hap/col的质量变化在500℃以下都经历了一个阶段即200℃以下所发生的物理水的蒸发。而hap/col-lf的质量变化在500℃以下都经历了两个阶段，即200℃以下所发生的物理水的蒸发和200-500℃时的材料表面蛋白的灰化。乳铁蛋白的dtg曲线在200-500℃也有一个明显的失重峰，且失重的温度点与hap/col相吻合，可进一步证明经反复冲洗后的hap/col-lf材料表面仍有lf吸附。500℃以上时，hap/col与hap/col-lf的tg曲线趋于平行，且从dtg曲线也可发现，500℃之后hap/col与hap/col-lf失重温度点相同且两条线趋于相交证明所吸附蛋白完全从两种hap/col上脱除。

（4）hap/col-lf复合材料的红外表征

hap与hap-lf以及lf的红外表征图如图7所示。(1)nano-hap，(2)nano-hap-lf，(3)lf。hap图谱中出现了hap所有的特征峰，由hap的红外图谱可知，565cm^-1、603cm^-1处为po4^3-的弯曲振动峰，952cm^-1、1031cm^-1为po4^3-的伸缩振动峰，3425cm^-1处为-oh的伸缩振动峰。且对于hap-lf来说，在1530cm^-1附近均出现了一个c-h伸缩振动峰，而此峰也同样出现在了lf中，所以进一步证实在经过充分洗涤后，lf仍稳定地吸附在hap表面。

（5）lf体外释放率的测定

hap/col-lf复合物在pbs中的释放规律如图8所示，结果显示，在0-7d的时间范围内，hap/col对lf表现出了良好的缓释作用，最大释放量达到75%左右。

（6）hap/col-lf复合材料的成骨活性

采用mtt法考察hap-lf作用于成骨细胞24h、48h和72h后的影响，结果如图9所示。图9中：a，b，c，d表示不同水解时间产生的水解产物对成骨细胞作用的差异显著性，相同字母代表差异不显著（p＞0.05），不相同字母代表差异显著（p＜0.05）。

从图中可以看出，在复合物作用于成骨细胞48h和72h后，hap-lf组与单纯的hap组相比能显著地促进成骨细胞的增殖，并且作用效果最显著。而hap组与空白对照组相比表现出了较差的生物相容性，但复合了lf后，其对成骨细胞的增殖有了显著的提高。所以，lf复合于hap的表面，显著提高了hap的生物活性。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。