一种复合纳米粒子及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物纳米材料领域，涉及一种复合纳米粒子及其制备方法和应用，尤其涉及一种同时具有双光子吸收和载氧功能的复合纳米粒子及其制备方法和应用。

背景技术：

光动力疗法是近年来颇受重视的一种癌症新疗法。该疗法的基本过程是：特定波长的激光照射，光敏剂受到激发，激发态的光敏剂把能量传递给周围的氧，生成活性很强的单线态氧，单线态氧和相邻的生物大分子发生氧化反应，产生细胞毒作用而导致细胞受损乃至死亡。只有暴露在光线下的细胞才会损伤，因此这种方法具有独特的选择性。但是目前获得临床批准的光敏药物只能在700nm以下有效吸收光能，而这样的光因为强散射效应不能达到深层组织，仅能进行表浅治疗。双光子技术是在强脉冲激光的激发下，利用样品吸收波长2倍的光源激发，使样品直接吸收两个光子跃迁到高能态，然后产生双光子诱导荧光。双光子的吸收过程是长波激发短波发射，光波穿透能力强，漂白效应小，光毒性小，背景光干扰少，便于更清晰地观测。瑞利散射效应较小，探测深度比单光子更深。目前已报道的双光子光敏剂多数都不容易合成，而且水溶性较差，在生理环境中容易聚集，从而限制了它们的应用。

cn105997877a公开了一种携氧增强光动力的光敏脂质体，由磷脂、胆固醇、长循环材料和血红蛋白，以及化疗药物和/或光敏剂组成，将各组分溶解于有机溶剂中，减压旋蒸形成薄膜，再加入氧合血红蛋白溶液，或光敏剂和/或化疗药物与氧合血红蛋白的混合溶液，水合反应，得到多层脂质体溶液，经超声、纯化即得，但是此发明制备的光敏脂质体不能到达深层组织，仅能进行表浅治疗，效果较差。

肿瘤微环境常呈现为缺氧状态。尽管活体组织中含有一定量的氧气分子，因肿瘤组织中细胞长期处于迅速增殖的状态，其对氧气的需求量大大增加，并且随着肿瘤体积的增大，周围组织的血管也会出现血供不足，使肿瘤微环境呈现为缺氧状态。光动力疗法是一种依赖氧气的一种治疗方法，因为引起细胞毒性的¹o2产生数量依赖于组织中氧气分子的含量。这对于用于癌症治疗来说是极其不利的因素。如果在光动力治疗过程中引入额外的o2分子到肿瘤部位，会显著提高治疗效果。

脂质体具有两亲性，头部为亲水性，插入水中，尾部为疏水性，伸向空气，搅动后形成球形的磷脂双分子层膜脂质体结构，具有靶向给药功能。脂质体囊泡因具有与生物体相似的类细胞膜结构而显示良好的生物相容性，可用于多种药物的封装。血液代用品现主要有血红蛋白和氟碳化合物两种制品，天然无基质的血红蛋白由于游离的四聚体分子及分解产物能进入组织间质引起严重的副作用，而同人体红血球相近的细胞形态，能有效的发挥其氧气运输功能，并减小副作用。脂质体囊泡与血红蛋白共组装的微球结构，可有效屏蔽自由血红蛋白造成的副作用，并发挥携氧作用。磷脂的靶向性使粒子更有效地发挥抗肿瘤作用。

因此，目前的复合粒子均存在一定的缺陷，如何开发出一种新型的复合纳米粒子应用于光动力治疗，具有重要的意义。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种复合纳米粒子及其制备方法和应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种复合纳米粒子，所述复合纳米粒子包括如下组份：双芘分子、光敏剂、磷脂化合物和具有载氧能力的化合物。

本发明提供的复合纳米粒子粒径均一，分散均匀，粒径约为200nm且粒径可调；并且采用双芘分子与光敏剂组成双光子吸收材料，相比于现有方法中的光敏剂，具有大吸收截面，能更有效地吸收光子，更深的探测深度，同时减少了对正常组织的损伤；荧光共振能量转移(fret)效应将能量转移给光敏剂，更有效杀伤细胞。

此外，由于复合纳米粒子包括具有载氧能力的化合物，使得自身有载氧功能，在肿瘤缺氧微环境中仍能有效提供充足氧气，大大提高了光动力治疗的效率；并且，磷脂化合物提供的靶向功能，使粒子更有效富集到肿瘤部位，提高治疗效率，减少正常损伤。

另外，复合纳米粒子中由于双芘分子自身的荧光性，可以对肿瘤细胞进行荧光标记和定位，用于标记肿瘤细胞，实现诊疗一体化和精准靶向治疗。

在本发明中，双芘分子的结构式如下所示：

优选地，所述光敏剂为紫外图谱与双芘分子荧光图谱重叠面积大于30％的化合物。

在本发明中，紫外图谱与荧光图谱都为标准归一化后的图谱，而后计算二者的重叠面积。

优选地，所述光敏剂为孟加拉红。

在本发明中，优选光敏剂为孟加拉红，孟加拉红与双芘分子协同使用组成双光子吸收系统，具有更好的效果；在双光子激光照射下能够有效吸收光子，通过fret效应将能量转移至光敏剂孟加拉红，孟加拉红与组织的氧气反应产生单线态氧，进而损伤肿瘤细胞；而如果使用吲哚菁绿衍生物、酞菁等光敏剂则达不到这种优良的效果，这是由于fret发生的条件之一为供体的荧光图谱与受体的紫外图谱归一化后的重叠面积要大于30％，而这些光敏剂则不具有这样的效果。

在本发明中，双芘分子与光敏剂形成了光动力治疗，这是由于荧光共振能量转移(fret)效应，即将具有双光子吸收功能的染料(作为能量供体)与孟加拉红(作为能量受体)组成fret配对，在双光子光源激发下，供体将能量传给光敏剂受体，从而起到双光子技术光动力疗法效应。

优选地，所述双芘分子与光敏剂的质量比为1:1-30，例如可以是1:1、1:5、1:10、1:12、1:15、1:20、1:25或1:30，进一步优选为1:14。

在本发明中，双芘分子与光敏剂的质量比的范围是特定的，如果光敏剂相对于双芘分子添加过少，会造成光敏剂产生的活性氧降低，不利于抗肿瘤效果的提高；如果光敏剂相对于双芘分子添加过多，会造成双光子荧光分子在纳米粒子中包载过少，双光子的吸收效率降低，影响抗肿瘤效果，同时不利于探测深度的增加。

优选地，所述具有载氧能力的化合物包括血红蛋白和/或全氟碳化合物，优选为血红蛋白。

优选地，所述双芘分子与具有载氧能力的化合物的质量比为1:8-120，例如可以是1:8、1:10、1:20、1:40、1:80、1:90、1:100、1:110或1:120。

在本发明中，血红蛋白的载氧功能可以提供更多的氧气，并且更适应人体生理特性，克服肿瘤部位的缺氧微环境，使得光动力治疗的效率提高；而如果缺少血红蛋白，则光动力治疗的效率大大降低。

优选地，在复合纳米粒子中，相对于1mg双芘分子，所述磷脂化合物的质量为1-50g，例如可以是1g、3g、5g、8g、10g、15g、20g、24g、28g、30g、35g、40g、44g、45g、48g或50g。

优选地，所述磷脂化合物包括二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、1,2-二油酰基卵磷脂、二油酰磷脂酰乙醇胺、胆固醇、二硬脂酰基卵磷脂、1,2-二油酰基羟丙基-3-n,n,n-三甲基氯或二硬脂酞基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸中的任意一种或至少两种的组合。

优选低，所述磷脂化合物为二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱和二硬脂酞基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸的组合。

优选地，所述磷脂化合物中二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱和二硬脂酞基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸的质量比为(10-50):1，例如可以是10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1，进一步优选为30:1。

第二方面，本发明提供了如第一方面所述的复合纳米粒子的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)将磷脂化合物制备得到磷脂化合物纳米微球分散液；

(2)将双芘分子分散于溶剂中得到双芘分子微球分散液；

(3)将具有载氧能力的化合物、光敏剂和步骤(1)得到的磷脂化合物纳米微球分散液加入到双芘分子微球分散液中，而后经过处理得到所述复合纳米粒子。

步骤(1)中所述磷脂化合物经过旋蒸、乳化、过膜得到磷脂化合物纳米微球分散液。

优选地，步骤(1)中所述磷脂化合物纳米微球分散液的溶剂为甲醇和氯仿。

优选地，所述旋蒸的时间为20-60min，例如可以是20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min，优选为40min。

优选地，所述旋蒸后得到磷脂膜，磷脂膜经真空干燥后，加入到水中。

优选地，所述真空干燥的时间为1-24h，例如可以是1h、4h、8h、12h、16h、20h或24h，优选为4h。

优选地，步骤(1)中所述乳化的时间为0.5-3h，例如可以是0.5h、1h、2h、2.5h、3h，优选为1h。

优选地，步骤(1)中所述乳化的温度为30-45℃，例如可以是30℃、32℃、35℃、37℃、38℃、40℃、42℃或45℃，优选为37℃。

优选地，所述乳化的溶剂为水。

优选地，步骤(1)中所述过膜为将乳化后的溶液通过聚合物多孔滤膜。

在本发明中，聚合物多孔滤膜为millipore聚碳酸酯膜。

优选地，所述聚合物多孔滤膜的孔径为100-400nm，例如可以是100nm、150nm、200nm、250nm、300nm、350nm或400nm，优选为200nm。

优选地，步骤(1)中所述过膜的次数为2-30次，例如可以是2次、5次、8次、10次、15次、18次、20次、25次或30次。

优选地，步骤(1)中所述磷脂化合物纳米微球分散液的浓度为5-30mg/ml，例如可以是5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml或30mg/ml，优选为10mg/ml。

在本发明中，如果磷脂化合物纳米微球分散液的浓度过小，则会使合成药物的浓度过低，达不到反应效果；而如果合成浓度过高，磷脂溶液不容易通过滤膜，也会影响反应效果。

优选地，步骤(2)中所述双芘分子微球分散液浓度为1-5mm，例如可以是1mm、2mm、3mm、4mm或5mm。

在本发明中，步骤(2)中双芘分子微球分散液的溶剂为二甲基亚砜。

优选地，步骤(2)中双芘分子分散于溶剂后，经过超声处理。

优选地，双芘分子分散液的超声处理时间为15-60min，例如可以是15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min，优选为30min。

优选地，步骤(3)中所述光敏剂的溶液浓度为浓度为0.5-5mg/ml，例如可以是0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、3mg/ml、3.5mg/ml、4mg/ml、4.5mg/ml或5mg/ml，优选为3mg/ml。

优选地，步骤(3)中所述具有载氧能力的化合物的质量为5-60mg，例如可以是5mg、10mg、15mg、20mg、30mg、40mg、50mg或60mg，优选为50mg。

优选地，步骤(3)中所述超声的时间为10-40min，例如可以是10min、20min、30min或40min。

优选地，步骤(3)中所述超声的频率为80-120khz，例如可以是80khz、90khz、100khz、110khz或120khz。

优选地，步骤(3)中所述超声后，还包括将混合物过膜、超滤离心得到所述复合纳米粒子。

优选地，所述过膜为过孔径为100-300nm的聚合物滤膜，例如可以是100nm、150nm、200nm、250nm或300nm，优选为200nm。

优选地，所述超滤离心为使用超滤离心管进行离心。

优选地，所述超滤离心管的分子截留量为80-120kd，例如可以是80kd、90kd、100kd、110kd或120kd。

优选地，所述超滤离心的转速为10000-15000rpm，例如可以是10000rpm、11000rpm、12000rpm、13000rpm、14000rpm或15000rpm。

优选地，所述超滤离心的时间为30-50min，例如可以是30min、35min、40min、45min或50min，优选为40min。

第三方面，本发明提供了如第一方面所述的复合纳米粒子在制备光动力治疗的制剂或生物造影剂中的应用。

本发明提供的复合纳米粒子因其自供氧性能，改善了肿瘤部位的缺氧环境；双芘分子的大吸收截面性能，增加了探测深度。本发明提供的纳米粒子不仅可以有效地提升光动力治疗的效果，应用于制备光动力治疗的制剂，还可以作为一种新型造影剂，应用于生物体成像领域。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供的复合纳米粒子粒径均一，分散均匀，粒径约为200nm且粒径可调；并且采用双芘分子与光敏剂孟加拉红组成双光子吸收材料，相比于现有方法中所使用的光敏剂，具有大吸收截面，能更有效地吸收光子，更深的探测深度，同时减少了对正常组织的损伤；荧光共振能量转移(fret)效应将能量转移给光敏剂，更有效杀伤细胞。

(2)本发明提供的复合纳米粒子包括具有载氧能力的化合物，使得自身有载氧功能，在肿瘤缺氧微环境中仍能有效提供充足氧气，大大提高了光动力治疗的效率；并且，磷脂化合物提供的靶向功能，使粒子更有效富集到肿瘤部位，提高治疗效率，减少正常损伤。另外，复合纳米粒子中由于双芘分子自身的荧光性，可以对肿瘤细胞进行荧光标记和定位，用于标记肿瘤细胞，实现诊疗一体化和精准靶向治疗。

附图说明

图1为实施例1得到的纳米粒子的tem图像。

图2为实施例1得到的纳米粒子在共聚焦显微镜观察到的宏观分布荧光图像。

图3为实施例1得到的纳米粒子与未处理的血红蛋白的园二色谱图。

图4为实施例1对得到的纳米粒子进行氧化还原的载氧性能的测试图。

图5为实施例1对得到的纳米粒子经照射后活性氧产生情况图谱。

图6a为实施例1得到的纳米粒子与同等浓度的光敏剂溶液于580nm波长处的荧光寿命曲线图。

图6b为实施例1得到的纳米粒子与同等浓度的双芘分子于520nm波长处荧光寿命曲线图。

图7a为实施例1对得到的纳米粒子进行细胞内吞后，细胞核的共聚焦图。

图7b为实施例1对得到的纳米粒子进行细胞内吞后，内吞进细胞的纳米粒子的共聚焦图。

图7c为实施例1对得到的纳米粒子进行细胞内吞后，细胞膜的共聚焦图。

图7d为实施例1对得到的纳米粒子进行细胞内吞后，细胞核、细胞膜、纳米粒子叠加后的共聚焦图。

图8为实施例1得到的纳米粒子的单光子毒性分析，分别为纳米粒子的暗毒性，纳米粒子还原态的光毒性和氧化态纳米粒子的光毒性结果图。

图9a为对照组细胞在800nm处的双光子毒性分析结果图。

图9b为不含血红蛋白的纳米粒子在800nm处的双光子毒性分析结果图。

图9c为实施例1得到的纳米粒子在800nm处的双光子毒性分析结果图。

图10为实施例1得到的纳米粒子在活体中不同时间段的富集效果图。

图11为实施例1得到的纳米粒子在活体中的抗肿瘤效果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

本实施例通过如下步骤制备具有载氧和双光子吸收功能的复合纳米粒子：

(1)取肉豆蔻酰磷脂酰胆碱与二硬脂酞基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸的混合物共20g，其质量比为30:1，加入甲醇和氯仿溶解。置于旋转蒸发仪旋蒸40min，真空干燥4h，加入1ml水溶液，于37℃水浴中水化1h。取水化后的溶液过200nm滤膜20次，得磷脂化合物纳米微球分散液。

(2)将溶解于二甲基亚砜溶剂中的双芘溶液中加入水溶液，双芘溶液的浓度为5mm，加入的体积比为1:10，混合均匀后，放于超声中超声30min，得到双芘微球分散液；

(3)将步骤(2)中的双芘微球分散液中加入3mg/ml的孟加拉红溶液1.5ml，加入血红蛋白50mg，置于超声仪中，超声频率为100khz。边超声边进行滴加步骤(1)中的磷脂球溶液共300μl，超声时间为30min。超声后取所得溶液过200nm滤膜，100kd超滤离心管离心，得到具有载氧和双光子吸收功能的复合纳米粒子。

(1)微观结构及分散性测试

将上述所得纳米粒子溶液超声分散均匀后滴于铜网，待其干燥后用磷钨酸溶液进行负染，之后用水冲洗多余的磷钨酸溶液，干燥后置于透射电子显微镜(jem-1011)下进行观测。取所得粒子于干净玻璃片上干燥后，在共聚焦显微镜下进行观测。

结果如图1和图2所示。由图1可观测到所得纳米粒子分散均匀，粒径为200nm左右，形貌均一。由图2可观测粒子分散性很好，且分布均匀。

(2)园二色谱测试

将所得粒子的溶液与血红蛋白的溶液稀释，置于园二色谱仪中进行结构测试。测试波长为200-260nm，狭缝宽度为0.5nm。

结果如图3所示。图3显示粒子溶液与原血红蛋白溶液具有相同的结构，表明粒子中蛋白结构不受影响。

(3)载氧释氧性能测试

取所得纳米粒子溶液2ml，加入还原剂抗坏血酸20mg，连二亚硫酸钠1.5mg。之后向溶液中通入n21h，用紫外分光光度计进行测试分析，并与未处理之前的峰位进行比较。之后将还原的纳米粒子中通入o21h，同样用紫外分光光度计进行观测峰位变化。

由图4可知，粒子展现良好的载氧释氧性能。

(4)fret效应测试

荧光寿命曲线通过装有455nmled光源的nanolog-tcspc仪器检测。所得纳米粒子溶液，与含有相同浓度双芘溶液在520nm波长处检测。与此同时，所得纳米粒子溶液与含有相同浓度光敏剂溶液在580nm波长处进行测试。

图5显示，在520nm处，粒子中双芘分子的荧光寿命被缩短，而在580nm处，粒子中光敏剂的荧光寿命被延长，这表明粒子具有良好的共振能量转移效果。

(5)活性氧产生能力测试

取所得纳米粒子溶液1.5ml，加入abda溶液(活性氧检测试剂，1×10^-2m)25μl，与溶液共混10min,用带有480nm滤光片的氙灯照射不同时间间隔，后用shimadzu-2600紫外分光光度计测定溶液的紫外光谱，看400nm处的峰值变化，对应产生活性氧的情况。活性氧产生，峰值下降。

结果如图6a和图6b所示，图6a和图6b可知，在激光照射下，粒子有活性氧产生。

(6)细胞内吞实验

mcf-7细胞于共聚焦培养皿中培养24h，取所得纳米粒子溶液200μl加入细胞培养液中共培养5h，后用pbs溶液进行清洗2遍，除掉未吞入的纳米粒子。分别加入10μlhoechst33342细胞核染色剂和alexa488细胞膜染色剂，染色10min后，于共聚焦显微镜下进行胞吞效果观察。

结果如图7a、图7b、图7c和图7d所示。由此4幅图可知，细胞内吞粒子良好，细胞核之外，细胞膜之内充满了纳米粒子，效果显著。

(7)细胞毒性测试

纳米粒子的细胞毒性测试为单光子毒性测试和双光子毒性测试。单光子毒性测试粒子为氧化态纳米粒子和还原态纳米粒子，其中氧化态纳米粒子进行暗毒性测试，于96孔板中进行。首先将mcf-7细胞以1×10⁴个/孔的浓度种于96孔板，rpmi1640培养液中加入10％的血清，在5％二氧化碳培养箱中培养。细胞孵育24h后，弃掉培养基，加入不同浓度的培养液配置的药物，药物孵育6h后，带有480nm滤光片的氙灯(100w)照射10min，继续孵育18个小时。pbs洗两遍，每孔加入10μlcck-8和100μl1640培养液。37℃孵育1.5h。酶标仪(tecaninfinitem200)450nm处读数。暗毒性不光照测试。

纳米粒子的双光子毒性测试方法如下：mcf-7细胞种于共聚焦培养皿，37℃培养24h。分别加入200μl以上所述合成的纳米粒子和同样方法合成的不含血红蛋白的纳米粒子，对照组加入培养基正常培养，共培养8h，pbs洗两次加入20μlcalcein-am活细胞染色试剂和10μlpi死细胞染色试剂。800nm双光子激光器照射20min，继续培养10h。共聚焦图像于488nm和559nm处采集。

测试结果如图8、图9a、图9b和图9c所示。图8可见氧化态的纳米暗毒性很低，还原态的纳米粒子呈现的光毒性远低于氧化态的纳米粒子。通过图9a、图9b和图9c对比显示，双光子毒性效果显示含有血红蛋白的纳米粒子，其光毒性远好于不含血红蛋白粒子。证明了以上合成纳米粒子的携氧性能和很强的细胞杀伤作用。

(8)纳米粒子的体内分布和抗肿瘤效果检测

取以上所得纳米粒子200μl，尾静脉注射于18-22gbalb/c裸鼠体内，经过不同时间间隔(1h、3h、6h、9h)处死，监测体内纳米粒子的富集情况。

18-22gbalb/c裸鼠皮下注射mcf-7细胞1×10⁶，待肿瘤直径长至4-6mm时，分别于第1、4、8天，尾静脉注射200μl以上所述纳米粒子，于6h后进行双光子激光照射肿瘤部位。照射强度为400mw，光斑大小为3.5mm，每次的照射时间为8min。另分别设置对照组(无激光，无药物)、激光组(只有激光，无药物)和不含血红蛋白粒子的药物组进行比较研究抗肿瘤效果。

结果如图10和图11所示。如图10所示，纳米粒子于注射6h后在肿瘤部位富集明显，另有少量药物在肝脏富集。如图11所示，纳米粒子注射光照后，含有血红蛋白粒子组的小鼠肿瘤明显小于对照组以及其他组。不含血红蛋白的药物组肿瘤体积较对照组和激光组有减小，但效果并不明显。由以上，含有血红蛋白的纳米粒子表现出良好的肿瘤富集效果和抗肿瘤效果。

实施例2

本实施例通过如下步骤制备具有载氧和双光子吸收功能的复合纳米粒子：

与实施例1的不同之处在于，肉豆蔻酰磷脂酰胆碱与二硬脂酞基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸的质量比为20:1，实施例2得到具有双光子吸收功能的载氧磷脂纳米粒子。

实施例3

本实施例通过如下步骤制备具有载氧和双光子吸收功能的复合纳米粒子：

与实施例1的不同之处在于，旋转蒸发仪旋蒸时间为60min，真空干燥12h，取水化后的溶液过200nm滤膜15次，实施例3得到具有双光子吸收功能的载氧磷脂纳米粒子。

实施例4

本实施例通过如下步骤制备具有载氧和双光子吸收功能的复合纳米粒子：

与实施例1的不同之处在于，磷脂溶液的水化时间为1.5h，双芘微球分散液中加入1.5mg/ml的孟加拉红溶液，加入血红蛋白30mg，实施例4得到具有双光子吸收功能的载氧磷脂纳米粒子。

实施例5

(1)取1,2-二油酰基羟丙基-3-n,n,n-三甲基氯与胆固醇的混合物共20g，其质量比为30:1，加入甲醇和氯仿溶解。置于旋转蒸发仪旋蒸20min，真空干燥1h，加入1ml水溶液，于37℃水浴中水化0.5h。取水化后的溶液过100nm滤膜2次，得磷脂化合物纳米微球分散液。

(2)将溶解于二甲基亚砜溶剂中的双芘溶液中加入水溶液，双芘溶液的浓度为5mm，加入的体积比为1:10，混合均匀后，放于超声中超声15min，得到双芘微球分散液；

(3)将步骤(2)中的双芘微球分散液中加入0.5mg/ml的孟加拉红溶液9ml，加入血红蛋白5mg，置于超声仪中，超声频率为100khz。边超声边进行滴加步骤(1)中的磷脂球溶液共300μl，超声时间为30min。超声后取所得溶液过100nm滤膜，80kd超滤离心管离心，得到具有载氧和双光子吸收功能的复合纳米粒子。

实施例6

(1)取二肉豆蔻酰磷脂酰甘油与二油酰磷脂酰乙醇胺的混合物共20g，其质量比为30:1，加入甲醇和氯仿溶解。置于旋转蒸发仪旋蒸60min，真空干燥24h，加入1ml水溶液，于37℃水浴中水化3h。取水化后的溶液过400nm滤膜30次，得磷脂化合物纳米微球分散液。

(2)将溶解于二甲基亚砜溶剂中的双芘溶液中加入水溶液，双芘溶液的浓度为1mm，加入的体积比为1:10，混合均匀后，放于超声中超声60min，得到双芘微球分散液；

(3)将步骤(2)中的双芘微球分散液中加入5mg/ml的孟加拉红溶液0.9ml，加入血红蛋白60mg，置于超声仪中，超声频率为100khz。边超声边进行滴加步骤(1)中的磷脂球溶液共300μl，超声时间为30min。超声后取所得溶液过300nm滤膜，120kd超滤离心管离心，得到具有载氧和双光子吸收功能的复合纳米粒子。

对比例1

本对比例与实施例1的区别在于，本对比例使用的光敏剂为吲哚菁绿衍生物，其余组分、组分含量与制备方法均与实施例1相同，制备得到复合纳米粒子。

本对比例制备得到的复合纳米粒子测试可知，由于双芘分子的荧光图谱和吲哚箐绿衍生物紫外图谱标准化后重叠面积较小，纳米粒子内很难产生fret效应，抗肿瘤效果及探测深度均降低。

对比例2

本对比例与实施例1的区别在于，本对比例未使用双芘分子，其余组分、组分含量与制备方法均与实施例1相同，制备得到复合纳米粒子。

本对比例制备得到的复合纳米粒子测试可知，此粒子不具备双光子所产生的fret效应，不能达到更深的探测深度，治疗效率较低。

对比例3

本对比例与实施例1的区别在于，本对比例中双芘分子与光敏剂的质量比为1:0.7，其余组分、组分含量与制备方法均与实施例1相同，制备得到复合纳米粒子。

对比例4

本对比例与实施例1的区别在于，本对比例中双芘分子与光敏剂的质量比为1:34，其余组分、组分含量与制备方法均与实施例1相同，制备得到复合纳米粒子。

由对比例3和对比例4制备得到的复合纳米粒子测试可知，光敏剂减少，活性氧产生量降低，影响抗肿瘤效果；双芘分子减少，双光子吸收减少，影响抗肿瘤效果，同时影响粒子探测深度。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的复合纳米粒子及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。