一种中药制剂的新应用的制作方法

本发明属于中医药技术，具体涉及一种中药制剂的新应用。

背景技术：

术后腹腔粘连是指盆、腹腔外科术后因腹膜损伤后修复期间形成的腹腔脏器或与腹壁间的纤维带，本发病率高，据文献报道上腹部手术后的发病率为93-100％，下腹部手术后的发病率为67-93％。本病一旦形成可引起一系列并发症如腹痛、腹胀、肠梗阻等。甚至二次手术时会延长手术时间，增加肠及其他器官的损伤机率，给患者精神和经济上带来双重负担。

常见临床表现为患者术后出现慢性腹痛、腹胀、便秘，甚或是肠梗阻反复发作，部分患者会出“大网膜粘连综合征”：患者感到切口周围的慢性牵址痛，尤其是腹壁活动加大时更为明显，主耍是肠管与大网膜和切口处有巧连导致肠管的运动功能障碍，肠内容物的阻力増加而致更为严重的还可出现剧烈腹痛、腹胀及便血等肠坏死的症状。

现代医学试图针对每个诱发腹腔粘连形成的因素，作为防治腹腔粘连的策略。主要以抑炎剂、抗凝剂、抗氧化剂、促纤维蛋白溶解剂、物理隔离材料类制剂、分子基因靶向制剂。丰富治疗手段的涌现，亦反映出对抗腹腔粘连的难度。单一功效的抗粘连措施局限性强，比如抗炎剂在动物模型和临床实验中药效不一致；纤溶力强的制剂易引发出血，影响创面愈合，某些药物还需要凝胶作为载体才能发挥抗粘连作用；材料类制剂发创伤前后干预疗效截然迥异，价格昂贵，难以广泛应用于外科临床；尽管部分材料类制剂已被批量生产，但制备复杂，需要止血，柔韧性差，复杂的固定技术等诸多缺点难以顺应腔镜外科临床需要。

有研究表明在腹腔粘连过程中，其产生多种刺激物质使成纤维细胞活化、增殖，同时上调cd4表达，促进成纤维细胞与cd4阳性细胞如t细胞、肥大细胞等相互作用，加强活化。因此，成纤维细胞增殖、活化在腹腔粘连过程中起到了重要作用。同时成纤维细胞的增殖，又分泌过多的细胞因子如ifn-β等致使白细胞聚集、增殖、滞留并抑制其凋亡、迁移，导致白细胞的持续浸润，组织异常增生、瘢痕化。由此可见，成纤维细胞的增殖活化及相关因子异常分泌在腹腔粘连发生、发展及病症增生、粘连中起重要作用。因此如何有效调控成纤维细胞成为腹腔粘连亟待解决的问题之一。本专利以对成纤维细胞调控为切入点，通过抑制腹腔成纤维细胞增殖，为临床提供防治腹腔粘连提供参考。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术中的上述缺陷，本发明提供了一种已知中药制剂的新应用，即通过抑制腹腔成纤维细胞增殖达到防治腹腔粘连。

技术方案：本申请所述的是一种由大黄、桃仁、芒硝、红花、延胡索和莱菔子组成的中药制剂用于抑制腹腔成纤维细胞增殖的应用。

一种由大黄、桃仁、芒硝、红花、延胡索和莱菔子组成的中药制剂用于降低成纤维细胞ⅲ型胶原蛋白mrna表达水平的应用。

一种由大黄、桃仁、芒硝、红花、延胡索和莱菔子组成的中药制剂作为有效成分，用于制备抑制腹腔成纤维细胞增殖药物的应用。

一种由大黄、桃仁、芒硝、红花、延胡索和莱菔子组成的中药制剂作为有效成分，用于制备降低成纤维细胞ⅲ型胶原蛋白mrna表达水平药物的应用。

所述中药制剂包含以下重量份的各个组分：大黄1-20g、桃仁2-20g、芒硝2-20g、红花1-20g、延胡索2-30g、莱菔子2-20g。

所述中药制剂通过以下步骤制备得到：

(1)按照1:1:1:1的重量比称取大黄、桃仁、延胡索和莱菔子，然后加饮片总量15倍的70％乙醇分两次回流提取，每次2h，滤过，合并提取液，滤液减压回收乙醇，浓缩至无醇味；

(2)按照红花：步骤(1)称取的大黄为3:5的重量比称取红花，加入步骤(1)所得药渣中，然后加饮片总量20倍水分三次煎煮，每次1小时，滤过，合并水煎液，再60℃将滤液浓缩至相对密度为1.09～1.11，冷却，加乙醇至含醇量50％，搅匀，静置48h，滤液回收乙醇；

(3)取步骤(2)所得上清液，按照芒硝：步骤(1)称取的大黄为1:1的重量比称取芒硝加入上清液中，在60℃缩至相对密度1.12～1.15，然后用生理盐水配制成浓度为0.6g/ml给药样品液。

有益效果：本发明在现有技术的基础上，对由大黄、桃仁、芒硝、红花、延胡索和莱菔子组成的中药制剂进行了更深层次的研究，发现上述中药制剂可以降低成纤维细胞ⅲ型胶原蛋白mrna表达水平，从而抑制腹腔成纤维细胞增殖，为研制防治腹腔粘连的药物提供了新的思路和前景。

附图说明

图1为实施例2中各组大鼠腹腔粘连示意图，其中①假手术组、②模型组、③干预组；

图2为实施例2中各组大鼠肠组织masson染色结果(100×)示意图，其中①假手术组、②模型组、③干预组。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。

实施例1中药制剂的制备方法

由大黄，桃仁，延胡索，莱菔子所制成，大黄：桃仁：延胡索：莱菔子＝1:1:1:1，加饮片总量15倍的70％乙醇(95％乙醇的量＝150×70％÷95％)分两次回流提取，每次2h，滤过，合并提取液，滤液减压回收乙醇，浓缩至无醇味。上述药渣与红花合并(红花：大黄＝3:5)，加饮片总量20倍水分三次煎煮，每次1小时，滤过，合并水煎液，滤液浓缩至相对密度为1.09～1.11(60℃)，冷却，加乙醇至含醇量50％，搅匀，静置48h，滤液回收乙醇，取上清液加芒硝(芒硝：大黄＝1:1)缩至相对密度1.12～1.15(60℃)，备用。用生理盐水配制成浓度为0.6g/ml给药样品液。

实施例2水煎液防治腹腔粘连评价

动物

健康雄性sd大鼠96只，体质量220～250g，由南京青龙山动物繁殖场提供(spf级)，合格证号scxk(苏)2017-0001。实验过程中对动物的处置符合科技部《关于善待实验动物的指导性意见》规定。大鼠实验前于动物房适应环境7d，室温18～25℃，相对湿度65％～70％，自由采食和饮水，照明昼夜明暗交替。

仪器

realtimepcr仪(美国abisteponeplus)，垂直电泳设备电泳仪(美国bio-rad)，化学发光成像仪(美国bio-radchemidocxrs+)。核酸蛋白测定仪(美国lifetechnologiesqubit2.0)。

方法

将72只大鼠随机分为假手术组，模型组，干预组3组，每组24只。造模前各组大鼠禁食12h，不禁水。用10％水合氯醛腹腔注射(0.3ml/kg)麻醉，动物麻醉后仰卧位固定，腹部剪毛、消毒后，无菌操作下取前正中切口2cm进腹，除假手术组外，其余各组回盲部右侧面用什锦锉刀反复磨擦浆膜层至表面针尖状出血点，形成约5cm×4cm的受损创面后纳入腹腔；假手术组大鼠，用无齿镊钳夹将回盲部肠管拉出腹腔外，充分暴露3min后复位，各组逐层关腹，分笼饲养。

每只大鼠从造模开始到关腹，时间控制在5min，术中各项生命体征平稳。造模后6h，干预组造模大鼠按体表面积换算后，分别给予实施例1制备所得中药制剂6.0g/kg药液灌胃。假手术组和模型组均予等容量生理盐水灌胃，1次/d，共14d。

腹腔粘连评分及masson染色

分别于术后1、7、14d每组随机各取8只大鼠，采用颈椎脱臼法处死，剑突下“c”型切口进腹，分别从粘连数目、粘连范围、粘连强度五分级标准观察粘连情况，由第三方根据phillips及bhatia分级标准记录粘连得分，见表1。masson染色实施如下，腹腔粘连组织石蜡脱水，包埋；切片脱蜡至蒸馏水；weigert铁苏木精液染核10min；盐酸乙醇分化；masson符合染液5至10min；蒸馏水冲洗；磷钼酸5min后甩干；苯胺蓝10min，蒸馏水稍洗；分化液分化20s，共两次；蒸馏水2min；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片，镜下拍照。

表1肉眼腹腔粘连分级标准

数据处理

用spss18.0统计软件包对实验数据进行统计学处理，计量资料用表示，采用单因素方差分析，然后再用post-hoc进行分析，post-hoc用多重比较的最小显著性差异校正进行调整。p<0.01为差异有统计学意义。

结果

一般情况观察

术后各组大鼠未出现死亡，腹部切口愈合良好，无红肿、渗出、切口疝发生。术后24h，各组大鼠一般情况均差，不活动，少量进食、饮水。术后2d，一般状态尚可，活动量较前增加，进食和饮水基本恢复正常。术后第3天起，腹部创面缝线逐渐脱落，活动恢复正常，进食和水量正常。

大鼠腹腔粘连分级评分及masson染色结果

术后第1天，模型组粘连最显著，假手术组未见粘连，其余各组均见粘连形成。术后第7天，干预组见粘连数目减少，疏松，未见血管生成。模型组粘连范围增大，韧性较前有所增加，部分粘连偶见伴生血管。术后第14天，粘连范围和第7天相比有所扩大，韧性无明显差异。各治疗组和模型组相比较，不同程度改善腹腔粘连程度，其中干预组腹腔粘连评分存在显著性差异(p＜0.01)。见表2及图1。

表2各组各1d、7d、14d腹腔粘连级别评分(n＝8)

注：与假手术组比较，*p<0.01，与模型组比较，^#p<0.01。

术后第14日，masson染色观察胶原纤维，镜下胶原纤维形呈现蓝色，肌纤维呈现淡红色。假手术组局部少量呈浅蓝色胶原纤维组织；模型组局部蓝色深且组织间隙较小，提示存在大量胶原纤维及粘连。干预组胶原纤维增生减少。具体见图2。

实施例3对成纤维细胞ⅲ型胶原蛋白mrna表达的影响试验

细胞

小鼠胚胎成纤维细胞nih/3t3购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

主要试剂及其配制

trizol、逆转录试剂盒和实时荧光定量pcr试剂盒均购于大连宝生物工程有限公司。pcr枪头和离心管均为一次性无rna酶产品；其它试剂均为分析纯，购自南京化学试剂公司；

主要溶液配制

pbs缓冲液的配制：准确称量nacl8.0g、kcl0.2g、na2hpo4·12h2o3.48g、kh2po40.2g，依次溶解于1000ml超纯水中，混匀分装，高压灭菌后置于4℃冰箱储存备用。

高糖dmem培养基：按照说明书进行。每袋dmem粉剂先溶于950ml双蒸水，用20ml双蒸水冲洗包装袋并入；加入3.7gnahco3，用双蒸水补充至1000ml，磁力搅拌使之充分溶解。加入100iu/ml青霉素和100iu/ml链霉素。0.22μm的微孔滤器正压过滤除菌，4℃保存备用。使用前加入胎牛血清(经56℃水浴30min灭活)(终浓度10％)。

细胞消化液：称取250mg胰蛋白酶，20mgedta；溶于100mlpbs缓冲液中，搅拌溶解完全，0.22μm的微孔滤器过滤除菌，分装，-20℃冻存。

仪器设备

超声波清洗器，kq-500e型，江苏昆山超声仪器有限公司生产；

电子天平以及精密电子天平，均为上海天平仪器厂产品；

离心机，ld4-2a型，北京医用离心机厂；

低速自动平衡离心机，ldz5-2型，北京医用离心机厂；

三用恒温水箱，上海精密实验设备有限公司；

磁力加热搅拌器，79-1型，金坛市医疗仪器厂；

立式蒸汽灭菌器，ls-b5ol型，上海华线医用核子仪器有限公司；

微量振荡器，xk96-b型，姜堰市新康医疗器械有限公司；

电热鼓风干燥箱，hg1-1-1(1a/1ad)，南京实验仪器厂；

5％co2培养箱，napco，311rel﹟5，usa；

倒置显微镜，th4-200型，日本olympus公司产品；

酶标仪，jio-ket型，power-wave340，usa。

含药血清的制备

清洁级sd大鼠24只，雌雄各半，体重为220-250g，南京青龙山动物养殖场提供，许可证号码：scxk(苏)2017-0001。将大鼠随机分为空白组、含药血清组，每组6只。每日上午给药前将大鼠禁食12h，含药血清组将实施例1制备所得制剂按600g·l-1剂量给大鼠灌胃，每日2次，连续3d。空白组仅给予以等体积生理盐水灌胃，在最后一次给药2h后，腹主动脉取血，取血后用颈椎脱臼法处死动物。血液置于10ml离心管内，室温放置1h，待充分凝血后，4℃放置过夜。3000rpm离心15min，分离血清，56℃水浴上放置30min，最后超净工作台用0.22μm微孔滤器滤过除菌，无菌分装，密封后-80℃条件下保存备用。

含药血清对nih/3t3细胞ⅲ型胶原蛋白mrna表达的影响

取对数生长期nih/3t3细胞以5×10⁵的密度接种于6孔板，24小时后予以加药处理，分组方法同实施例2。加药处理24h后，消化、离心，收集各组细胞，用实时荧光定量pcr法检测各组细胞中变化。

实验前准备

将研钵、金属器械、玻璃器皿置于烤箱中180℃干烤4h，去除rna酶；将异丙醇、75％乙醇(0.1％depc水配制)放入4℃冰箱预冷；配制0.1％depc水：超纯水中加入depc至浓度为0.1％，在搅拌器上搅拌至完全混匀，及看不到“油珠”为止，37℃生化培养箱中放置过夜，高压蒸汽灭菌器上121℃灭菌1h，直至depc完全分解以避免影响下游实验，4℃保存备用；eppendorf管(ep管)、枪头、无粉手套、口罩等均为市售一次性无菌无酶耗材。

培养细胞总rna提取

常温10000g离心1min收集10⁵培养细胞，加入1mltrizol试剂，涡旋震荡裂解，室温放置5min；加入200ul氯仿，手动颠倒剧烈混匀30s，室温放置3min；在低温高速离心机上，4℃，12000g离心15min；将上层水相轻轻转入另一洁净1.5mlep管中；加入500ul4℃预冷的异丙醇，手动颠倒轻轻混匀，室温放置10min；在低温高速离心机上，4℃，12000g离心10min,离心后可见白色胶状沉淀即为rna；加入1ml预冷的75％乙醇(无菌0.1％depc水配制)，温和振荡离心管，悬浮沉淀；4℃7500g离心5min，洗涤rna，弃上清；4℃7500g离心2min，重复洗涤rna，枪头吸弃上清；室温干燥5min；加入20ul无菌0.1％depc水，56℃助溶5min；在-76℃保存rna备用。

rna浓度、纯度及完整性测定

吸取2μlrna，在微量核酸蛋白测定仪上进行rna浓度、纯度检测，测得的a260/a280在1.8～2.0之间，表示rna纯度高，rna经琼脂糖凝胶电泳后，28s与18s区带清晰集中，28s与18s比值大于2，则表明rna样品未降解。

cdna合成

采用superquickrtcdna试剂盒合成cdna，反应体系如下：总体系40μl；rna模板，2ul；primer，4ul；无菌0.1％depc水，16ul；5×buffer，8ul；dntp，8ul；rt，2ul。反应条件如下：37℃，15min；85℃，5s；-76℃，保存备用。

引物设计与合成

根据ncbigenebank中目的基因序列，采用primer5.0软件设计引物，由上海生工生物公司合成，具体序列如下：

引物稀释：将引物干粉在台式小型高速离心机上短暂离心，加入灭菌ddh2o将引物稀释成10um，涡旋震荡混匀，短暂离心，-20℃保存备用。

real-timepcr

本实验所用仪器为stratagene公司mx3000p型号的real-timepcr扩增仪。以模型组为对照，gapdh为参比基因，采用2^-δδct法进行相对荧光定量pcr。

相对定量pcr(2^-δδct法)

real-timepcr反应体系配制：取两支洁净1.5mlep管，根据反应所需样品孔数将real-timepcr各组分进行预混，目的基因和参比基因各一支，分装至八联排pcr管中，每孔48μl，再加入cdna模板2μl，每个样本每个基因平行做3孔。相对表达量计算公式：

f＝2^{-((待测样本目的基因的平均ct值-待测样本参比基因的平均ct值)-(待测样本目的基因的平均ct值-待测样本参比基因的平均ct值))}

上机检测

打开荧光pcr仪，打开mxpro软件，选择相对定量实验类型“comparativequantitation(calibrator)”，先进行板子设置：选中处理组设置孔的类型“unknown”和荧光通道sybr、rox→设置参比染料“rox”→选中对照组设置孔的类型“calibrator”和荧光通道sybr、rox→设置参比染料“rox”→选中设置孔的信息按钮“assignassayname”定义基因颜色和名字→定义看家基因“normalizingassay”→设置复孔“replicatesymbol”，相同复孔设置为同一编号，即1、2、3等→最后设置关联“assoc.symbol”,即把同一样本来源设置为相同类型，如a、b、c等→设置反应条件；再进行反应条件设置：95℃，10min；95℃，15s，62℃，60s，40个循环；溶解曲线部分：95℃，1min；55℃，30s；95℃，30s；运行程序。

数据分析

所有数据结果以均数±标准差表示(x±s)，用spssforwindows16.0软件分析，组间比较采用单因素方差分析(one-wayanova)，两组间比较采用t检验，以p<0.05认为有显著性差异，p<0.01为差异性非常显著。

结果

采用比较2^-△△ct法分析细胞ⅲ型胶原蛋白mrna的表达量：即以管家基因β-actin作为内参基因相对定量，以空白组细胞作为对照组，计算各组ⅲ型胶原蛋白mrna的△△ct值。△△ct＝实验组(ct目的基因－ct管家基因)－对照组(ct目的基因－ct管家基因)，以△△ct值为定量结果进行统计分析，则目的基因的量＝2^-△△ct。参照基因表达谱芯片分析，当目的基因表达≥2倍，认为该基因表达增高，若≤0.5倍认为基因表达降低。结果发现，与空白组比较，干预组ⅲ型胶原蛋白mrna表达有降低趋势。

表3不同组方对nih/3t3细胞ⅲ型胶原蛋白mrna表达的影响

注：*与空白组比较，有显著性差异(p<0.01)。