专利名称：钙通道阻塞多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种在Agelenopsis aperta蜘蛛毒液中发现的多肽以及与该多肽具有大致相同的氨基酸顺序和活性的一类多肽。此类多肽及其药学上可接受的盐能够阻塞无脊椎动物和脊椎动物细胞(包括神经和肌肉细胞)的钙通道。本发明还涉及用此类多肽及其盐阻塞有机体细胞(如神经和肌肉细胞)的钙通道，以治疗哺乳动物由钙通道传递的疾病。另外，本发明还涉及含有该类多肽的合成物及其盐。
钙拮抗物有很多用途，临床上可用于治疗心绞通、高血压、心肌病、室性心律失常、aesophogeal achalasia、早产、雷诺病(Raynaud′s disease)及其它疾病。见W.G.Nayler.Calaium Antagonists，Academic Press Harcourt Brace Jovanovich Publshers.New York，NY 1988，其内容并入本文作为参考。另外，此类合在物还可用于细胞生理(如神经和肌肉细胞生理)的研究。
从Agelenopsis aperta中分离出的其它多肽在美国专利第5122596号中有公开。
本发明涉及从Agelenopsis aperta蜘蛛毒液中发现的一种多肽。本发明的多肽及其所呈现的部分如下Agelenopsis肽J2有以下的氨基酸顺序，SEQ ID NO1。
H2N-Glu-Ala-Cys-Ala-Gly-Ala-Tyr-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys-Val-Lys-Cys-Cys-His-Asp-Arg-Arg-Cys-Arg-Cys-Asn-lle-Ala-Met-Asp-Asn-Cys-Val-Cys-Lys-Leu-Phe-Tyr-Cys-Glu-Leu-Phe-Gly-Thr-Cys-Asp-Arg-Leu-Lys-Pro
本发明的多肽能阻塞细胞的钙通道。因此，此多肽本身可用来阻塞细胞钙通道。此多肽还用来控制无脊椎的害虫，治疗哺乳动物由细胞钙通道功能传递的疾病。
本发明还包括与上述多肽具有大致相同的氨基酸顺序和钙通道阻塞活性的多肽。
本发明还包括含有该多肽的药用组合物及该多肽类的施用方法。
Agelenopsis aperta蜘蛛的毒液按本领域技术人员所熟知的电刺激提取方法得到。最好用能够防止反胃物和血液污染，这种技术本领域技术人员均熟知。得到的全毒液贮存在-78℃的冷冻状态下直至用于下述纯化过程。全毒液中组分的纯化在一第列制备或半制备的色谱柱如C-4和C-18 Vydac
柱(Rainin Instrument Co.Inc.，Mack Road，Noburn Massachusetts 01801)上用反相高效液相色谱法完成。峰值检测在220-230nm下单色进行，该部分的进一步分析可用例如多色紫外吸收数据收集用一个Waters 990二极管系统检测仪完成(Millipore Corporation，Waters Chromatography Division，34Maple Street，Milford，Massachusetts 01757)。色谱柱上馏分的收集可用已知方法进行。例如用一个ISCO/“FOXY”馏分收集器和一个ISCO 2159峰值检测器(ISCO，4700 Superior，Lincoln，Nebraska 68504)收集。收集到的馏分置于适当大小的器器中，例如无菌聚乙烯的实验室器皿。然后用从洗脱液中冷冻干燥再从水中冷冻干燥的方法浓缩那些馏分。所得馏分的纯度可用色谱分析决定，所用分析柱的梯度系统比最终纯化馏分系统具有更高的同溶剂性。
本发明的多肽可用已知方法进行顺序分析，决定主要结构的一般方法包括例如以下步骤。1)二硫键半胱氨酸残基的还原和S-吡啶化，以增强底物对酶作用的敏感性，2)通过单酶和多步酶消化作用控制肽段分裂，3)通过反相高效液相色谱法(HPLC)分离和纯化肽段，4)用N-末端顺序测定和离子溅射质谱分析鉴定肽段。
所研究多肽半胱氨酸残基的S-吡啶化可在多肽氨基酸顺序测定后的溶液中进行。可按下述步骤完成。
将约1至10μg的多肽用缓冲液溶解或稀释至50μl，缓冲液用1份1MTris HCl，PH8.5，含有4mM EDTA和3份8M盐酸胍，2.5μl的2-巯基乙醇的10%水溶液加入混合物中，室温、暗处、氩气中保温两小时。保温后，加入2ml 4-乙烯基吡啶(在氩气、-20℃下保存的新鲜试剂)，混合物在室温、暗处、氩气中再保温两小时。然后将混合物脱盐，最好用色谱法在短的、反相色谱柱中进行。生成的烷基化的多肽用已知的方法进行顺序测定。
本公开的另一益处在于，其中Agelenopsis aperta毒液J2片段的肽，还可用从全毒液分离纯化以外的方法得到。本发明的多肽可用重组DNA技术通过无性繁殖该多肽或其部分的编码序列产生。例如，可按照本专业技术人员熟知的方法，运用已知氨基酸序列的杂交探针克隆整个多肽的氨基酸密码顺序。可用重组DNA技术和体外蛋白质合成的方法产生本发明的多肽。这样的体外蛋白质合成方法包括，但不限于，运用一种ABI 430A固相肽合成器(Applied Biosystems，Inc.850 Lincoln Center Drive，Foster City，California 94404)用标准的Merrifield化学或其它本领域技术人员熟知的固相化学方法。
本专业领域已知多肽中某些氨基酸更替不会影响或大致不会影响该多肽的功能。具体的替代物随多肽的不同而不同，容许的取代物由本专业技术人中熟知的方法决定。因此，所有具有大致相同的氨基酸顺序和大致相同的钙通道阻塞活性的多肽，均在本发明范围之内。
本发明的多肽阻塞多种细胞的钙通道，如脊椎和无脊椎动物的神经和肌肉细胞。
本发明的多肽阻塞钙通道的能力可用以下步骤来演示。从8天大的鼠小脑制备小脑颗粒细胞(Wilkin et al.，Brain Res，115，181-199，1976)。将Aclar方块(1cm2)(Proplasties Inc.，5033 Industrial Ave.Wall，NJ 07719)用聚-L-颗氨酸包膜置于含有1ml Eagles基础培养基的12-孔盘中，分离细胞，将含有6.25×106个细胞的等分试样加入每一个有Aclar方块的孔中。24小时后加入胞嘧啶-β-D-阿拉件呋喃糖苷(最终浓度为10μM)。这些细胞在培养6，7和8天后用于fura 2分析。将细胞(粘在Aclar方块上的)转移到含有1ml 2μM fura2/AM(Molecular Probes Inc.Eugene，OR 97402)于HEPES缓冲液的12孔盘中。HEPES缓冲液(N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙基磺酸缓冲液含有0.01%的牛血清蛋白，0.01%的葡萄糖，PH值为7.4，不含镁)。细胞在37℃下保温40分钟，取出含有fura 2/AM的缓冲液，再换入同种不含fura 2/AM的缓冲液1ml。在每一个石英比色杯中加2.0ml预热(37℃)的缓冲液。将Aclar方块上的细胞置入比色杯中，将比色杯置于装置有磁力搅拌器的恒温(37℃)支架上，用一荧光分光光度计(Biomedical Instrument Group，University of Pennsylvania)测定荧光度。荧光信号可稳定约2分钟。然后将适当浓度的所研究化合物的溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS，PH7.4)中的贮存溶液5-20μl加入比色杯。每个试验完成后荧光标记的校准和fura/AM损失的修正按Nemeth et.al.J.Biol.Chem.262，5188(1987)所述的方法进行。最大荧光值(Fmax)由加入35μm的肌霉素后测得。最小荧光度(Fmin由随后加入EGTA(12mM)螯合钙之后测得。按照上述步骤，所测多肽的钙通道阻塞作用表现为加入该多肽后荧光度的减小。本发明的多肽显示出低的IC50值，低于200nm。相比较，两种已知的市售钙通道拮抗物，硝苯吡啶和戊脉安，分别具有33nm和4800nm的IC50值。
本发明的多肽用作细胞钙通道阻塞剂。因此，此类多肽还可用于无脊椎害虫的控制及哺乳动物由钙通道功能传递的疾病的治疗，如心绞痛，高血压，心肌病，室性心律失常，aesophogeal achalasial，早产和雷诺病。另外，这类多肽还可用于研究细胞生理，包括(但不限于)神经和肌肉细胞。
本发是范围还包括本发明的多肽的药学上可接受的盐。此种盐的制备方法为本专业技术人员熟知。例如此多肽的碱基盐可按常规的方法制备。
当本发明的多肽用于哺乳动物时，可以单独使用，也可以与药学上可接受的载体或按标准药剂操作稀释于药物中使用。该多肽可口服，或按适合于多肽的方法经非肠道途径施用。非肠道施用包括静脉注射、肌肉注射、腹膜内注射、皮下注射和局部施用。
本发明的多肽用于口服时，可以片剂或胶囊的形式服用，或以水溶液或悬浮液的形式服用。如以片剂口服，载体通常包括乳糖和粟粉以及润滑剂，如通常加入硬脂酸镁。以胶囊形式口服时，稀释剂通常为乳糖和干粟粉。当口服水溶悬浮液时，活性成分与乳化和悬浮价质混合。如需要还可加入增甜剂和调味剂。
用于肌肉、腹膜内、皮下和静脉注射时，通常需要制备活性成分的无菌溶液，溶液的PH应适当地调节和缓冲。用于静脉注射，应控制溶液的总浓度使其与组织液等渗。
当本发明的多肽及其盐用于人体时，每日剂量应由处方医师决定。此外，剂量应随所龄、体重、病人的个体反应而不同，以及由病症的严重性和所施用药的效能而定。
当本发明的多肽及其盐用于控制无脊椎的害虫时，该多肽直接施用于该无脊椎动物体或其环境中。例如，本发明的化合物可以溶液的形式喷洒于该无脊椎动物上。控制此无脊椎动物所需的化合物的量将随无脊椎动物及其环境条件而变化，由施用者决定。
当本发明的多肽及其盐用于细胞生理的研究时，该多肽将按照本专业技术人员熟知的方法施用于细胞上。例如，该多肽可于一种适当的生理缓冲液中施于细胞上。这类研究所用的此种多肽的适合浓度应为200μM。但是也可大于或小于200μM。多肽的施用量将由本专业技术人员按熟知的方法决定。
实施例1A.将原Agelenopsis aperta的毒液(约40μl)加入一个反相高效液相色谱仪的色谱柱(VYDAC
C-18，300
，22×250mm)中用一个双相线性梯度操作系统，由95%A和5%B至80%A至和20%B经30分钟后，用30%A和70%B25分钟(A为0.1%的三氟乙酸，B为乙腈)，监测波长为220nm，流速为15ml/min，所需片段在38.3-38.7分钟内收集。汇集每一次得到的相似片段，然后用冷冻干燥法浓缩。
B.将从100μ的原毒液按步骤A分离出来的物质，加入一个反向高效液相色谱柱(Vydac
，C-18，300
，22×250mm)中，用线性梯度系统操作，从77%A和23%B至70%A和30%B25分钟(A为0.1%三氟乙酸，B为乙腈)，监测波长为220nm，流速为12ml/min，所需片段在17.3至17.7分钟内收集。汇集每次得到的相似片段，然后用冷冻干燥法浓缩。
肽J2的结构用下述的方法确定和证实。三份1至10nmol样品用Waters Pico-Tag系统进行异硫氰苯酯(PTC)氨基酸分析。用一个脉冲液相顺序分析仪(ABI)测定原来还原和与吡啶乙醇作用过的多肽N-末端顺序。多肽的主要结构可用自动脉冲液相顺序分析仪(Applied Biosystems，model 473A)测得。用质谱仪的BIO-ION等离子解吸时间可得到质谱分析数据。
适用于N末端顺序测定的多肽J2的吡啶乙基化的衍生物可按下列方法制备。将多肽J2(50mg)溶于10μl的缓冲液(比率为1∶3的1M tris，PH8.4，4μM二元EDTA和8M盐醇胍)，用2μl0.454M(10%V/V)的2-巯基乙醇处理，在室温、暗处放置3小时。反应混合物在缓冲液中用2μl的4-乙烯基吡啶0.456M的溶液处理，在室温、暗处放置18小时。反应混合物用90μl的水和40μl的乙腈稀释经加入一个HPLC色谱柱(Baker WPC-18，4.6-250mm)，用双相线性梯度系统处理，80%A和20%B5分钟，然后80%至50%A和29%至50%B经30分钟(A为三氟乙酸、B为乙腈)，监测波长为220nm，流速为1.0ml/min所需片段在20.8至21.3分钟内收集，用冷冻干燥法浓缩。
得到以下数据，确认了多肽J2的结构。
SEQ 1D NO1，48残基，10个半胱氨酸，5个二硫键。
计算质量＝5474.4测得质量＝5474估计长度＝7.98顺序表(1)一般资料(ⅰ)申请者(A)名称Dfizer Inc.
(B)街道235 East 42mol Street(C)城市纽约(D)州纽约(E)国家美国(F)邮政编码(ZIP)10017(G)电话(203)441-4905
(H)传真(203)441-5221(A)名称NPS Pharmaceuticals，Inc(B)街道420 Chipeta Way(C)城市盐湖城(D)州犹它州(E)国家美国(F)邮政编码(ZIP)84108(G)电话(801)583-4939(H)传真(801)583-4961(ⅱ)发明标题Agetenopsis aperta的钙通道阻塞多肽(ⅲ)序列编号1(ⅳ)计算机可读形式(A)传导形式软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件Patemtln Release ＃1.0 Version ＃1.25(EPO)(ⅵ)先有申请资料(A)申请号US 07/919538(B)申请时间1992年7月27日(2)SEQ ID No.1资料(ⅰ)序列特征(A)长度48个氨基酸(B)形式氨基酸
(C)链单链(D)拓朴学特征线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅵ)来源(A)生物Agelenopsis aperta(B)组织类型毒液(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO权利要求
1.一种大致纯的多肽，包括其氨基酸序列SEQIDNO∶1，或一种与该多肽有大致相同的氨基酸顺序和大致相同的钙通道阻塞活性的多肽，或其药学上可接受的盐。
2.权利要求1的大致纯的多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO1，其其药学上可接受的盐。
3.一种阻塞细胞钙通道的方法，包括施用权利要求1的阻塞钙通道量的多肽于所述细胞。
4.权利要求3的方法，其中所述细胞为哺乳动物神经系统的细胞。
全文摘要
一种由Agelenopsis aperta蜘蛛毒液中分离出来的多肽，它能阻塞不同有机体细胞的钙通道，可用于阻塞细胞的钙通道。用来治疗由钙通道传递的疾病和控制无脊椎害虫。
文档编号A61K38/16GK1086824SQ9310915
公开日1994年5月18日 申请日期1993年7月26日 优先权日1992年7月27日
发明者R·A·福克曼, N·A·萨科曼诺, D·菲利普斯, M·E·凯利 申请人:美国辉瑞有限公司