本发明属于基因工程及生物医药技术领域，具体涉及一种特异性靶向foxo1基因的crispr-cas纳米载药系统及其应用。
背景技术：
胰岛素抵抗是代谢综合征患者（包括脂肪肝和2型糖尿病）重要的病理特征之一，这些患者胰岛β细胞分泌胰岛素的功能可能是正常甚至是偏高的，但是胰岛素作用的靶细胞不能识别胰岛素，引起一系列代谢的紊乱。现代研究表明，胰岛素抵抗与叉头框蛋白(forkheadboxo，foxo)之间相互影响。foxo是forkhead蛋白家族的一个亚群，是一类重要的转录因子。其中，foxo1是foxo家族的成员之一，可广泛作用于脂肪细胞、心肌细胞、肝细胞、胰岛β细胞等多种细胞，参与调控细胞的增殖与分化、自噬、以及线粒体功能，并且可以参与胰岛素的合成以及胰岛素对肝细胞糖脂代谢的调节。在胰岛素抵抗的条件下，foxo1的磷酸化水平降低，核转录活性增强。但foxo1的活性增强对胰岛素抵抗的作用是双重性的。一方面foxo1的核定位增强，可促进核转录因子核因子-kb(nuclearfactorkappab，nf—kb)的表达增加，白介素-1β(intedeukin-1beta，il-1β)等炎症因子的表达水平也增加，促进胰岛β细胞的凋亡，加重病情；另一方面，foxo1可促进其靶基因irs-1和irs-2的表达，提高胰岛素敏感性。因此，特异性的调控foxo1活性，仅提高其抗胰岛素抵抗作用，是目前生物医药技术的难点。
在过去几年中，以zfn(zinc-fingernucleases)和talen(transcriptionactivator-likeeffectornucleases)为代表的序列特异性核酸酶技术以其能够高效率地进行定点基因组编辑，在基础研究、基因治疗和遗传改良等方面展示出了巨大的潜力。而crispr/cas技术自2012年问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，经技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因，且具有脱靶率低、无物种限制等优势，已被广泛用于人类疾病机制相关研究中。目前，借助实验动物模型，应用基因编辑技术治疗相关疾病的研究也已屡见不鲜；科学家们已经可以通过体细胞修饰治疗个体自身遗传病（如地中海贫血）、治疗和预防个体自身基因引起的疾病（如乳腺癌和卵巢癌可删除brca基因）和感染性疾病（如将插入细胞核内的艾滋病病毒的dna删除），并逐步向临床应用转化。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种特异性靶向foxo1基因的crispr-cas纳米载药系统及其应用的技术方案。
所述的特异性靶向foxo1基因的crispr-cas纳米载药系统，其特征在于包含靶向foxo1基因的sgrna、核酸酶cas的mrna和纳米载药系统。
所述的特异性靶向foxo1基因的crispr-cas纳米载药系统，其特征在于所述的靶向foxo1基因的sgrna包含但不限于以下序列：sgfoxo1-1、sgfoxo1-2和sgfoxo1-3，所述的sgfoxo1-1的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述的sgfoxo1-2的核苷酸序列如seqidno.2所示，所述的sgfoxo1-3的核苷酸序列如seqidno.3所示。
所述的特异性靶向foxo1基因的crispr-cas纳米载药系统，其特征在于所述的核酸酶cas的mrna由体外转录制备或直接合成，所述核酸酶cas优选但不局限于cas9蛋白。
所述的特异性靶向foxo1基因的crispr-cas纳米载药系统，其特征在于所述的纳米载药系统含有氢化磷脂、胆固醇（2,3-二油酰基-丙基）-三甲胺（dotap）、二油酰磷脂酰乙醇胺（dope）、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和c16cer-peg。
所述的特异性靶向foxo1基因的crispr-cas纳米载药系统在制备治疗代谢性疾病药物中的应用。
所述的应用，其特征在于所述的代谢性疾病包括脂肪肝、2型糖尿病。
本发明在浙江省基础公益科技计划项目（2015c）资助下设计、合成了特异性靶向foxo1基因的crispr-cas纳米载药系统。该系统可将sgrna寡核苷酸载体与cas蛋白的mrna一起转入细胞肝脏和胰岛β细胞中，实现foxo1基因的敲减，其效率达到80%以上，进而抑制肝脏过度糖异生和胰岛β细胞凋亡，降低血糖、血脂水平，改善胰岛素抵抗症状和治疗代谢性疾病。
附图说明
图1为sgfoxo剪切活性鉴定，其中1-1,1-2,1-3分别是sgfoxo1-1,sgfoxo1-2,sgfoxo1-3,红色箭头指示的条带为剪切活性条带；
图2为各组小鼠肝组织he染色结果（x200）；
图3为各组小鼠胰脏he染色结果（x200）。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步说明本发明。
实施例1
利用crispr在线工具http://crispr.mit.edu/设计靶向foxo1基因的sgrna序列，序列如下sgfoxo1-1:ccgacttcgaaccccagagccgt；
sgfoxo1-2:atatgcagaactcatcagccagg；
sgfoxo1-3:cactcgcccagatctacgaatgg。
合成sgrna互补的两条单链，并利用bbsi酶切px330骨架载体将sgrna构建到crispr/cas系统质粒上。将构建好的质粒转染细胞，48小时后，提取dna进行pcr扩增。为了便于鉴定活性，本发明设计的sgfoxo1-1切割位点附近有限制性内切酶bstbi识别序列，sgfoxo1-2附近有ndei识别序列，sgfoxo1-2附近有bglii识别序列，因此pcr扩增产物对应酶切后，可以高效鉴定sgrna剪切活性。如图1所示，本发明设计的3条sgrna均具有剪切活性。按照体外转录试剂盒操作说明将活性sgrna体外转录，同时本发明核酸酶cas的mrna组分以px330载体为模板体外转录获得，两者将用于代谢性疾病治疗。
其中，sgfoxo1剪切活性鉴定引物如下：
idenf:atcggagaacggagtgaaag
idenr:cggagtgagagtaactagag。
实施例2
称取4g氢化磷脂、2g胆固醇、0.5g（2,3-二油酰基-丙基）-三甲胺（dotap）、0.5g二油酰磷脂酰乙醇胺（dope）、0.5g聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和0.5gc16cer-peg于500ml茄形瓶，加适量无水乙醇溶解。将溶液转移至旋转蒸发仪，在温度50℃下减压除去无水乙醇，得到透明均匀的薄膜，继续抽真空约10min后，加入10%的蔗糖水溶液约100g，旋转水化约30min后，得到脂质混悬液。取出置于烧杯中，加入100nmsgrna、200nmcasmrna，于4℃环境中，用高速分散机分散约10min，经高压均质机挤出两次，过0.22μm微孔滤膜，得略带乳光的脂质体溶液，加双蒸水补足至100g。用1ml移液器将脂质体溶液分装至2ml容量西林瓶中，置于冷冻干燥机内，调至温度-46℃，冷冻4小时以上，程序升温并抽真空保持压力为-0.09mpa，约12小时后取出样品，低温密封保存，即得foxo1-cas纳米脂质体。
取适量foxo1-cas纳米脂质体，加水稀释到适当浓度，加入粒径分析仪的石英测量池中，测其粒径大小及分布情况。粒径分布呈单峰正态，范围在50～200nm，平均粒径为120.1nm。
实施例3
取40只自发糖尿病伴非酒精性脂肪肝db/db小鼠，将小鼠随机分为4组，即foxo1-cas纳米脂质体组、空白纳米基质组，阳性对照组（二甲双胍）及模型对照组，每组10只；另取10只等体重的c57小鼠作为正常对照组。除正常对照组和模型对照组外，其余各组小鼠隔天给药1次，连续5次；其中crispr-cas纳米载药系统组通过小鼠尾静脉注射给予含10nmsgrna的crispr-cas纳米载药系统，空白纳米基质组通过小鼠尾静脉注射给予等量的空白纳米载药系统，阳性对照组灌胃给予小鼠8mg/kg二甲双胍。于末次给药12h后，眼眶取血采用elisa法检测小鼠血清胰岛素含量，采用血糖试纸法检测血糖含量，并处死小鼠后取小鼠肝脏和胰脏进行he染色。
表1结果表明，可知，与模型组小鼠相比，foxo1-cas纳米脂质体组db/db小鼠血糖和血清胰岛素浓度明显降低（p<0.05），降低胰岛素抵抗指数（p<0.05），且降糖和降胰岛素效果优于二甲双胍治疗。提示foxo1-cas纳米脂质体可明显降低糖尿病小鼠的血糖和胰岛素浓度，改善小鼠胰岛素抵抗。
表1对各组小鼠血糖和胰岛素的影响（
注：与模型对照组相比，*p<0.05。
如图2肝脏组织he染色结果可知，正常对照组肝组织肝小叶结构清晰、细胞质致密均匀、未见脂肪变性等明显病变细胞，而其余各组肝组织中可见脂质沉积造成的白色空泡，但foxo1-cas纳米脂质体治疗后，白色空泡较模型对照组小且少，提示给予foxo1-cas纳米脂质体治疗可改善脂肪肝病症。
如图3胰腺组织he染色结果可知，正常对照组可见正常圆形胰岛细胞存在，胰岛体积较大，并被腺泡包绕；而模型对照组和空白纳米基质组胰岛变小、数目减少，纤维组织增生、玻璃样变；给予foxo1-cas纳米脂质体治疗，胰岛病变有所改善，较模型对照组胰岛体积增大，纤维组织增生减少，提示foxo1-cas纳米脂质体对胰岛细胞损伤具有一定的改善作用。