一种药物制剂的制作方法

专利名称：一种药物制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含有生长激素的稳定的药物制剂、制备该制剂的方法，含有组氨酸或其一种衍生物的生长激素晶体、制备该晶体的方法和组氨酸或其衍生物稳定生长激素制剂的用途。
源于人和普通家养动物的生长激素(GH)是约191个氨基酸的蛋白质，合成并分泌于垂体的前叶。人生长激素由191个氨基酸组成。
生长激素是一种不仅涉及躯体生长的调节而且涉及蛋白质、糖类和脂类代谢调节的重要激素。生长激素的主要作用是促进生长。
受生长激素影响的机体系统包括骨胳、结缔组织、肌肉和内脏如肝，肠和肾。
在现在重组技术和生长激素基因克隆的发展而导致了如人生长激素(hGH)和Met-hGH的工业规模生产之前，人生长激素只能由人尸体垂体中提取得到。生长激素的这种非常有限的供应限制了在幼童期和青春期用它来促进纵向生长而治疗侏儒症，甚至尽管已特别建议将它用于治疗矮小身材(由于生长激素缺乏、正常的矮小身材和特纳氏综合症)、成人生长激素缺乏、不育症、烧伤的治疗、伤口愈合、营养不良、骨愈合、骨质疏松、弥散性胃出血和假关节。
而且，生长激素已被推荐用于增加家养动物的生长速度或降低屠宰供人类消费的动物体内脂肪的比例。
生长激素的药物制剂往往是不稳定的。特别是在生长激素溶液中会产生降解产物如脱酰胺或次硫酸化产物和二聚物或多聚物的形式。
hGH的主要降解反应是1)直接水解或经环状琥珀酰胺中间体脱去酰氨基而形成不同量的L-asp-hGH，L-iso-asp-hGH，D-asp-hGH和D-iso-asp-hGH，(参考文献1-3)，2)氧化14和125位上的蛋氨酸残基(参考文献4-9)，以及3)裂解肽键。
脱酰胺特别易于发生在149位的Asn上。
hGH在14和125位上相当容易被氧化，特别是在溶液中(4-8)。
hGH在溶液中氧化成亚砜一般是由于该制剂中溶有氧。蒸馏水中氧的溶解度约为200μM(9)。因为在含有4IU/ml制剂中hGH的浓度为1.3mg/ml相当于60nmhGH，在一般贮藏条件下，氧将以超过氧化hGH化学用量约3000倍的量存在。用在压盖和包装该制剂前给溶液除气的方法来试图解决这个问题是不容易的。
目前，未以为这些降解产物具有毒性或改变了生理活性或具有结合受体的特性。但有迹象表明与原始hGH相比有降低亚砜构象稳定性的作用。
为了研制一种稳定的溶解的hGH的制剂，了解亚砜形成速度以及控制氧化的方法是很重要的。
在hGH制剂中降解动力学取决于温度、PH和各种附加剂或赋形剂。
由于生长激素的不稳定性，目前把它冻干并在4℃温度下以冻干形式贮存直到使用时重新再配制以便使降解减到最小。
目前由患者重新配制冻干的hGH药物制剂，然后在多达14天的使用期内以溶液在低温下贮存，通常在约4℃的冰箱中，在此期间将会发生某些降解。
而且，对患者来说冻干生长激素的重新配制过程往往是困难的。
因此，目前最好是在使用前尽可能晚地重新配制生长激素并最好以冻干状态贮存和运送该制剂，从生产厂家到药房易于在可控制的低温如4℃操作管理该制剂，使其具有长达两年的有效期限。
然而，笔筒体系(pensystem)自身治疗的推广使用和该制剂应用领域的扩大要求在那些并不能总得到“足够”冷冻条件下对最终使用者来说具有在足够长的时间内稳定的制剂。
优选地在药筒使用的有效期内，以冻干状态放置约一个月又在笔筒装置中以重新配制的形式放置一个月，对最终使用者来说该制剂应当仍是稳定的。
因而，需要一种更加稳定的生长激素制剂，它能以冻干状态在较高温度下稳定一段时间并以溶液形式在较高温度下稳定另一段使用时间。当把生长激素的使用从诊所移到得不到如上所述的适宜存放的被治疗的个人家庭中时，这种稳定性是非常重要的。
而且，使用笔筒装置服用生长激素的方式的改变要求一种稳定溶解的生长激素制剂以便患者易于进行操作。可以生产一种稳定溶解的生长激素制剂而便于以安装在病人使用的笔筒装置中的药筒方式来使用，患者可避免重新配制该制剂并且因而不需要冻干制剂、重新配制用的适宜的载体以及灭菌重新配制制剂所必需的技术和灭菌设备。
出于安全的原因，也需要避免在使用该制剂之前重新配制该冻干制剂。
而且，在生长激素制剂的生产中避免冻干步骤也是有益的。冻干是一个耗时并耗钱的步骤并因冷冻干燥机有限的容量而在生产中也经常是一个影响生产流程的环节。
所以，为了使溶解的hGH制剂在贮存期和长达一个月的使用期内稳定，就需要降低降解过程的速度。
以前稳定hGH的浓度在防止二聚体的形成方面没有完全成功，与二聚体形成的有关问题如在Becker，G.W.(BiotechnologyandAppliedBiochemistry9，478(1987))中有所记录。
国际专利公开WO89/09614和奥大利亚专利申请30771/89中公开了一种含有人生长激素、甘氨酸和甘露醇的稳定药物制剂。此制剂在常规制备过程中和以冻干态贮存期间以及重新配制后的使用期内表现良好的稳定性。
已公开的欧洲专利申请303746公开了用各种稳定剂稳定动物生长激素以减少不溶物的形成并保持在水溶液环境中的溶解性，这类稳定剂包括特定的多元醇、氨基酸、在生理PH值时具有带电侧基的氨基酸多聚物和胆硷盐。多元醇选自非还原性糖类、糖醇类、糖酸类、季戊四醇、乳糖、水溶性右旋糖酐类和Ficoll;氨基酸选自甘氨酸、肌氨酸、赖氨酸或其盐、丝氨酸、精氨酸或其盐、甜菜碱、N，N-二甲基-甘氨酸、天冬氨的或其盐、谷氨酸或其盐;在生理PH值具有带电侧基的氨基酸多聚物选自聚赖氨酸、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚精氨酸、聚组氨酸及其盐;以及胆硷衍生物选自氯化胆硷、柠檬酸二氢胆硷、酒石酸氢胆硷、碳酸氢胆硷、柠檬酸三胆硷、抗坏血酸胆硷、硼酸胆硷、葡萄糖酸胆硷、磷酸胆硷、硫酸二胆硷和粘酸二胆硷(dicholinemucate)。
EP374120公开了一种含有缓冲性多元醇赋形剂的稳定的生长激素制剂，该赋型剂含有具有三个羟基的多元醇和可使PH达到在足够长时期内保持生长激素生物活性的范围的缓冲剂。提及组氨酸作为具有三个羟基的多元醇缓冲剂。
现在已惊奇地发现以每mg生长激素加0.1到12mg组氨酸或其衍生物的只含有组氨酸或其衍生物作为附加剂或缓冲物的人生长激素的制剂具有高度抗脱酰胺，氧化和肽键裂解的稳定性。该产品的稳定性允许以冻干状态或已溶解或再溶解制剂形式贮藏和运送。
EP303746提到了聚组氨酸作为动物生长激素潜在的稳定剂，但没有指明是能稳定动物生长激素还是人生长激素。
EP374120教导了盐酸组氨酸可用作缓冲剂缓冲有三个羟基的多种元醇来提高浓度的生长激素和一种多元醇作为稳定剂的溶液形式的生长激素制剂的稳定性。必须以约3%(溶液重量)(相当于～0.15M盐酸组氨酸浓度的溶液)用量加入盐酸组氨酸。EP374120也指出了单独组氨酸不会带给生长激素制剂化学和物理稳定性。
本发明制剂可以是冻干粉末的形式，然后用常规载体如蒸馏水或注射用水重新配制，或者可以是含有生长激素晶体的溶液或悬浮液形式。这类载体，可以包括常规的防腐剂如间甲酚和苯甲醇。
本发明优选的实施方案是以组氨酸缓冲剂缓冲的缓冲性生长激素水溶液形式的含有组氨酸或其衍生物的人生长激素药物制剂的形式。这种制剂是一种备用形式并可以水溶液的形式贮存和运送而没有任何显著的降解。L-组氨酸pKA为6.0因而在PH6.5作为缓冲剂是适宜的。
认为PH6.5的组氨酸制剂在25℃温度下大约稳定50天。
本发明另一个优选的实施方案是以组氨酸缓冲剂缓冲的缓冲性生长激素晶体的水悬浮液形式的含有组氨酸或其衍生物的人生长激素药物制剂形式。该制剂是非常稳定的并且在以备用形式贮存和运送期间能将生长激素保持在晶体相中而产生一个更低的降解趋向。该制剂在注射时类似一种溶解制剂，即，人生长激素不是持续释放的。
为了稳定，溶液或悬浮液制剂的PH值优选调到2-9之间。PH5到8特别是PH6到7的制剂为更优选。
为达到稳定的效果，组氨酸的浓度优选从1mM到100mM。更优选的是，所加的组氨酸浓度为2到20mM，最好为5到15mM。
加入10%乙醇或5%甲醇能使脱酰胺降低20%以上。
本发明制剂也可以是冻干的粉状或饼状形式，它含有生长激素或生长激素衍生物和每mg生长激素或生长激素衍生物为0.1到12mg组氨酸或其衍生物用量的组氨酸或其衍生物以及冻干用的膨胀剂，该膨胀剂选自糖醇类和二糖及其混合物。糖醇优选甘露醇。
含有蔗糖的本发明冻干制剂是优选的，这是因为它有一个非常高的稳定性，而且含有蔗糖和甘露醇的制剂是特别优选的，它把非常高的稳定性和非常好的加工性能结合在一起而得到易溶并溶解后在溶液中长时期内非常稳定的坚固的冻干产品。更进一步本发明优选的制剂是含有甘露醇和海藻糖作为冷冻膨胀剂的制剂。含有甘露醇和二糖的本发明制剂含有大约等量的两种组份(以重量计)。
本发明制剂中蔗糖含量可以在很大的范围内变化。生长激素与蔗糖之比可以在0.005到1.5之间变化(按重量计)。因此，蔗糖用量可以是每mg生长激素0.67到200mg，优选每mg生长激素在1.1到50mg之间。
在组氨酸缓冲剂中冻干的hGH不会产生任何问题。再溶解后与磷酸缓冲剂相比，脱酰胺速度仍然降低20%。
本发明药物制剂可进一步含有常用的盐以便易于其制备(如冻干或重新配制)。
按照本发明，稳定生长激素的另一个方法是形成生长激素的晶体来抗降解得到更好的保护作用。已意外地发现含有组氨酸的晶体形式的生长激素制剂可满足以上所提到的要求。干燥形式的晶体可直接用来作为使用前以常规方法重新配制的GH制剂。
所以，本发明也涉及含有组氨酸或其衍生物和一种有机或无机阳离子的生长激素或生长激素衍生物的晶体。已经表明这种结晶的性能优于用上述制剂所达到的性能。
尽管可以容易地得到足量的结晶，但至今为止没有报道成功的GH结晶。已在各种出处报道了微晶，或非晶形物质Jones等，Biotechnology(1987)5，499-500;Wilhelmi等，J.Biol..Chem.(1984)176，735-745;Clarkson等，J.Mol.Biol.(1989)208，719，721;和Bell等，J.Biol.Chem.(1985)260;8520-8525。
悬垂滴落法是试图结晶GH所用的最普通的方法。显然由于生长激素制剂的不均匀性，所报道的该晶体的大小和形状也变化显著。由Jones等(1987)报道了最大的晶体。在他们成功的试验中他们使用了中性PH值的聚乙二醇3500和β-辛基葡萄糖甙混合物。
Clarkson等(1989)报道了使用低级醇和丙酮可产生0.001到0.005mm3不同形状的晶体。然而没有一种已知方法适于商业化生产GH结晶，这是因为需要几周到一年的生产周期。
在二价离子和一种油的混合物中已配制了为兽医使用的牛生长激素(EP343696)。在类脂存在下将ZnCL2加到牛或者猪的生长激素中制备成不确定的颗粒来形成一种长效释放制剂。用这一方法把该生长激素分散在载体中使每个生长激素分子包围1到4个Zn分子。该溶液是在不同浓度的变性溶质(1到4M的尿素)及高PH值(9.5)条件下配制的。用hGH重复这一过程已表明该方法不可能产生晶体。
从文献中已熟知在胰岛素的结晶过程中存在二价阳离子不仅可以在分析中有极好的定向作用，而且能改善结晶的物理条件(如参见美国专利2174862)。但是，生长激素比胰岛素大三倍多并且有完全不同的构象。现在已意外地发现在含有hGH和组氨酸或其衍生物的溶液中加入阳离子来高产率地生产稳定的均匀的生长激素结晶成为可能。而且，生成高质量hGH晶体所需时间周期相对缩短。
本发明的另一方面是制备生长激素和组氨酸或组氨酸衍生物晶体的方法，它包括的步骤有a)在一种溶剂中配成生长激素或生长激素衍生物的溶液并加入组氨酸或其衍生物，再用盐酸适当调节PH值为5到8。
b)加入有机或无机阳离子。
c)在约0℃到约30℃温度下使溶液结晶，和d)用已知的方法分离所形成的晶体。
已经发现在组氨酸或其一种衍生物存在时结晶hGH获得比在制备hGH制剂常用的磷酸缓冲液存在时结晶更大更纯更均匀晶体形式的较高产量的晶体。因此，该晶体的分离和纯化变得更为方便。
当在组氨酸存在下进行结晶时晶体产率比以前制剂结晶产率增加约20%。
原料(生长激素)可以是直接从发酵液中直接得到的浓缩物或者是溶于溶剂中并调节到一定浓度的常用冻干制剂，该浓度优选大于0.1mg/ml，优选浓度为4到7mg/ml，最佳浓度为6mg/ml。步骤a)中所适用的溶剂是一种含水缓冲液如磷酸缓冲液或组氨酸缓冲液。
在某一温度下允许结晶进行1到120小时，优选为5到72小时，最佳为20到48小时。该温度优选4到25℃。
步骤a)中组PH值一般为5.0到7.5，优选5.0到6.8，更好为5.8到6.5，最好为6.0到6.3。
步骤a)中组氨酸或组氨酸衍生物的浓度可在5-25mM之间变化，优选5-15mM，以便形成具有如上所述的适当大小和性能的晶体。
二价阳离子是优选的并已发现无机阳离子如Zn++特别适于快速形成稳定的GH晶体。也可以使用阳离子的混合物。
应以提供快速有效地形成好的所定义的晶体的量来加入该阳离子。所加阳离子量的上限是能引起大量非结晶物非特异性沉淀的量。
使用Zn++时，合适的浓度一般约为0.2到10mol Zn++/mol GH。然而，如果该结晶反应混合物含有能够与该阳离子结合(如以络合形式)的缓冲剂或其它化合物，为补偿这种结合在结晶过程中需加入较高浓度的阳离子。
优选以能引起GH晶体形成的用量来使用Zn++，该晶体的Zn++和GH摩尔比约为0.2到10，较优选约为0.5到5，最佳为约0.5到约2。
当使用其他无机阳离子时，浓度可在0.5和10mol阳离子/molGH之间变化。
本发明优选的实施方案是在步骤a)中加入一种有机溶剂或有机溶剂的混合物。
为结晶而加的合适有机溶剂可以从短链的脂族、脂环或芳香醇类和酮类如甲醇、乙醇、1-和2-丙醇、环己醇、丙酮和苯酚或间甲酚中选择。优选的有机溶剂为乙醇和丙酮，最佳为乙醇。
该溶液可以通过加入少量好的所定义的六角或针状hGH晶体来放入晶种，但最好不要加入晶种。
该有机溶剂的浓度可以从0.1到50%V/V，优选从0.1到30%，较好为0.1到20%，更好为5到15%，最佳为6到12%V/V。
由于在较大体积的溶液中形成结晶，本方法可以用作所述生长激素快速有效的器流工艺。
当使用乙醇作为有机溶剂时，它的合适浓度为0.1到20%，优选5到15%，最佳为6到12%(V/V)。
所形成的结晶可以用常规方法分离，如离心或过滤、洗涤并任意冻干除去微量的有机溶剂。
晶体的大小将取决于该过程中所用的Zn++与GH之比和所使用溶剂的选择和用量。
本发明的hGH晶体在体外试验中显示具有类似于经典的溶解性hGH的生物功效。所以新的GH晶体能够适用于与商业上购得的hGH制剂相同的症状。
本发明的另外一个方面涉及组氨酸或其衍生物在制备稳定生长激素制剂中的应用。
本发明的药物制剂优选为单位剂量的形式，每个单位剂量含有4IU到100IU生长激素。
在本文中“生长激素”可以是来源于如鸟、牛、马、人、羊、猪、鲑、真鳟或金枪鱼的任何生物的生长激素，优选牛、人或猪的生长激素，人生长激素为最好。按照本发明所用的生长激素可以是从自然资源中分离的天然生长激素，如，用常规方法提取垂体获得的，或者是用重组技术生产的生长激素，如E.B.Jensen和S.Carlsen在BiotechandBioeng.36，1-11(1990)所述的。“生长激素衍生物”可以是一种截断形式的生长激素，其中一个或多个氨基酸残基已被删除;一种生长激素的类似物，其中天然分子中的一个或多个氨基酸残基已被另一个氨基酸残基(优选天然产生的氨基酸残基)取代，只要这种取代没有任何付作用如抗原性或降低作用;或者是一种生长激素的衍生物，如该生长激素的脱酰胺或亚砜化形式或具有N或C-末端延长如Met-hGH，Met-Glu-Ala-Glu-hGH或Ala-Glu-hGH的形式。优选的生长激素是hGH。
为本发明目的，术语“组氨酸衍生物”是指组氨酸的酰胺类和酯类如甲基或乙基酯，二肽如His-Gly、His-Ala、His-Leu、His-Lys、His-Ser和His-Phe，以及组氨酸的类似物或衍生物如咪唑，脱氨基-组氨酸或聚组氨酸。为了方便的缘故，本发明制剂中组氨酸或其衍生物的含量被计算出来并使用组氨酸本身的摩尔重量。
使用术语“盐类”来表示为方便药物制剂的加工或重新配制所加的附加剂，它包括常规附加剂如有机酸如柠檬酸、酒石酸或醋酸的碱金属、碱土金属或铵盐、如柠檬酸钠、酒石酸钠或醋酸钠、或无机酸如盐酸的碱金属、碱土金属或铵盐，如氯化钠。
该本文中的“高稳定性”是当制剂比含有磷酸缓冲液的常规制剂稳定时认可的。
“糖醇”可以是甘露醇、木糖醇、赤鲜醇、苏糖醇、山梨醇或丙三醇。
本文中的“二糖”是指天然产生的二糖，如，蔗糖、海藻糖、麦芽糖、乳糖、琼脂糖、松二糖、昆布双糖、异麦芽糖、龙胆二糖或密二糖。
本发明制剂中所用的溶剂可以是水、醇类如乙醇、正丙醇或异丙醇、丁醇或其混合物。该溶剂可含有防腐剂如间甲酚或苯甲醇。
参考附图可以更详细地描述本发明

图1.显示了未加组氨酸所制备晶体的照片。
图2.显示了本发明hGH晶体的照片。
在下列说明本发明的实施例中更详细地解释了本发明。它们并不被认为是限制由所附权利要求定义的本发明的范围。
实施例1脱酰胺的降低作用在37℃温度下对在PH6.5的组氨酸缓冲液中含有4IU和12IU的hGH制剂与在相同PH值的磷酸缓冲液中的相同hGH制剂进行比较来检测脱酰胺速度。
把15.5mg组氨酸溶于10ml的含有0.9%苯甲醇的去离子水中并加0.1N盐酸到PH为6.5来制得10mM组氨酸缓冲液，再把13.3mghGH溶于10ml的10mM组氨酸缓冲液中来制备组合物A的含有4IU的hGH制剂。把40mghGH溶于如上所述的相同缓冲液中制得含12IU制剂。
把17.8mg磷酸氢二钠溶于10ml含有0.9%(V/V)苯甲醇的去离子水中并加0.1N的磷酸到PH值为6.5制得10mM的磷酸氢二钠缓冲液，在10ml该缓冲液中溶解13.3mghGH制得组合物B的含4IU的hGH制剂。把40mghGH溶于如上所述的相同缓冲液中制得含12IU的制剂。
组合物A10mM组氨酸(His)0.9%苯甲醇HCl加至PH为6.5组合物B10mM磷酸氢二钠0.9%苯甲醇磷酸加至PH为6.5在重新配制后马上和在37℃放置7天后用IE-HPLG检测该制剂中脱酰胺-hGH的含量。结果显示于下表1中。
表1.脱酰胺制剂脱酰胺%缓冲液A4IU/ml1.7开始12IU/ml2.1缓冲液A4IU/ml10.17天后(37℃)12IU/ml10.4缓冲液B4IU/ml1.8开始12IU/ml2.3缓冲液B4IU/ml16.97天后(37℃)12IU/ml14.9
上表表明在37℃与磷酸缓冲液相比，组氨酸缓冲液中hGH的脱酰胺作用显著降低。
实施例2在组氨酸或其衍生物存在下脱酰胺的降低作用在25℃下检测5mM、10mM和100mM组氨酸缓冲液PH7.3和PH6.5时含有6IUhGH的hGH制剂脱酰胺速度，并与相同PH8mM磷酸缓冲液进行比较。而且，测试了组氨酸衍生物His-Gly、His-Ala、His-Leu、His-Lys、His-Phe、His-Ser、组氨酸甲基酯、组氨醇、咪唑、咪唑-4-乙酸和组胺。
分别把7.8mg、15.5mg和155.2mg的组氨酸溶于10ml含0.9%(V/V)的苯甲醇的去离子水中并加0.1N的盐酸至所述的PH值制得所需浓度的组氨酸缓冲液。再把20mghGH溶于10ml的该组氨酸缓冲液中制得hGH制剂。
在25℃下存放下表2所述的hGH制剂并在14和30天后用IE-HPLC分析该制剂中脱酰胺的含量。结果显示于下表2中。
表2.
按制剂的性能和在25℃下溶液放置的时间来用IE-HPLC测定脱酰胺hGH的含量制剂(*) 25℃形成的脱酰胺化合物14天30天5mMHisPH6.56.59.15mMHisPH7.311.017.4
10mMHisPH6.56.89.710mMHisPH7.311.316.6100mMHisPH6.59.815.2100mMHisPH7.319.328.88mM磷酸氢二钠PH6.57.810.88mM磷酸氢二钠PH7.315.220.38mM磷酸氢二钠PH6.59.413.20.3%间甲酚10mMAsp,PH6.521.7nd10mMGlu,PH6.514.8nd10mMHis-Gly,PH6.25.68.110mMHis-AlaPH6.56.28.510mMHis-LeuPH6.58.812.310mMHis-LysPH6.58.612.010mMHis-PhePH6.57.511.310mMHis-SerPH6.322.0nd10mM组氨酸甲基酯PH6.54.65.210mM组氨醇PH6.527.4nd10mM咪唑PH6.59.212.210mM咪唑-4-乙酸PH6.510.314.210mM组胺PH6.59.812.2＊除配方9外均含有0.9%苯甲醇起始物中脱酰胺-hGH的含量为2.1%
上表2表明PH值6.5和7.3下与加入磷酸缓冲液相比，加入组氨酸时hGH的脱酰胺作用下降了大约20%。而且，PH值从商业hGH制剂的常规PH值7.3降低到PH值6.5本身会使脱酰胺速度下降50%。
在实验条件下，组氨醇似乎没有使制剂稳定，并且加入较大用量的组氨酸不但没有增加反而降低了所需的作用。
使用组氨酸类似物如咪唑、组胺和咪唑-4-乙酸以及组氨酸甲酯可获得类似的结果，即在25℃下放置30天后仅有3.1%脱酰胺-hGH形成，使该制剂的有效期可达3-4个月。
在PH6.5时与磷酸相比，加入Asp或Glu增加了脱酰胺速度。
加入His-X类型的二肽显示出对His-Gly和His-Ala起极积作用，而His-Ser却降低稳定脱酰胺的作用。
以上结果表明降低PH值和以较低浓度(优选约5mM-10mM)加入组氨酸能降低脱酰胺的速率。降低PH值并用组氨酸替代磷酸缓冲液可使脱酰胺速率降低50%以上。
使用间甲酚或苯甲醇作为防腐剂似乎对脱酰胺速率没有影响。
与磷酸比较，在PH6.5时组氨酸可降低裂解的产生(肽键的水解)。
实施例3降低亚砜形成的作用检测对PH值和缓冲液类型的依赖性。
PH值的依赖性;
方法
把含有碳酸氢盐、甘氨酸和甘露醇+0.9%苯甲醇的商用hGH制剂(Norditropin， 12IU/ml)用0.1N的盐酸将PH调节到8.3、8.0、7.5、7.0、6.5和6.0，并在37℃放置样品。在0、7和14天后用RP-HPLC进行分析。结果显示于下表3中。
表3亚砜的形成样品温度(℃)放置天数亚砜(%)PH8.37-01.0PH8.373779.0PH8.043778.7PH7.523778.3PH7.013777.7PH6.523776.5PH6.023774.8PH8.37371414.9PH8.04371414.5PH7.52371414.0PH7.01371412.9PH6.52371411.1PH6.0237147.7将意识到，当把PH值从8.4降到6.0时hGH中亚砜的形成也被降低。
缓冲液的类型、PH把含有12mg/ml蒸馏水的B-hGH制剂以1+10的比例用各种缓冲液稀释为15mM的浓度并可加入或不加入其它附加剂。在25℃下放置样品，并在10和34天后用RP-HPLC进行分析。RP-HPLC的分析结果和可有可无的附加剂显示于下表4中。
表4亚砜的形成缓冲液PH附加剂亚砜化10天34天%磷酸盐7.3-1.95.5组氨酸7.3-0.92.4组氨酸6.9-0.92.0组氨酸6.5-0.81.9组氨酸7.318mMMet0.82.0组氨酸7.318mMCys2.42.9组氨酸7.30.42mMtoc.1.13.0组氨酸7.39%乙醇1.34.2组氨酸7.318mMasc.41nd组氨酸7.30.8%NaCl1.33.5Toc维生素E，asc抗坏血酸。
与磷酸缓冲液相比，在组氨酸缓冲液(PH7.3)中可观察到亚砜化B-hGH形成显著下降。在组氨酸缓冲液中可观察到随PH值下降亚砜形成也下降。
加入抗氧化剂或其它附加剂未获得进一步的作用。
实施例4在磷酸盐或组氨酸缓冲液存在下hGH的结晶将按Dalboege等(Biotechnology(1987)，5，161-164)的方法制备的hGH的等分试样以6mg/ml的浓度在PH6.2的10mM磷酸盐或10mM组氨酸缓冲液中进行晶体生长。把乙醇加到每个试样中使最终浓度为7.5%(V/V)，之后再加乙酸锌溶液使在磷酸缓冲液中锌的最终浓度为1.34molZn/molhGH和在组氨酸缓冲液中锌的最终浓度为5.5molZn/molhGH。
在悬浮液中使晶体生长16小时并用相差显微镜监控结晶作用。在组氨酸缓冲液中所形成的晶体具有好的所定义的大小一致的六方形外观并含有很少或没有非结晶杂质(图1)。相反，确实相同的条件下在磷酸缓冲液中所形成的hGH晶体具有明显的多的不均匀外形并含有明显量的非结晶物(图2)。
让晶体再生长5天。通过离心收集组氨酸和磷酸缓冲液所形成的晶体并把晶体溶于7M尿素中，随后分析hGH。
缓冲液晶体(%)游离hGH(%)组氨酸6535磷酸盐5545
因而，就晶体的产量和质量而言，组氨酸缓冲液为hGH结晶提供了更好的条件。
实施例5将含有组胺酸和蔗糖或甘露醇的冻干hGH制剂的稳定性与含有磷酸盐、甘氨酸和甘露醇的常规hGH制剂进行比较。
把hGH溶液脱盐到所述的组氨酸缓冲液中制得下列制剂1-8。用各种组氨酸缓冲液把hGH的浓度调节到6IU/ml之后，溶入所述用量的甘露醇和蔗糖。
制剂9与常规hGH制剂相一致并被用作参照。
把所有1-9的hGH溶液填充到1ml的小玻璃瓶中并冻干。
在用0.9%的苯甲醇溶液重新配制后进行hGH的分析。
1.hGH6IU/ml用HCl调到PH6.5甘露醇33mg/ml2.hGH6IU/ml用HCl调到PH6.5蔗糖62mg/ml3.hGH6IU/ml用HCl调到PH7.0甘露醇33mg/ml4.hGH6IU/ml用HCl调节到PH7.0
蔗糖62mg/ml5.hGH6IU/ml用HCl调到PH6.5甘露醇33mg/ml6.hGH6IU/ml用HCl调到PH6.5蔗糖62mg/ml7.hGH6IU/ml用HCl调到PH7.0甘露醇33mg/ml8.hGH6IU/ml用HCl调节到PH7.0蔗糖62mg/ml9.hGH6IU/mlNa2HPO4·2H2O 0.59mg/mlNaH2PO4·2H2O 0.53mg/ml甘露醇20.5mg/ml用磷酸调到PH7.0.
冻干的产品很容易溶解并形成透明的水溶液。
表5中列出了用%表示冻干前(BL)和冻干后立即、在4℃7个月后、在4℃7个月后加上37℃4个月和在4℃7个月后加上25℃4个月的多聚物的量。
表6中列出了用%表示的二聚物的量。
表7中列出了用%表示的脱酰胺hGH的量，并且表8中列出了用%表示的亚砜的量。
按实施例1-4的方法测定脱酰胺hGH和亚砜的量。
用gp-HPLC来测定二聚物和多聚物的量。
多聚物的量在含蔗糖的样品中明显较低。
二聚物的量在含蔗糖的样品中明显较低。
4℃7个月+25℃4个月后脱酰胺-hGH的量在含有组氨酸的组合物中非常低。
亚砜的量在含蔗糖的样品中明显较低。
实施例6含有组氨酸、甘露醇和二糖的冻干制剂的稳定性。
用实施例5所描述的相同方法来制备下列制剂。
10.hGH6IU/ml用HCl调到PH6.5蔗糖21mg/ml甘露醇22mg/ml11.hGH6IU/ml用HCl调到PH7.0蔗糖21mg/ml甘露醇22mg/ml12.hGH6IU/ml用HCl调到PH7.0海藻糖20mg/ml甘露醇22mg/ml在冻干前(BL)、t＝0、40℃三个月后和25℃6个月后测定脱酰胺hGH、多聚物和二聚物的量(%)。
结果显示在下表9-11中。
很明显，含有甘露醇和蔗糖或海藻糖的样品比只含有甘露醇作为冻干膨胀的样品具有更好的稳定性。
实施例7含有hGH晶体的药物制剂的配制如实施例4中所述的方法生长晶体并在4℃贮存。然后通过离心分离晶体并随后除去母液。再把晶体冷冻过夜得到无剩余有机溶剂的干燥晶体。按照下列处方配制干燥晶体的药物悬浮液hGH晶体1.3mg/ml组氨酸1.6mg/mlZn(Ac)2·H2O 0.1mg/ml苯甲醇0.9%(V/V)用HCl把PH值调到6.5。
实施例8除省略Zn(Ac)2·H2O外重复实施例7，得到下列配方的悬浮液hGH晶体1.3mg/ml组氨酸1.6mg/ml苯甲醇0.9%(V/V)将PH调到6.2。
实施例9用实施例7相同方法处理晶体并配制下列悬浮液hGH晶体1.3mg/ml组氨酸1.33mg/mlNaCl5.7mg/ml苯甲醇0.9%(V/V)把PH调到6.2。
实施例10用实施例7相同方法处理晶体并制备下列溶液hGH晶体1.3mg/ml组氨酸1.14mg/mlNaCl9.0mg/ml把PH调到6.1。
实施例11用实施例1中所述的相似方法，用不同浓度的组氨酸(0、1、2、5、10、20、30、50或100mM)在PH6.5的0.9%苯甲醇中配制浓度为6IU/ml的生物合成的人生长激素。在37℃下将样品存放7天并用如上所述的相同方法进行脱酰胺、氧化形式和二聚物和多聚物的含量分析。结果显示于下表12中，其中脱酰胺-hGH、二聚物和多聚物、以及氧化形式的含量是通过IE-HPLC、GP-HPLC和RP-HPLC测定的，裂解形式的hGH的含量是用IE-HPLC测得的。
当组氨酸的浓度为1mM或1mM以上时二聚物的量较低，对形成脱酰胺化合物来说组氨酸的浓度高达30mM时得到满意的结果，而对形成氧化形式来说组氨酸浓度低于20mM是优选的。总的来说组氨酸浓度最好为5mM。
参考文献1)Y.-C.J.WangandM.A.Hanson.ParenteralFormulationsofProteinsandPeptidesStabilityandStabilizers.J.ParenteralScienceandTechnology42(Suppl.)(1988)53-525.
2)M.C.Manning，K.Patel，R.T.Borchardt.StabilityofProteinPharmaceuticals.PharmaceuticalResearch6(11)(1988)903-918.
3)B.A.Johnson，J.M.Shirokawa，W.S.Hancock，M.W.Spellman，L.J.BasaandD.W.Asward.J.Biol.Chen.264，1462-71(1989).
4)L.C.Tehetal.，J.Biol.Chem.，262，785-794(1987).
5)G.W.Beckeretal.，Biotech.Appl.Biochem.，10，326-337(1988).
6)R.A.Houghtenetal.，Arch.Biochem.Biophys.，178，350-355(1977).
7)R.M.Rigginetal.，Anal.Biochem.，167，199-209(1987).
8)P.Gellerforsetal.，ActaPaediatr.Scand(suppl)，370，93-100(1990).
9)M.J.Kaufman，Pharm.Res.，7(3)，289-292(1990).
权利要求
1.一种药物制剂，它含有一种生长激素或一种生长激素衍生物和组氨酸或一种组氨酸衍生物，其用量为每mg生长激素0.1到12mg组氨酸或其衍生物。
2.按照权利要求1的药物制剂，它是用1mM到100mM浓度的组氨酸缓冲液缓冲的缓冲性生长激素水溶液形式。
3.按照权利要求1的药物制剂，它是用组氨酸缓冲液缓冲的缓冲性生长激素晶体的水悬浮液形式。
4.按照权利要求1-3的任一药物制剂，其中将PH值调到2-9之间。
5.按照权利要求4的药物制剂，其中把PH值调到5-8之间。
6.按照上述权利要求中的任一药物制剂，还可以含有糖醇或二糖或其混合物。
7.按照上述权利要求中的任一药物制剂，它含有甘露醇或二糖或其混合物。
8.按照权利要求7的药物制剂，其中的二糖是蔗糖或海藻糖。
9.按照权利要求1-8中的任一药物制剂，其中的生长激素为hGH。
10.生长激素的晶体，它含有组氨酸或一种组氨酸的衍生物。
11.按照权利要求10的晶体;其中生长激素是hGH。
12.生长激素或其衍生物和组氨酸或其衍生物晶体的制备方法，它包括的步骤有a)在一种溶剂中制备生长激素或生长激素衍生物的溶液并加入组氨酸或组氨酸衍生物，用盐酸把PH任意调节到5到8之间。b)加入有机或无机阳离子。c)该溶液在约0℃到约30℃温度下进行结晶，并d)用已知方法分离形成的晶体。
13.按照权利要求12的方法，其中步骤a)的溶剂选自短链脂族，脂环族或芳香族的醇类和酮类。
14.按照权利要求11或12的方法，其中的生长激素是hGH。
全文摘要
一种含有生长激素和作为附加剂或缓冲物的组氨酸或组氨酸衍生物的药物制剂，具有较高的抗脱酰胺、氧化和裂解肽键的稳定性。该产品的稳定性可允许它以冻干状态或已溶解或再溶解的制剂形式在室温贮存和运送。在组氨酸或组氨酸衍生物存在下结晶生长激素比已知方法能产生较高产量的具有较高纯度的晶体。
文档编号A61K38/27GK1096222SQ9312106
公开日1994年12月14日 申请日期1993年11月10日 优先权日1992年11月10日
发明者H·H·雪仁森, L·思克里沃, A·R·豪尔高德 申请人:诺沃挪第克公司