绿豆壳发酵产物及其应用的制作方法

本发明关于一种绿豆壳发酵产物及其应用，其中该绿豆壳发酵产物是通过以绿豆壳或绿豆壳萃取液在植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）存在下进行发酵所提供，且该发酵产物可用于预防高血压、降血压、辅助调节血压、预防高血脂、降血脂、辅助调节血脂、预防高血糖、降血糖、调节血糖、预防心血管疾病、治疗心血管疾病、预防糖尿病及治疗糖尿病；该发酵产物也可用于提升nos3基因表现、降低srebp-1c基因表现、降低scd1基因表现及提升glut4蛋白于细胞膜上的含量。

背景技术：

高血压是指动脉血液对于血管的压力过高。大多情况下，若非测量血压，高血压并没有明显症状，让人难以察觉，故有沉默杀手的称号。根据世界高血压联盟（worldhypertensionleague，whl）2010年的估计，全球有高达约18%人口的死因与高血压相关。

高血脂是指血液中的胆固醇、三酸甘油脂等脂肪含量过高。当血液中的脂肪含量过高，脂肪容易堆积在血管壁上，使血管通道逐渐变狭窄、形成动脉硬化，甚至形成血栓、造成血管阻塞，进而引起心绞痛、心肌梗塞、脑出血、中风等心血管疾病。

至于血糖升高的原因，主要是因为食物养份的摄取，食物进入肠胃道后会被分解、吸收，而被分解出的葡萄糖会进入血液当中，使血液中的葡萄糖浓度提高。正常情形下，胰脏会分泌胰岛素以促进血液中的葡萄糖（即，血糖）进入细胞，使血糖浓度逐渐下降，回到正常值。然而，在胰岛素分泌不足或细胞对于胰岛素产生抗性的情况下，血糖浓度的下降速度可能会过于缓慢、甚至一直维持在高浓度的状态，此即一般所谓的高血糖。高血糖若未受到有效控制，则容易演变成糖尿病。

高血压、高血脂及高血糖统称“三高”。研究指出，三高患者罹患糖尿病、肾脏病等慢性疾病以及发生心肌梗塞、中风等急性心血管疾病的机率，较一般人高出许多。常有患者同时罹患三高中任意两项、甚至同时患有三种的情况发生，此对患者健康造成加倍威胁。目前三高患者的治疗多以药物服用为主，但通常只能达到控制效果、无法根治，因此大多数的患者需长期、甚至终生服药，尤其是同时罹患三高的患者，为了稳定维持血压、血脂及血糖的平衡，其每日需服用的药物可能不只一种。然而，各种药物所需遵守的注意事项不同、且可能产生不同的副作用，故同时服用多种药物的情形将严重影响患者的生活质量。因此，业界仍持续开发可更便利且有效地预防、治疗或调节高血压、高血脂及高血糖的药物或方法。

已知，nos3基因的表现低下、srebp-1c基因的过度表现、scd1基因的过度表现及／或glut4蛋白于细胞膜上的含量过低会导致高血压、高血脂、高血糖、心血管疾病及／或糖尿病的发生。本申请发明人研究发现，一种通过以绿豆壳或绿豆壳萃取液在植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）存在下进行发酵所提供的绿豆壳发酵产物，该绿豆壳发酵产物具有提升nos3基因表现、降低srebp-1c基因表现、降低scd1基因表现以及提升glut4蛋白于细胞膜上的含量的效果，故可用于预防高血压、降血压、辅助调节血压、预防高血脂、降血脂、辅助调节血脂、预防高血糖、降血糖、调节血糖、预防心血管疾病、治疗心血管疾病、预防糖尿病及／或治疗糖尿病。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于提供一种绿豆壳发酵产物，其是通过以绿豆壳在植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）存在下进行发酵所提供。较佳地，该发酵是在一溶剂存在下进行。或者，该绿豆壳发酵产物是以一溶剂萃取绿豆壳所提供的萃取液，在植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）存在下进行发酵所提供。较佳地，前述溶剂是水。

本发明的另一个目的在于提供一种使用如上述的绿豆壳发酵产物于制备一医药组合物的用途，其中该医药组合物是用于以下的至少一种：预防高血压、降血压、预防高血脂、降血脂、预防高血糖、降血糖、预防心血管疾病、治疗心血管疾病、预防糖尿病及治疗糖尿病。较佳地，该医药组合物是用于改善胰岛素抗性。较佳地，该心血管疾病是心肌梗塞及左心室功能缺损的至少一种。较佳地，该医药组合物呈一选自以下群组的剂型：口服、经皮投予及注射。

本发明的再一个目的在于提供一种使用如上述的绿豆壳发酵产物于以下的至少一种的用途：用于调节血糖、辅助调节血压及辅助调节血脂。较佳地，该绿豆壳发酵产物以口服的方式使用。

本发明的又一个目的在于提供一种使用如上述的绿豆壳发酵产物于制备一医药组合物的用途，其中该医药组合物是用于以下的至少一种：提升nos3基因表现、降低srebp-1c基因表现、降低scd1基因表现及提升glut4蛋白于细胞膜上的含量。较佳地，该医药组合物呈一选自以下群组的剂型：口服、经皮投予及注射。

本发明的又一个目的在于提供一种用于预防高血压、降血压、预防高血脂、降血脂、预防高血糖、降血糖、预防心血管疾病、治疗心血管疾病、预防糖尿病及／或治疗糖尿病的医药组合物，其包含一有效量的如上述的绿豆壳发酵产物。较佳地，该医药组合物是用于改善胰岛素抗性。较佳地，该心血管疾病是心肌梗塞及左心室功能缺损的至少一种。较佳地，该医药组合物呈一选自以下群组的剂型：口服、经皮投予及注射。

本发明的又一个目的在于提供一种调节血糖、辅助调节血压及／或辅助调节血脂的食品组合物，其包含一有效量的如上述的绿豆壳发酵产物。较佳地，该食品组合物是一健康食品、保健食品、机能性食品、营养补充品或特殊营养食品。

本发明的又一个目的在于提供一种提升nos3基因表现、降低srebp-1c基因表现、降低scd1基因表现及／或提升glut4蛋白于细胞膜上的含量的医药组合物，其包含一有效量的如上述的绿豆壳发酵产物。较佳地，该医药组合物呈一选自以下群组的剂型：口服、经皮投予及注射。

本发明的又一个目的在于提供一种预防高血压、降血压、辅助调节血压、预防高血脂、降血脂、辅助调节血脂、预防高血糖、降血糖、调节血糖、预防心血管疾病、治疗心血管疾病、预防糖尿病及治疗糖尿病的方法，其包含对一有需要的个体投予一有效量的如上述的绿豆壳发酵产物，其中该绿豆壳发酵产物可以上述医药组合物或食品组合物的形式投予至该有需要的个体。较佳地，该方法是用于改善胰岛素抗性。较佳地，该心血管疾病是心肌梗塞及左心室功能缺损的至少一种。

本发明的又一个目的在于提供一种提升nos3基因表现、降低srebp-1c基因表现、降低scd1基因表现及／或提升glut4蛋白于细胞膜上的含量的方法，其包含对一有需要的个体投予一有效量的如上述的绿豆壳发酵产物，其中该绿豆壳发酵产物可以上述医药组合物的形式投予至该有需要的个体。

本发明的详细技术内容及部分具体实施方案，将描述于以下内容中，以供本发明所属技术领域中普通技术人员据以明了本发明的特征。

附图说明

图1显示本发明绿豆壳发酵产物对nos3基因表现量的影响，其中，“控制组”的huvec细胞是于不含绿豆壳发酵产物及绿豆壳萃取物的培养液中培养48小时，“发酵产物组”及“萃取物组”」的huvec细胞则是分别于含有绿豆壳发酵产物或绿豆壳萃取物的培养液中培养48小时；

图2显示本发明绿豆壳发酵产物对srebp-1c基因及scd1基因的表现量的影响，其中，“控制组”的hepg2细胞是于不含绿豆壳发酵产物及绿豆壳萃取物的培养液中培养48小时，“发酵产物组”及“萃取物组”的hepg2细胞则是分别于含有绿豆壳发酵产物或绿豆壳萃取物的培养液中培养48小时；以及

图3显示本发明绿豆壳发酵产物对glut4蛋白于细胞膜上的含量的影响，其中，“空白组”的hepg2细胞是于不含胰岛素、绿豆壳发酵产物及绿豆壳萃取物的培养液中培养48小时，“控制组”的hepg2细胞是先于不含胰岛素、绿豆壳发酵产物及绿豆壳萃取物的培养液中培养24小时，再于含有胰岛素的培养液中培养24小时，“萃取物组”及“发酵产物组”的hepg2细胞则是先分别于含有绿豆壳萃取物及绿豆壳发酵产物的培养液中培养24小时，再于含有胰岛素的培养液中培养24小时。

具体实施方式

以下将描述根据本发明的部分具体实施方案；但是，在不背离本发明精神下，本发明还可以多种不同形式的方案来实践，不应将本发明保护范围解释为限于说明书所具体陈述的内容。

除非文中有另外说明，于本说明书中（尤其是在权利要求书中）所使用的“一”、“该”及类似用语应理解为包含单数及复数形式；所谓“治疗”，不应被解释为治疗一个体直至完全恢复，而应包括将一个体的疾病进展或症状维持在一实质上静态的程度、增加一个体的恢复速率、改善一具体病况的严重性或提高一患者的生命质量；所谓“预防”是指抑制或防止一具体病况的发作或维持敏感个体的良好健康状态或建立该个体对疾病的耐受性；所谓“调节”是指正向调控（包括诱导、刺激、及增强）或负向调控（包括抑制、及减弱）以使个体朝向所述生理机能的正常状态；所谓“个体”是指哺乳动物，该哺乳动物可以是人类或非人动物（例如：狗、猫）。

如上述，已知nos3基因表现低下与高血压、以及心肌梗塞、左心室功能缺损等心血管疾病的发生相关。因此，若可有效提升nos3基因表现，即可达到预防高血压、降血压、辅助调节血压以及治疗或预防心血管疾病（包含心肌梗塞及左心室功能缺损）的目的。前述可参见例如：nos3genotype–dependentcorrelationbetweenbloodpressureandphysicalactivity.hypertension.41:355-360(2003)、及depletionofcirculatingbloodnos3increasesseverityofmyocardialinfarctionandleftventriculardysfunction.basicrescardiol.109(1):398(2014)，这些文献的全文并于此处以供参考。

已知，srebp-1c基因的表现量上升会导致脂肪酸合成增加，过量表现时会造成高血脂。因此，若可有效降低srebp-1c基因表现，即可达到预防高血脂、降血脂以及辅助调节血脂的目的。前述可参见例如：add1/srebp-1cisrequiredintheactivationofhepaticlipogenicgeneexpressionbyglucose.molecularandcellularbiology.19(5):3760-3768(1999)，该文献的全文并于此处以供参考。

研究显示，scd1基因的缺失可避免产生高血脂症、减少肝脏的三酸甘油酯累积以及提升血浆中的高密度脂蛋白胆固醇含量。因此，若可有效降低scd1基因表现，即可达到预防高血脂、降血脂以及辅助调节血脂的目的。前述可参见例如：stearoyl-coenzymeadesaturase1deficiencyprotectsagainsthypertriglyceridemiaandincreasesplasmahigh-densitylipoproteincholesterolinducedbyliverxreceptoractivation.americansocietyformicrobiology.26(18):6786-6798(2006)，该文献的全文并于此处以供参考。

glut4蛋白则是一种葡萄糖载体蛋白（glucosetransporter），当glut4蛋白从细胞质转位至细胞膜上，将可促进细胞对葡萄糖的吸收，因此，若glut4蛋白于细胞膜上的含量提升，将有助于细胞摄取血液中的葡萄糖以及辅助改善胰岛素抗性，达到预防高血糖、降血糖、调节血糖、治疗或预防糖尿病（尤其是第二型糖尿病）的目的。前述可参见例如：regulatedtransportoftheglucosetransporterglut4.molecularcellbiology.3:267-277(2002)、及glut4isreducedinslowmusclefibersoftype2diabeticpatients.diabetes.50:1324-1329(2001)，这些文献的全文并于此处以供参考。

本申请发明人研究发现，通过以绿豆壳或绿豆壳萃取液在植物乳杆菌存在下进行发酵所提供的绿豆壳发酵产物，可有效提升细胞的nos3基因表现、降低细胞的srebp-1c基因表现、降低细胞的scd1基因表现以及提升glut4蛋白于细胞膜上的含量。因此，本发明关于一新颖的绿豆壳发酵产物的提供以及该绿豆壳发酵产物的相关应用，包括：使用该绿豆壳发酵产物于调节血糖、辅助调节血压、辅助调节血脂以及使用该绿豆壳发酵产物于制备一医药组合物、提供一包含有效量的该绿豆壳发酵产物的食品组合物或医药组合物以及对一有需要的个体投予一有效量的前述食品组合物或医药组合物的方法。其中，根据本发明所提供的绿豆壳发酵产物是通过以绿豆壳或绿豆壳萃取液在植物乳杆菌存在下进行发酵所提供；根据本发明所提供的食品组合物可用于调节血糖、辅助调节血压及∕或辅助调节血脂；且根据本发明所提供的医药组合物可用于预防高血压、降血压、预防高血脂、降血脂、预防高血糖、降血糖、预防心血管疾病、治疗心血管疾病、预防糖尿病（尤其是第二型糖尿病）及治疗糖尿病（尤其是第二型糖尿病）。此外，根据本发明所提供的医药组合物及方法也可用于提升nos3基因表现、降低srebp-1c基因表现、降低scd1基因表现及／或提升glut4蛋白于细胞膜上的含量。

本发明的绿豆壳发酵产物是通过使用植物乳杆菌对绿豆壳或绿豆壳萃取液进行发酵而获得。举例言之，但不以此为限，该绿豆壳发酵产物可通过将绿豆壳均匀分散于一溶剂中以提供一混和物，再于该混合物中接种一植物乳杆菌并进行发酵反应而提供；或者，可通过先以一溶剂萃取绿豆壳以提供一萃取液，而后于该萃取液中接种一植物乳杆菌并进行发酵反应而提供。于本发明部分具体实施方案中，所采用的溶剂可以是一极性溶剂，例如：水、醇（例如c1-c4醇）或前述的组合。较佳地，使用水、乙醇或其组合作为该溶剂。一般而言，溶剂的用量并无特殊限制，只要可以使绿豆壳均匀分散即可。举例言之，可采用溶剂：绿豆壳＝20：1的重量比用量。

此外，可根据需要于进行上述萃取或混合步骤之时，辅以例如加温、冷却、搅拌、超音波等其它操作。举例言之，可于75至95°c的加温下进行该混合或萃取步骤。于本发明的一具体实施方案中，以水作为溶剂，且以20：1（水：绿豆壳）的重量比混合水与绿豆壳，并于85°c下对所得到的混合物进行水萃历时60分钟以提供一粗萃物，或进一步通过固液分离操作而提供一绿豆壳萃取液，供后续的发酵步骤使用。

于上述发酵步骤中，该植物乳杆菌的接种量并无特殊限制。举例言之，以使用绿豆壳萃取液为发酵原料为例，可采用1000：1（发酵原料：植物乳杆菌菌粉）的重量比接种植物乳杆菌后进行发酵。此外，于本发明部分具体实施方案中，于约25°c至35°c下，以植物乳杆菌对绿豆壳萃取液进行发酵，历时约48至72小时。

于上述萃取步骤或发酵步骤完成之后，皆可根据需要进行例如固液分离（例如：过滤、离心）、减压浓缩、干燥（例如：热风干燥、冷冻干燥、喷雾干燥）及灭菌等操作，以提升萃取液或发酵产物的使用便利性。

根据本发明所提供的医药组合物可通过全身或局部投药，且可通过各种药物传递系统（drugdeliverysystem，dds）进行传递，包括口服药物传递系统（oraldrugdeliverysystem）、经皮药物传递系统（transdermaldrugdeliverysystem）等。举例言之，但不以此为限，根据本发明所提供的医药组合物可以通过微脂体（liposome）、微胶囊（microcapsule）、奈米微粒（nanoparticle）、微针（microneedle）等系统进行传递，以达到提高生物利用率、控制药物释放速度、针对病灶精准投药、减少药物副作用等目的。

根据本发明所提供的医药组合物可呈任何适宜的形式，并无特殊限制，可根据所需要的用途而呈对应的适宜剂型。举例言之，但不以此为限，根据本发明所提供的医药组合物可呈一口服、经皮投予或注射（包含静脉注射、肌肉注射、皮下注射等）的剂型，以施用至有需要的个体。根据使用形式及用途而定，可选用适宜的载剂以提供该医药组合物或食品组合物，其中，该载剂的例子包括，但不限于，赋形剂、稀释剂、辅助剂、安定剂、吸收延迟剂、崩散剂、增溶剂、乳化剂、抗氧化剂、黏合剂、结合剂、增黏剂、分散剂、悬浮化剂、润滑剂及吸湿剂。

以适于口服的剂型为例，可于根据本发明所提供的医药组合物中含有任何不会不利影响活性成分（即，绿豆壳萃取液）的所需要效益的医药上可接受的载剂，例如：水、食盐水、葡萄糖（dextrose）、甘油、乙醇或其类似物、油（例如橄榄油、蓖麻油、棉籽油、花生油、玉米油及胚芽油）、淀粉、聚乙二醇、高岭土（kaolinite）、膨润土（bentonite）、柠檬酸钠、明胶、琼脂、羧甲基纤维素、阿拉伯胶、海藻酸及其盐、单硬脂酸甘油酯（glycerylmonostearate）、硬脂酸钙（calciumstearate）及前述的组合。可利用任何适宜的方法，将该医药组合物以适于口服投药的剂型提供，例如以锭剂（例如糖衣锭）、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、流浸膏剂、溶液剂、糖浆剂、悬液剂、酊剂等形式提供。

有关经皮投予的医药组合物，也可于其中含有任何不会不利影响活性成分（即，绿豆壳萃取液）的所需要效益的医药上可接受的载剂，例如：水、矿物油及透明质酸。可利用任何适宜的方法，将该医药组合物以适于经皮投予的剂型提供，例如以贴片（例如微针贴片）等形式提供，但不以此为限。

至于适于注射的针剂或点滴剂，则可于根据本发明所提供的医药组合物中含有一种或多种例如等张溶液、盐类缓冲液（如磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液）、增溶剂、乳化剂、5%糖溶液以及其他载剂等成分，以静脉输注液、乳剂静脉输注液、干粉注射剂、悬液注射剂或干粉悬液注射剂等剂型提供该医药组合物。或者，可将该医药组合物制备成一注射前固体，并于投予至有需要的个体之前，将该注射前固体溶于其他溶液或悬浮液中或将其乳化，以提供所需要的注射剂。

根据本发明所提供的医药组合物可以一日一次、一日多次或多日一次等不同投药频率施用，可根据投予个体的需求、年龄、体重及健康况状而异。于该医药组合物中，可根据实际应用需求，调整绿豆壳发酵产物于组合物中的含量。此外，该医药组合物可根据需要另外含一种或多种其他活性成分（例如降血压剂、降血脂剂、降血糖剂等），或者与含该一种或多种其他活性成分的药物并用，以进一步加强该医药组合物的功效或增加制剂配方的运用灵活性与调配度，只要该其他活性成分对本发明活性成分（即，绿豆壳发酵产物）的效益没有不利的影响即可。

根据需要地，可于根据本发明所提供的医药组合物或食品组合物中另外含有适宜用量的添加剂，例如可提高该医药组合物或食品组合物于服用时的口适感及视觉感受的调味剂、调色剂、着色剂等，以及可改善该医药组合物或食品组合物的稳定性及储存性的缓冲剂、保存剂、防腐剂、抗菌剂、抗真菌剂等。

根据本发明所提供的食品组合物可以是健康食品、保健食品、机能性食品、营养补充品或特殊营养食品，且可制成例如乳制品、肉类加工品、面包类、面食品、饼干、口含锭、胶囊、果汁类、茶类、运动饮料、营养饮料等产品，但不以此为限。较佳地，根据本发明的食品组合物以健康食品的形式提供。

根据本发明所提供的健康食品、保健食品、机能性食品、营养补充品及特殊营养食品可以一日一次、一日多次或多日一次等不同频率食用，可根据投予个体的年龄、体重及健康状况而异。也可针对特定族群调整根据本发明所提供的健康食品、保健食品、机能性食品、营养补充品及特殊营养食品中绿豆壳发酵产物的含量，例如，调整至每日应服用的量。

针对根据本发明所提供的健康食品、保健食品、机能性食品、营养补充食品及／或特殊营养食品，可于其外包装上标示建议使用量、特定族群（例如高血压患者、高血糖患者、高血脂患者、心脏病患者、肾脏病患者、中风患者、孕妇等）的使用标准及条件或与其他食品或医药共同服用的建议事项，以利用户在无医师、药师或相关执事人员指导下自行服用而无安全疑虑。

于根据本发明的使用绿豆壳发酵产物于调节血糖、辅助调节血压及∕或辅助调节血脂的用途中，所采用的绿豆壳发酵产物可以一食品组合物的形式提供。有关该食品组合物的投予方案、投予途径、投予形式、施用频率以及相关应用，如上述的说明。

本发明还提供一种用以预防高血压、降血压、辅助调节血压、预防高血脂、降血脂、辅助调节血脂、预防高血糖、降血糖、调节血糖、预防心血管疾病、治疗心血管疾病、预防糖尿病及治疗糖尿病的至少一种的方法，其包含对一有需要的个体投予一有效量的绿豆壳发酵产物。前述有需要的个体是指血压异常者、血脂异常者、血糖异常者、罹患心血管疾病的高风险群、罹患心血管疾病者、罹患糖尿病的高风险群或罹患糖尿病者。于前述方法中，所采用的绿豆壳发酵产物可以一医药组合物或食品组合物的形式提供。有关该医药组合物及食品组合物的投予方案、投予途径、投予形式、施用频率以及相关应用，也如上述的说明。

本发明另外提供一种提升nos3基因表现、降低srebp-1c基因表现、降低scd1基因表现及提升glut4蛋白于细胞膜上的含量的方法，其包含对一有需要的个体投予一有效量的绿豆壳发酵产物。前述有需要的个体是指nos3基因有缺失、突变或表现低下、srebp-1c基因过度表现、scd1基因过度表现或glut4蛋白于细胞膜上的含量低下的个体。于前述方法中，所采用的绿豆壳发酵产物可以一医药组合物的形式提供。有关该医药组合物的投予方案、投予途径、投予形式、施用频率以及相关应用，也如上述的说明。

现以下列实施例进一步例示说明本发明。其中这些实施例仅提供作为说明，而非用以限制本发明的保护范围。本发明保护范围如权利要求书所示。

实施例

制备实施例]

a.绿豆壳萃取物的制备

以脱壳机对绿豆（购自侨联食品加工厂股份有限公司）进行脱壳（温度不超过90℃）后，将绿豆壳碾碎以提供绿豆壳原料，并进行以下操作处理，以提供绿豆壳萃取物：

1.将绿豆壳原料与水均匀混和（绿豆壳原料与水的重量比为1：20），并于85°c下进行萃取，历时60分钟，以提供一粗萃液；

2.过滤该粗萃液，以提供一滤液（即，供[制备实施例b]使用的绿豆壳萃取液）；以及

3.对该滤液进行冷冻干燥，以提供一干燥物（即，供后续实施例1至3使用的绿豆壳萃取物）。

绿豆壳发酵产物的制备

对[制备实施例a]所提供的绿豆壳萃取液进行以下操作处理，以提供绿豆壳发酵产物：

1.于[制备实施例a]所提供的绿豆壳萃取液中以1000：1（绿豆壳萃取液：植物乳杆菌菌粉）的重量比接种植物乳杆菌（寄存于财团法人食品工业研究所，寄存编号：bcrc910760，寄存日期：2016年12月27日；以及，寄存于德国国家菌种保藏中心，寄存编号：dsm32451，寄存日期：2017年3月13日），接着于25℃~35℃下培养48小时，以提供一发酵液；

2.过滤该发酵液，以提供一滤液；以及

3.对该滤液进行冷冻干燥，以提供一干燥物（即，供后续实施例1至3使用的绿豆壳发酵产物）。

培养液的制备

将m200培养液（medium200；购自gibco公司，产品编号：m-200-500）及低血清生长补充剂（lowserumgrowthsupplement，lsgs；购自gibco公司）以体积比9：1（medium200：lsgs）的比例均匀混和，以提供一huvec培养液，供后续实施例使用。

细胞培养液的制备

将杜氏改良依格尔培养液（dulbecco'smodifiedeagle'smedium，dmem；购自gibco公司）及胎牛血清（fetalbovineserum，fbs；购自gibco公司）以体积比9：1（dmem：fbs）的比例均匀混和，以提供一hepg2细胞培养液，供后续实施例使用。

实施例1：绿豆壳发酵产物于提升nos3基因表现的效果

取人类脐带静脉血内皮细胞（humanumbilicalveinendothelialcell，huvec；购自bcrc，产品编号：h-uv001），分成三组，并于37℃下分别以如下培养液进行培养，历时48小时：

1.控制组：[制备实施例c]所提供的huvec培养液；

2.萃取物组：同控制组，但每毫升培养液含有4毫克[制备实施例a]所提供的绿豆壳萃取物；以及

3.发酵产物组：同控制组，但每毫升培养液含有4毫克[制备实施例b]所提供的绿豆壳发酵产物。

分别收集上述各组细胞，以rna萃取套组（rnaextractionkit；购自geneaid公司）进行rna萃取，再以反转录酶套组（superscript®iiireversetranscriptase；购自invitrogen公司）将该rna反转录成cdna。其后，使用qpcr套组（kapacybrfastqpcrkits(2x)；购自kapabiosystems公司）与steponeplus系统（购自abi公司）对上述各组细胞中cdna进行qpcr，以检测各组细胞的nos3基因的表现量。

上述实验进行三次重复，将该三次重复的结果平均后，再以控制组的结果为基准（即，将控制组的基因表现设定为1倍），计算萃取物组与发酵产物组的基因相对表现量。结果示于图1。

由图1可知，相较于控制组，萃取物组细胞与发酵产物组细胞的nos3基因表现量皆明显较高，其中，发酵产物组细胞的nos3基因表现量又高于萃取物组细胞。前述结果显示，本发明绿豆壳发酵产物确实可有效提升nos3基因表现，且效果优于未经发酵的绿豆壳萃取物，故可用于预防高血压、降血压、辅助调节血压以及预防或治疗心血管疾病（包括心肌梗塞、及左心室功能缺损）。

实施例2：绿豆壳发酵产物于降低srebp-1c基因及scd1基因的表现的效果

取hepg2细胞（一种人类肝癌细胞株；购自atcc，产品编号：hb-8065™），分成三组，并于37℃下分别以如下培养液进行培养，历时48小时：

1.控制组：[制备实施例d]所提供的hepg2细胞培养液；

2.萃取物组：同控制组，但每毫升培养液含有4毫克[制备实施例a]所提供的绿豆壳萃取物；以及

3.发酵产物组：同控制组，但每毫升培养液含有4毫克[制备实施例b]所提供的绿豆壳发酵产物。

分别收集上述各组细胞，并比照实施例1的方式检测各组细胞的srebp-1c基因及scd1基因的表现量。结果示于图2。

由图2可知，相较于控制组，萃取物组细胞的srebp-1c基因及scd1基因的表现量明显较高。然而，相较于控制组，发酵产物组细胞的srebp-1c基因及scd1基因的表现量皆明显较低。前述结果显示，本发明绿豆壳发酵产物确实可有效降低srebp-1c的与scd1基因的表现量，故可用于预防高血脂、降血脂以及辅助调节血脂。

实施例3：绿豆壳发酵产物于提升glut4蛋白于细胞膜上含量的效果

于6孔盘的各孔中添加2毫升[制备实施例d]所提供的hepg2细胞培养液，再于各孔中加入1x10⁵个hepg2细胞。将6孔盘置于37℃下培养24小时后，将培养液换成含有1微莫耳浓度胰岛素（购自sigma公司，产品编号：i9278-5ml）的dmem，并继续培养72小时，以诱导细胞产生胰岛素抗性。其后，将细胞分成三组，分别进行以下处理：

1.空白组：将培养液换成新鲜的hepg2细胞培养液，继续培养48小时。

2.控制组：将培养液换成新鲜的hepg2细胞培养液，培养24小时后，再于培养液中加入0.5微莫耳浓度的胰岛素，继续培养24小时。

3.萃取物组：将培养液换成每毫升添加有4毫克[制备实施例a]所提供的绿豆壳萃取物的hepg2细胞培养液，培养24小时后，再将培养液换成含有0.5微莫耳浓度的胰岛素的hepg2细胞培养液，继续培养24小时。

4.发酵产物组：将培养液换成每毫升添加有4毫克[制备实施例b]所提供的绿豆壳发酵产物的hepg2细胞培养液，培养24小时后，再将培养液换成含有0.5微莫耳浓度的胰岛素的hepg2细胞培养液，继续培养24小时。

收集上述各组细胞，使用glut4抗体（购自invitrogen公司，产品编号：ma5-17176）以及流式细胞仪（购自bd公司；型号：accuri™c6plus）分析各组细胞的细胞膜上有表现glut4蛋白的比例。上述实验进行三次重复，将该三次重复的结果平均后，结果示于图3。

如图3所示，空白组及萃取物组的细胞的细胞膜上有表现glut4蛋白的比例并无明显差异。然而，相较于空白组，控制组及发酵产物组的细胞的细胞膜上有表现glut4蛋白的比例皆明显较高，其中，发酵产物组的比例又高于控制组。前述结果显示，本发明绿豆壳发酵产物可以促进hepg2细胞的细胞质中的glut4蛋白转位至细胞膜，可提高hepg2细胞对于胰岛素的敏感性，具有促进细胞摄取血液中的葡萄糖的效果。因此，本发明绿豆壳发酵产物可用于预防高血糖、降血糖、调节血糖、预防糖尿病以及治疗糖尿病。