本发明涉及一种丁酸梭菌微囊化活菌制剂的制备方法，属于微囊化技术领域。
背景技术：
益生菌是通过改善肠道微生态平衡，对动物产生有利影响的活性微生物。益生菌制剂凭借低毒、无残留、无耐药性、效果显著等诸多优点，成为了理想的抗生素替代方向。
丁酸梭菌是一种芽孢益生菌，兼具益生特性和芽孢杆菌抗逆性强的特性。丁酸梭菌代谢主产物为丁酸，丁酸可以帮助维持肠道上皮细胞的形态和功能，增强肠道屏障功能；丁酸梭菌产生的丁酸梭菌素(抗菌肽)可以显著抑制一些常见的肠道致病菌；丁酸梭菌还可以产生淀粉酶、纤维素酶以及各种维生素，为动物机体及其它益生菌提供营养物质。因此丁酸梭菌能够维持肠道微生态平衡，从而保持动物肠道健康，提高生产性能。
益生菌的活菌制剂是微生态学应用的一个热点，细菌在液体环境中由于自身代谢作用会很快死亡，到达肠道发挥功效需要抵抗胃液、肠液的消化作用，微囊化技术可以有效解决这些问题，帮助益生菌最大程度地发挥功效。微囊化技术是当今发展迅速，用途广泛而又比较成熟的一种技术。微胶囊是利用天然或合成的高分子材料对固体、液体或气体进行包封，形成粒径为1～1000μm的中空胶囊，可以保护不稳定的芯材，使其与环境隔离，因此可以提高其稳定性，延长芯材的贮存期限，而且可以起到定点释放的作用。
目前，对于高活菌量的微囊化活菌制剂的研究比较少，尤其是对于丁酸梭菌的微囊化活菌制剂的研究较少。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种丁酸梭菌微囊化活菌制剂的制备方法，该方法制备得到的活菌制剂中活菌数高，且性质稳定。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种丁酸梭菌微囊化活菌制剂的制备方法，包括如下步骤：
1)取丁酸梭菌的发酵液离心分离后，弃上清获得菌泥；
2)在所述菌泥中加入与发酵液等体积的无菌水，然后加入海藻糖、谷氨酰胺、阿拉伯胶和明胶；于36～40℃下，以100r/min～500r/min的速度搅拌10min～60min，喷雾干燥即得。
本发明中将丁酸梭菌发酵液离心后的菌泥中依次加入无菌水、海藻糖、谷氨酰胺、阿拉伯胶、明胶混合均匀，经喷雾干燥制得微囊，其中海藻糖作为保护剂；谷氨酰胺作为营养增强剂；阿拉伯胶和明胶用作微囊囊材；所制得的微囊化活菌制剂抗逆性强、稳定性好、活菌数目多。本发明中经过试验发现，上述的方法非常适合于丁酸梭菌，海藻糖、阿拉伯胶、明胶对于丁酸梭菌具有很好的稳定和保护作用。
本发明中通过试验发现，海藻糖、阿拉伯胶、明胶的用量过高或者过低对于微囊化活菌制剂产品的稳定性及活菌数目具有不好的影响。优选的，步骤2)中所述海藻糖、谷氨酰胺、阿拉伯胶、明胶的质量比为3～30g：0.1～3g：2～20g：0.5～10g。进一步优选的，所述海藻糖、谷氨酰胺、阿拉伯胶、明胶与所述发酵液的质量-体积比为：3～30g：0.1～3g：2～20g：0.5～10g：100ml。更为优选的，所述海藻糖、谷氨酰胺、阿拉伯胶、明胶与所述发酵液的质量-体积比为：6g：0.1g：3g：1g：100ml。
优选的，步骤2)中所述搅拌时温度为37℃。在该温度下混合体系比较稳定。
本发明中通过试验发现，搅拌速度为200r/min时，即检活菌数最高，且存活率最高，各项检测指标随着搅拌速度的增加呈现先上升后下降的趋势。因此优选的，步骤2)中所述搅拌的速度为200r/min。
本发明中通过试验发现，搅拌时间为30min时，各项检测指标最为理想。因此优选的，步骤2)中所述搅拌的时间30min。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例及试验例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。
微囊化活菌制剂的制备方法的实施例1
本实施例的微囊化活菌制剂的制备方法，包括如下步骤：
1)取丁酸梭菌的发酵液离心分离后，弃上清获得菌泥；
2)在所述菌泥中加入与发酵液等体积的无菌水，然后依次加入海藻糖、谷氨酰胺、阿拉伯胶、明胶；所述海藻糖、谷氨酰胺、阿拉伯胶、明胶与所述发酵液的质量-体积比为：6g：0.1g：3g：1g：100ml；于37℃下，以200r/min的速度搅拌30min，喷雾干燥即得。
试验例1阿拉伯胶用量对混悬液性能的影响
本试验例中所用丁酸梭菌发酵液为本公司生产得到的发酵液。
将丁酸梭菌发酵液进行离心之后，将菌泥与发酵液等体积的无菌水混合，然后加入海藻糖、谷氨酰胺、阿拉伯胶、明胶混合形成混悬液，其中海藻糖用量为5％，谷氨酰胺用量为0.1％，明胶用量为3％，搅拌速度为200r/min，37℃条件下混合30min，不同阿拉伯胶用量对混悬液物理稳定性影响如表1下。
表1不同阿拉伯胶用量对混悬液物理稳定性影响
结果显示：混悬液静置4h时，只有1％阿拉伯胶(即100ml发酵液对应的菌泥中加入1g阿拉伯胶)混悬液产生了少许沉淀，其他浓度的混悬液性质稳定，继续静置至12h时，各个浓度均产生了沉淀，结合成本和生产流程，阿拉伯胶用量为3％(即100ml发酵液对应的菌泥中加入3g阿拉伯胶)时完全可以满足生产需求，因此选择阿拉伯胶用量为3％。
试验例2明胶用量对混悬液性能的影响
选用3％阿拉伯胶与菌泥、发酵液等体积的无菌水、海藻糖和谷氨酰胺制备成混悬液，与试验例1相同，其中海藻糖用量为5％，谷氨酰胺用量为0.1％，然后再加入不同用量的明胶，搅拌速度为200r/min，37℃条件下混合30min，观察混悬液物理稳定性，结果如表2所示。
表2不同明胶用量对混悬液物理稳定性影响
试验结果表明，静置4h时，只有浓度为0.5％的明胶混悬液(即100ml发酵液对应菌泥中加入0.5g明胶)产生了少许沉淀，其他浓度下均保持稳定，静置12h时，都出现了沉淀，依然根据成本和生产流程，选择明胶用量为1％(即100ml发酵液对应菌泥中加入1g明胶)。
试验例3海藻糖用量对活菌数的影响
本试验例所用丁酸梭菌发酵液生产批次为802#20180915，活菌数为6.7×108cfu/ml。将发酵液离心后取菌泥，加入与发酵液等体积的无菌水，然后依次加入不同用量海藻糖、谷氨酰胺0.1％、阿拉伯胶3％、明胶1％，搅拌速度为200r/min，37℃条件下混合30min，进行喷雾干燥制得微囊化菌粉，分别在此时和常温存放三个月后进行活菌数检测，结果如表3所示。
表3不同用量的海藻糖对菌存活率影响
注：活菌数1为即检活菌数；活菌数2为常温放置3个月活菌数；质量收率为100ml发酵原液经喷雾所得到的菌粉质量；活菌收率为菌粉中活菌数与发酵原液中活菌数的比值；存活率为经过储存后菌粉活菌数与刚喷雾后菌粉活菌数的比值。
由试验结果可以看出：随着海藻糖用量的增加，即检活菌数呈增长趋势，在用量为6％时(即100ml发酵液对应菌泥中加入6g海藻糖)达到顶峰，之后下降。比较各种用量下喷雾得到的菌粉，经存放后存活率均保持在90％以上，而且海藻糖用量为6％时存活率最高，因此选择海藻糖用量为6％。
试验例4搅拌速度对活菌数的影响
本实施例所用丁酸梭菌发酵液生产批次为802#20180915，活菌数为6.7×108cfu/ml。将发酵液离心后取菌泥，加入与发酵液等体积的无菌水，然后依次加入海藻糖6％、谷氨酰胺0.1％、阿拉伯胶3％、明胶1％，混合时采用不同搅拌速度，37℃混合30min后进行喷雾干燥制得微囊化菌粉，分别在此时和常温存放三个月后进行活菌数检测，结果如表4所示。
表4不同搅拌速度对菌存活率影响
注：活菌数1为即检活菌数；活菌数2为常温放置3个月活菌数；质量收率为100ml发酵原液经喷雾所得到的菌粉质量；活菌收率为菌粉中活菌数与发酵原液中活菌数的比值；存活率为经过储存后菌粉活菌数与刚喷雾后菌粉活菌数的比值。
试验结果显示：搅拌速度为200r/min时，即检活菌数最高，且存活率最高，各项检测指标随着搅拌速度的增加呈现先上升后下降的趋势，原因可能是搅拌速度低时，物料混合均匀度欠佳，但是随着搅拌速度增加可能会对丁酸梭菌造成物理伤害，均可导致活菌数下降，因此选择最佳搅拌速度为200r/min。
试验例5搅拌时间对活菌数的影响
该实施例所用丁酸梭菌发酵液生产批次为802#20180915，活菌数为6.7×108cfu/ml。将发酵液离心后取菌泥，加入与发酵液等体积的无菌水，然后依次加入海藻糖6％、谷氨酰胺0.1％、阿拉伯胶3％、明胶1％，搅拌速度为200r/min，37℃条件下经不同时间混合后，进行喷雾干燥制得微囊化菌粉，分别在此时和常温存放三个月后进行活菌数检测，结果如表5所示。
表5不同搅拌时间对菌存活率影响
注：活菌数1为即检活菌数；活菌数2为常温放置3个月活菌数；质量收率为100ml发酵原液经喷雾所得到的菌粉质量；活菌收率为菌粉中活菌数与发酵原液中活菌数的比值；存活率为经过储存后菌粉活菌数与刚喷雾后菌粉活菌数的比值。
结果表明：搅拌时间为30min时，各项检测指标最为理想，各种搅拌时间下活菌数变化趋势及其原因与搅拌速度的影响相似，选择搅拌时间为30min。
试验例6产品质量情况
使用微囊化活菌制剂的制备方法实施例1制得的丁酸梭菌微囊化活菌制剂(未经存放)进行试验，经检测其中活菌数为1.6×1010cfu/g，芽孢数为1.4×1010cfu/g，用其进行产品质量评价，结果如表6所示。
表6产品质量检测情况
丁酸梭菌微囊化活菌制剂产品质量评价结果显示，其在胃液及肠液处理过程中依然能保持较高活菌数，对其发挥益生功能有重要作用。