专利名称：与生长因子受体结合的多肽所构建的基因转移载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学的基因治疗领域。具体地说是关于一类与生长因子受体结合的多肽所构建的基因转移载体，通过受体介导的内吞作用，将外源DNA靶向性地导入肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的。
基因治疗是将外源DNA导入人体的特定细胞以产生治疗效果，达到治疗疾病的目的。为此，首先需具备安全有效的基因转移载体。目前主要有两大类方法可以有效地介导外源DNA转入人体细胞，一类是病毒载体介导的方法，另一类是非病毒载体介导的方法。对属于后者的受体介导的基因转移方法，近年来有所报道。受体介导的基因转移可以通过外源DNA与受体的相应配体结合形成载体来实现。该类载体中的配体可与特定细胞表面的相应受体结合，通过受体介导的内吞作用，将外源DNA转导入特定细胞。Wu.G.Y.等(J.Biol.Chem.，263，14621，1988)报道利用受体介导基因转移将外源DNA转入体外培养的肝细胞，载体中所用的配体是去唾液酸糖旦白，它是用于遗传病基因治疗。Max L.Birnstiel等(P.N.A.S.87，3410-3414.1990)报道利用转铁蛋白与细胞膜表面的转铁蛋白受体结合，经细胞的内吞作用，将外源DNA转导入细胞内，使其获得表达。
此外，这种基因转移载体虽具有靶向性，但有研究提示，通过此种途径被细胞内吞的DNA在向细胞核转移的过程中，必须经过溶酶体，而使载体中的DNA可能被溶酶体内的酶降解，从而使有效转移效率下降。目前已经知道，同时加入某些病毒，例如腺病毒或流感病毒，可提高外源DNA的转移效率。病毒感染宿主细胞时可以避免细胞溶酶体的酶系对DNA降解的原因之一为某些病毒如流感病毒、腺病毒在感染宿主细胞过程中，当内吞小体形成后，通过病毒外膜的某些蛋白质的结构域与内吞小体的脂质膜作用，破坏内吞小体的膜系统，从而释放出DNA。Max L.Birnstiel等(P.N.A.S.89，6094-6098，1992)报道了利用缺陷型或化学灭活的腺病毒对内吞小体的膜系统的破坏，从而增强转铁蛋白受体介导的基因转移的效率。
为此，本发明的目的是提供一类与生长因子受体结合的多肽所构建的基因转移载体。该类载体是多肽/多聚阳离子/助剂/外源DNA四元复合物非病毒载体或是多肽/多聚阳离子/外源DNA三元复合体非病毒载体，其中配体多肽是E5(有14个氨基酸)，GT6(有16个氨基酸)，GE7(有16个氨基酸)，GV8和GC9；多聚阳离子是多聚赖氨酸或多聚精氨酸；助剂是与流感病毒外膜血凝素氨基端氨基酸序列同源的合成肽HA20或假型逆转录病毒。利用配体多肽识别肿瘤细胞膜上过量表达的生长因子受体，经细胞的内吞作用，通过该载体将外源DNA选择性地转导入肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的。
本
发明内容
主要涉及四个方面，它们分别是提供与生长因子受体特异结合的多肽；提供多肽/多聚阳离子/外源DNA三元复合体基因转移非病毒载体；提供多肽/多聚阳离子/助剂/外源DNA四元复合物基因转移非病毒载体；上述两种形式的非病毒载体用于活体内外肿瘤的基因治疗。
本发明的第一方面提供与生长因子受体IGF-IIR(胰岛素样生长因子-II受体)，TGFR(转化生长因子受体)，EGFR(表皮生长因子受体)，VEGFR(血管内皮生长因子受体)，CSF-IR(克隆集落生长因子-I受体)特异结合的多肽E5、GT6、GE7、GV8、GC9。
某些肿瘤如肝癌、脑瘤、鼻咽癌等，其癌细胞表面的生长因子受体，如IGF-IR、TGFR、EGFR，CSF-IR及瘤内新生血管的VEGFR过量表达。依据配体与受体相互作用的原理，本发明采用电脑图像模拟设计合成了一系列与上述生长因子受体结合的多肽。多肽合成在美国ABI公司的多肽合成仪(Applied Biosystems 430A Pep-tide Synthesizer)上予以完成，合成步骤依据ABI公司多肽合成操作手册进行。多肽合成以后经高压液相色谱纯化得多肽粉末产物。所得多肽产物可经水解分析证实。
合成的多肽经下述方法筛选。首先将合成的多肽和多聚赖氨酸(或多聚精氨酸分别与SPDP(N-Succinimyl-3-2-pyridyldithio propionate)作用生成吡啶二硫多肽和吡啶二硫多聚赖氨酸(或多聚精氨酸)。吡啶二硫多聚赖氨酸(或多聚精氨酸)巯基化后与吡啶二硫多肽作用形成以二硫键连接的多肽-多聚赖氨酸(或多聚精氨酸)共价连接物。图2、图3和图4各为E5-多聚赖氨酸，GT6-多聚赖氨酸，GE7-多聚赖氨酸共价连接物经Sephadex(交联葡聚糖凝胶)G-50柱层析分离纯化的记录图。图5为E5-多聚赖氨酸共价连接物水解后的氨基酸成份分析结果。通过正负电荷的静电作用，多肽-多聚赖氨酸(或多聚精氨酸)与外源DNA pSV-β-gal(含有β-半乳糖苷酶基因的质粒DNA)结合成多肽/多聚赖氨酸(或多聚精氨酸)/pSV-β-gal复合体。图6为E5/多聚赖氨酸/pSV-β-gal复合体的1％琼脂糖凝胶电泳结果。在有助剂合成肽HA20存在时，以多肽/多聚赖氨酸/pSV-β-gal复合体转染肿瘤细胞(如肝癌细胞，胶质瘤细胞)和新生血管内皮细胞。对被转染的细胞施以在X-gal(5-bromo-4-Chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside)存在时的组织化学染色，筛选出与肿瘤细胞和新生血管细胞表面的生长因子受体特异结合的多肽E5、GT6、GE7、GV8、GC9。图7所示为与肝癌细胞表面IGF-IIR特异结合的多肽E5所介导的pSV-β-gal组织化学染色结果，可以观察到pSV-β-gal仅在肝癌细胞中获得表达。而图8所示多肽E5不能将pSV-β-gal介导入正常肝细胞，组织化学染色为阴性。
合成的多肽经过上述筛选，筛选出本发明的多肽为E5是一个有14个氨基酸的多肽，其氨基酸序列为EPFRS PDLAL ETYG；GT6是一个有16个氨基酸的多肽，其氨基酸序列为VPHSG YVGAR PHADL L；GE7是一个有16个氨基酸的多肽，其氨基酸序列为NPVVG YIGER PQYRD L。
以上述多肽E5为例，取小量样品经6N HCl于110℃水解过夜，经氨基酸成份分析(见图1)，图中可见除P(脯氨酸在水解过程被破坏)以外的其它所有多肽E5内的氨基酸成份证实合成的多肽顺序与设计要求完全一致。
对本发明合成多肽，其氨基酸序列同源率不大于50％时，都适用于组成本发明的四元复合物非病毒载体和三元复合体非病毒载体。又以类似性能的氨基酸替代上述本发明多肽中相应位点的氨基酸后形成的多肽，基本上不影响其性能，也适用于本发明组成非病毒载体。
本发明的第二方面提供多肽/多聚阳离子/外源DNA三元复合体非病毒载体。多肽是E5、GT6、GE7、GV8、GC9；多聚阳离子是多聚赖氨酸或多聚精氨酸；外源DNA是含反意癌基因，抗癌基因，自杀基因，细胞凋亡基因和细胞因子基因的真核重组表达载体(包括病毒性真核重组表达载体、逆转录病毒重组表达载体、腺病毒重组表达载体及以SV40、CMV的启动子为顺式调控元件的真核重组表达载体)。反意癌基因包括癌基因的全基因反意基因及癌基因的部分DNA片段反意序列；抗癌基因包括p53及Rb；自杀基因包括HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)基因及CD(大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶)基因；细胞凋亡基因包括p15、p16、p21；细胞因子基因包括TNF(肿瘤坏死因子)基因，INF(干扰素)基因，IL(白细胞介素)基因。该复合体非病毒载体的构建方法类似于上述合成多肽筛选方法中情况，首先将多肽与多聚赖氨酸(或多聚精氨酸)结合成多肽-多聚赖氨酸(或多聚精氨酸)共价连接物再与带负电荷的外源DNA形成三元复合体基因转移非病毒载体。
本发明的第三方面提供多肽/多聚阳离子/助剂/外源DNA四元复合物基因转移非病毒载体。助剂的存在能提高该类载体的转导效率。助剂采用与流感病毒外膜血凝素氨基端氨基酸序列同源的合成肽HA20或假型逆转录病毒。HA20的合成基本参照文献(Midoux P.等，Nuc.Aci.Res，21，871，1993)制备，HA20是一个含20个氨基酸的多肽，它的氨基酸序列为GLFEA IAEFI EGGWE ELIEG。假型逆转录病毒可以是单噬性小鼠白血病病毒或多噬性小鼠白血病病毒。
该四元复合物非病毒载体的构建方法同样也是首先将配体多肽与多聚赖氨酸(或多聚精氨酸)共价连接(通过SPDP连接而成)。再同样将HA20与多聚赖氨酸(或多聚精氨酸)结合成HA20-多聚赖氨酸(或多聚精氨酸)共价连接物。这两个共价连接物按一定比例共同与带负电荷的外源DNA藉静电作用结合成多肽/多聚赖氨酸(或多聚精氨酸)/HA20/外源NDA四元复合物基因转移非病毒载体。如图9所示为E5/多聚赖氨酸/HA20/含β-半乳糖苷酶基因的质粒DNA四元复合物基因转移非病毒载体的凝胶电泳图。
HA20除了如上所述以结合态在四元复合物载体中存在外，还能以HA20-多聚赖氨酸(或多聚精氨酸)共价连接物与多肽/多聚阳离子/外源DNA三元复合体载体一起以非结合态存在，还能以单独的HA20与三元复合体载体一起以非结合态存在，都能提高本发明基因转移非病毒载体的转导效率。助剂假型逆转录病毒也是以非结合态与三元复合体载体一起存在。该假型逆转录病毒所包裹的遗传物质可以包括以下外源基因自杀基因HSV-TK，CD；细胞凋亡基因p15、p16、p21；抑癌基因p53；细胞因子基因或不包含任何外源基因，即仅含有其自身缺损的遗传物质。
本发明的第四方面是多肽/多聚阳离子/外源DNA三元复合体和多肽/多聚阳离子/助剂/外源DNA四元复合物基因转移非病毒载体用于活体内外肿瘤的基因治疗。
体外试验将含有细胞凋亡基因p15的质粒DNA与E5-多聚赖氨酸及HA20-多聚赖氨酸结合形成的E5/多聚赖氨酸/HA20/含有细胞凋亡基因p15的质粒DNA四元复合物非病毒载体转染体外培养的肝癌细胞，培养72小时后，应用丙酮固定细胞，再用萤光染料DAPI对细胞进行萤光染色，以显示被转染细胞的细胞核。在萤光显微镜下，观察到肝癌细胞的细胞核中的细胞程序性死亡的特征性变化—细胞核的碎片及核浓缩，而正常肝细胞核则保持完整。图10所示为该非病毒载体转染的肝癌细胞显示细胞核破裂的DAPI染色结果，该结果显示本发明基因转移非病毒载体有良好的肝癌治疗效果。
体内试验以荷人肝癌细胞SMMC-7721瘤块的裸鼠为实验动物，在皮下接种过瘤块的裸鼠，待瘤块长至直径约为0.5cm3时，开始皮下瘤内注射本发明四元复合物非病毒载体E5/多聚赖氨酸/HA20/p21进行治疗，每星期注射二次，共注射四次，每次注射剂量为含50μg p21质粒DNA的载体用量。注射后三周，测量得瘤块体积为0.13+0.018cm3，计算抑制率达76％。该结果表明，E5/多聚赖氨酸/HA20/p21在活体内可显著地抑制肝癌细胞的生长。不含助剂HA20的三元复合体E5/多聚赖氨酸/p21也显示有抑制肝癌细胞生长的功能，而不含外源DNA p21的载体E5/多聚赖氨酸/HA20；HA20/多聚赖氨酸/p21；多聚赖氨酸/p21；单纯外源DNA p21都显示无抑制肝癌细胞生长的功能。本试验表明多肽E5于活体内能靶向性地将外源DNA介导入肝癌细胞，达到抑制肝癌细胞生长的目的。
由于助剂假型逆转录病毒可以包裹上述各种外源基因，因此，使本发明基因转移非病毒载体还可用于多基因联合治疗，有极大的潜在应用价值。
综上试验证实，本发明基因转移非病毒载体在肿瘤基因治疗中有广阔的应用前景，它能将外源DNA靶向性地导入活体外和活体内肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的。本发明也为进一步临床研究奠定了基础。
本发明优点本发明提供了一类能与细胞膜表面生长因子受体特异结合的合成多肽E5、GT6、GE7、GV8、GC9，进而构建了多肽/多聚阳离子/外源DNA三元复合体基因转移非病毒载体及多肽/多聚阳离子/助剂/外源DNA四元复合物基因转移非病毒载体。助剂的存在更能提高该类载体的转导效率。助剂采用与流感病毒外膜血凝素氨基端氨基酸序列同源的合成肽HA20或假型逆转录病毒，HA20可以以结合态或非结合态存在。
本发明基因转移非病毒载体能将外源DNA靶向性地导入活体外和活体内肿瘤细胞，达到抑制杀灭该肿瘤细胞，而周围正常细胞则不受影响的效果。利用该载体高效、靶向性地将外源DNA转移至肿瘤细胞的功能达到治疗肿瘤的目的。
本发明基因转移非病毒载体靶向性转移的外源DNA的大小范围可以从几十个碱基到几万个碱基，这就缓解了通常的病毒载体所运载的外源基因的大小限制。对可控性基因治疗，多基因联合治疗及长片段基因用于治疗时遇到的病毒载体难以包装的难题可以得到解决，又由于助剂假型逆转录病毒可以包裹上述各种外源基因，因此使得本发明非病毒载体可以靶向性地同时运载多个基因到相关的肿瘤细胞，起到多基因联合治疗效果，临床疗效将会大大优于单基因治疗，有着极大的潜在应用前景。
图1是多肽E5水解后氨基酸成份分析结果。
图2是多肽E5-多聚赖氨酸共价连接物的Sephadex G-50柱层析分离纯化的记录。
图3是多肽GT6-多聚赖氨酸共价连接物的Sephadex G-50柱层析分离纯化的记录。
图4是多肽GE7-多聚赖氨酸共价连接物的Sephadex G-50柱层析分离纯化的记录。
图5是多肽E5-多聚赖氨酸共价连接物水解后氨基酸成份分析结果。
图6是E5/多聚赖氨酸/含β-半乳糖苷酶基因的质粒DNA复合体的凝胶电泳图。
图7是肝癌细胞被导入β-半乳糖苷酶基因的质粒DNA的表达阳性结果。
图8是正常肝细胞中不被导入β-半乳糖苷酶基因的质粒DNA表达阴性结果。
图9是E5/多聚赖氨酸/HA20/含β-半乳糖苷酶基因的质粒DNA四元复合物基因转移非病毒载体的凝胶电泳图。
图10是E5/多聚赖氨酸/HA20/含细胞凋亡基因p15的质粒DNA四元复合物载体转染肝癌细胞引起细胞核破裂的结果。
本发明通过以下实施例作进一步阐述，但并不限止本发明的范围。
实施例1 多肽E5的合成采用美国ABI公司的多肽合成仪及按照其多肽合成操作手册，进行多肽E5合成，步骤简述如下1.固相合成多肽合成仪是以固相合成为手段，所用的载体树脂是ABI公司提供的PAM氨基酸树脂，每次合成所需氨基酸树脂的用量为0.5毫克分子，氨基酸每次用量为2毫克分子。按多肽E5氨基酸的设计序列，依次序加入各氨基酸的成份进行固相合成。
2.树脂裂介在固相合成得到肽-树脂后，进行脱树脂反应，采用ABI公司提供的1毫升TFMSA(三氟甲基磺酸)裂介液及10％TFA(三氟醋酸)、室温下搅拌2小时，过滤去树脂，用无水乙醚250ml将粗产物沉淀出，得300-350mg粗产物。
3.脱盐裂解得的粗产物中含有一定量的盐，采用Sephadex G10柱纯化，用0.1N冰醋酸洗脱，收集第一峰，浓缩、除去酸，用少量水溶解、冷冻干燥得干粉。
4.高压液相层析分离用ABI公司的C8反相柱(250mm长，10mm直径)在贝克曼420型紫外检测器进行，收集所需之峰，冷冻干燥，得干粉产物多肽E5。
实施例2 多肽GT6的合成除了按多肽GT6氨基酸的设计序列外，其余操作步骤同实施例1，得干粉产物多肽GT6。
实施例3 多肽GE7的合成除了按多肽GE7氨基酸的设计序列外，其余操作步骤同实施例1，得干粉产物多肽GE7。
实施例4 多肽E5水解及氨基酸成份分析取1μg多肽E5加到2ml安瓿瓶中，再加2ml经过重蒸的盐酸溶液(6N)，封口后置110℃烤箱中，进行封管酸水解24/小时后打破安瓿瓶，将酸水解液转移至小烧杯中，于沸水浴上蒸去盐酸。蒸干后，加少量蒸馏水，再次蒸发，重复3-4次，最后应用氨基酸测试仪进行氨基酸成份分析。结果见图1，图中显示多肽E5内的全部氨基酸成份(P除外，因脯氨酸在水解过程中被破坏)，结果证实合成的多肽E5完全符合设计要求。
实施例5 吡啶二硫多聚赖氨酸(polylysine-PDP)的制备2μg多聚赖氨酸溶于500μl 0.1M PBS(磷酸盐缓冲液)/0.1N NaCl pH7.5，向其中缓慢滴加200μl SPDP(N-Succinimyl-3-2-pyridyldithio propionate，20mM溶于无水乙醇)，室温下反应20分钟，经Sephadex G-25柱层析纯化，以去除游离的多聚赖氨酸及盐分，260nm检测，收集第一峰得到吡啶二硫多聚赖氨酸(约1000μl)。充氮气密封保存于4℃备用。
实施例6 含-SH多聚赖氨酸(polylysine-SH)的制备取polylysine-PDP 500μl加1M DTT(二硫苏糖醇PH4.5)12.5μl，室温下反应40分钟，经Sephadex G-50柱层析纯化，以NaAc缓冲液/0.1M Nacl pH5.2洗脱，收集第一峰，充氮气保存于4℃备用。
实施例7 吡啶二硫E5(E5-PDP)的制备将0.5mg E5溶于1ml 0.1M PBS/0.1M NaCl(PH7.5)。取其中100μl E5溶液，加100μl SPDP(20nM，溶于无水乙醇中)，于室温下反应30分钟，经Sephadex G-25柱层析纯化，得到E5-PDP，充氮气密封保存于4℃备用。
实施例8 E5-多聚赖氨酸共价连接物的制备取polylysine-SH及E5-PDP各500μl，混匀，于室温充氮气条件下反应20小时，然后置于透折袋，对水透折过夜，期间换水4次，即得E5-多聚赖氨酸共价连接物。
实施例9 E5-多聚赖氨酸共价连接物水解及其氨基酸成份分析取1μg E5-多聚赖氨酸加入2ml 6N HCl，于110℃水解过夜，实验步骤同实施例2，结果见图3，图中显示有水解产物赖氨酸及多肽E5内的全部氨基酸成份(P除外，因脯氨酸在水解过程中被破坏)。
实施例10 HA20-多聚赖氨酸共价连接物的制备取HA20 5.6μg溶于500μl 0.1M PBS(pH6.8)中，取多聚赖氨酸2μg溶于500μl 0.1M PBS(PH6.8)中，将二者混匀并加入2μl 25％戊二醛，室温下反应1小时，间断振荡，反应结束后，经Sephadex G-50柱层析纯化，260nm检测，收集第-峰，即得HA20-多聚赖氨酸共价连接物。4℃保存备用。与实施例9相同取1μg作氨基酸成份分析，以确定HA20与多聚赖氨酸连接情况，结果证实水介产物中含有HA20内的氨基酸成份及赖氨酸。
实施例11 含β-半乳糖苷酶基因的质粒DNA的提取与纯化含有氨苄青霉素的5ml培养基接入一含有β-半乳糖苷酶基因的质粒DNA的单菌落，37℃剧烈振摇下培养过夜。将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃以10,000转/分离心30秒。吸去培养液，使沉淀尽可能干燥。
将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。
溶液I50mM 葡萄糖25mM Tris-HCl(pH 8.0)10mM EDTA(pH 8.0)加入200μl新配制的溶液II0.2M NaOH(临用前用2N NaOH贮存液稀释)1％ SDS盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。
加150μl用冰预冷的溶液III(3M乙酸钾pH 4.8)，冰浴放置20分钟后，12,000转/分离心10分钟。上清液移至另一新的微量离心管，加等体积异丙醇，-20℃放置30分钟，12,000转/分离心10分钟，弃上清液，沉淀溶于含RNA酶(100μg/ml)的TE(三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸二钠)溶液中，37℃温育1小时，酚/酚-氯仿/氯仿抽提去除蛋白，离心后取水相，加1/10体积3M醋酸钠，2.5倍体积无水乙醇，-20℃放置30分钟后，12,000转/分离心10分钟，沉淀用70％乙醇洗涤，室温干燥后溶于TE溶液。
实施例12 E5/多聚赖氨酸/HA20/含β-半乳糖苷酶基因的质粒DNA/四元复合物载体的制备取10μg含β-半乳糖苷酶基因的质粒DNA溶于330μl 1×HBS(此为管A)。
HA20-多聚赖氨酸50μl加入盛有17μl 10×HBS的微量离心管中，然后再加E5-多聚赖氨酸20μl，加水补充体积至170μl(此管为B)。
将管B混合物缓慢滴加于处于剧烈振荡状态下的管A中，室温下静置30分钟。
即得E5/多聚赖氨酸/HA20含β-半乳糖苷酶基因的质粒DNA四元复合物载体。取30μl进行1％琼脂糖凝胶电泳给以证实(见图9)。
实施例13 E5/多聚赖氨酸/HA20/含β-半乳糖苷酶基因的质粒DNA四元复合物载体用于肝癌细胞及正常肝细胞的转染试验培养的肝癌细胞及正常肝细胞提前24小时消化并接种于50mm塑料培养皿中，第二天细胞满度约为60％。将制备好的E5/多聚赖氨酸/HA20/含β-半乳糖苷酶基因的质粒DNA四元复合物，经过0.22μm微孔滤膜过滤除菌，缓慢分别滴加于含肝癌细胞SMMC-7721及正常肝细胞L02的培养皿中，并加1.5-2.0ml含10％小牛血清的DMEM(Dulbecco modified Eagle′s medium)培养基，于5％CO2，37℃培养24小时后，更换新鲜培养液，继续培养48小时，然后进行化学染色。
将肝癌细胞及正常肝细胞分别以0.1M PBS(PH7.3)洗二遍，然后以0.2％的戊二醛于4℃固定5分钟，固定的细胞以0.1M PBS洗二遍，最后将X-gal溶液加入组织化学反应混合物中(5mM铁氰化钾/5mM亚铁氰化钾/2mM MgCl2)，使X-gal终浓度为1％，37℃过夜。第二天于光学显微镜下观察结果，结果显示仅在肝癌细胞中是有β-半乳糖苷酶基因的表达(见图7和图8)。
实施例14 含有细胞凋亡基因(p15或p21)的质粒DNA的提取与纯化分别将含有细胞凋亡基因(p15或p21)的质粒DNA的单菌落接入含有氨苄青霉素的5ml培养基，进行培养，再进行含有细胞凋亡基因(p15或p21)的质粒DNA的提取与纯化，步骤同实施例11。
实施例15 E5/多聚赖氨酸/HA20/含p15的质粒DNA四元复合物载体的制备取3μg含p15的质粒DNA溶于330μl HBS缓冲液中(20mM Hepes/15mM NaCl，PH7.5)，此为A管。
取HA20-多聚赖氨酸25μl(1.5μg)加入盛有17μl 10×HBS的微量离心管中，然后向其中加入14μl E5-多聚赖氨酸(约1.4μg)，加水补充体积至170μl，此为B管。
将B管混合物缓慢滴加于剧烈振荡状态下的A管中，室温下静置30分钟，即可得到E5/多聚赖氨酸/HA20/含p15质粒DNA/四元复合物载体。
实施例16 E5/多聚赖氨酸/HA20/含p21的质粒DNA四元复合物载体的制备A管中取3μg p21的质粒DNA，B管中取HA20-多聚赖氨酸15μl(0.9μg)，其余实验步骤同实施例15，即可得E5/多聚赖氨酸/HA20/含p21的质粒DNA四元复合物载体。
实施例17 E5/多聚赖氨酸/HA20/含p15的质粒DNA四元复合物载体转染的肝癌细胞萤光染色观察细胞核试验将制备好的E5/多聚赖氨酸/HA20/含p15的质粒DNA四元复合物载体转入体外培养的肝癌细胞及正常肝细胞，细胞培养72小时后，倾出培养液，以PBS缓冲液pH7.5，洗细胞一遍，室温下使残存在细胞表面的液体挥发掉。用丙酮固定细胞，再用PBS缓冲液，pH7.5，洗一遍。与萤光染料DAPI(0.5mg/100ml)在室温下反应2分钟进行染色，再用PBS缓冲液冲洗一遍，然后在萤光显微镜下观察，结果显示外源基因诱导的细胞程序性死亡—肝癌细胞中的细胞核的碎片及核浓缩，而正常肝细胞的细胞核则是完整的。
实施例18 E5/多聚赖氨酸/HA20/含p21的质粒DNA四元复合物载体用于荷人肝癌细胞的荷瘤裸鼠活体内生长抑制的试验。取已种好的裸鼠皮下肝癌细胞SMMC7721瘤块，分割成1.5mm3左右，用导管针筒皮下接种至六只五周龄裸鼠身上，一星期后，瘤块长至直径约为0.5cm3，开始给予E5/多聚赖氨酸/HA20/含p21的质粒DNA四元复合物非病毒载体介导的基因治疗。在裸鼠皮下瘤内进行注射，2次/星期，二星期共注射四次，每次注射的载体量为50μg p21质粒载体。注射后三周，拉颈处死动物，测量瘤体积为0.13±0.018cm3，计算得瘤块抑制率为76％。
权利要求
1.一种与生长因子受体结合的多肽所构建的基因转移载体，由配体/多聚阳离子/外源DNA/助剂组成，其特征在于它是由多肽/多聚阳离子/外源DNA/助剂组成的四元复合物非病毒载体。
2.如权利要求1所述的基因转移载体，其特征在于是助剂不存在情况下，由多肽/多聚阳离子/外源DNA组成的三元复合体非病毒载体。
3.如权利要求1所述的基因转移载体，其特征在于所述的多肽是与生长因子受体IGF-IIR，TGFR，EGFR，VEGFR，CSF-IR特异结合的多肽E5，GT6，GE7，GV8，GC9。
4.如权利要求2所述的基因转移载体，其特征在于所述的多肽是与生长因子受体IGF-IIR，TGFR，EGFR，VEGFR，CSF-IR特异结合的多肽E5，GT6，GE7，GV8，GC9。
5.如权利要求3所述的基因转移载体，其特征在于所述多肽E5的氨基酸序列为EPFRS PDLAL ETYG；多肽GT6的氨基酸序列为VPHSG YVGAR PHADL L；多肽GE7的氨基酸序列为NPVVG YIGER PQYRD L。
6.如权利要求4所述的基因转移载体，其特征在于所述多肽E5的氨基酸序列为EPFRS PDLAL ETYG；多肽GT6的氨基酸序列为VPHSG YVGAR PHADL L；多肽GE7的氨基酸序列为NPVVG YIGER PQYRD L。
7.如权利要求1、2、3、4、5、6所述的基因转移载体，其特征在于所述多肽中氨基酸序列同源率不大于50％。
8.如权利要求1、2、3、4、5、6所述的基因转移载体，其特征在于所述多肽中相应位点的氨基酸、可以用类似性能的氨基酸取代。
9.如权利要求1、2所述的基因转移载体，其特征在于所述的多聚阳离子是多聚赖氨酸或多聚精氨酸。
10.如权利要求1、2所述的基因转移载体，其特征在于所述的外源DNA是含反意癌基因，抗癌基因，自杀基因，细胞凋亡基因或细胞因子基因的真核重组表达载体。
11.如权利要求10所述的基因转移载体，其特征在于所述的反意癌基因包括癌基因的全基因反意基因及癌基因的部分DNA片段反意序列。
12.如权利要求10所述的基因转移载体，其特征在于所述的抗癌基因包括p53及Rb。
13.如权利要求10所述的基因转移载体，其特征在于所述的自杀基因包括HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)基因及CD(大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶)基因。
14.如权利要求10所述的基因转移载体，其特征在于所述的细胞凋亡基因包括p15，p16及p21。
15.如权利要求10所述的基因转移载体，其特征在于所述的细胞因子基因包括TNF(肿瘤坏死因子)基因，INF(干扰素)基因，IL(白细胞介素)基因。
16.如权利要求10所述的基因转移载体，其特征在于所述的真核重组表达载体包括病毒性真核重组表达载体逆转录病毒重组表达载体、腺病毒重组表达载体及以SV40、CMV的启动子为顺式调控元件的真核重组表达载体。
17.如权利要求1、2所述的基因转移载体，其特征在于所述的助剂是与流感病毒外膜血凝素氨基端氨基酸序列同源的合成肽HA20或假型逆转录病毒。
18.如权利要求17所述的基因转移载体，其特征在于所述的助剂HA20是以结合成多肽/多聚阳离子/HA20/外源DNA四元复合物载体的结合态存在。
19.如权利要求17所述的基因转移载体，其特征在于所述的助剂HA20是以HA20-多聚赖氨酸(或多聚精氨酸)共价连接物与多肽/多聚阳离子/外源DNA三元复合体载体一起以非结合态存在。
20.如权利要求17所述的基因转移载体，其特征在于所述的助剂HA20以单独的HA20与多肽/多聚阳离子/外源DNA三元复合体载体一起以非结合态存在。
21.如权利要求17所述的基因转移载体，其特征在于所述的助剂假型逆转录病毒与多肽/多聚阳离子/外源DNA三元复合体载体一起以非结合态存在。
22.如权利要求21所述的基因转移载体，其特征在于所述的助剂假型逆转录病毒可以是单噬性小鼠白血病病毒或多噬性小鼠白血病病毒。
23.如权利要求21所述的基因转移载体，其特征在于所述的助剂假型逆转录病毒所包裹的遗传物质可以包括以下外源基因自杀基因HSV-TK，CD；细胞凋亡基因p15，p16，p21；抗癌基因p53；细胞因子基因或不包含任何外源基因，即仅含有其自身缺损的遗传物质。
24.如权利要求1、2所述的基因转移载体，其特征在于它们是应用于肿瘤基因治疗的将外源DNA靶向性地导入活体外和活体内肿瘤细胞的基因转移非病毒载体。
全文摘要
一种与生长因子受体结合的多肽所构建的基因转移载体,它是多肽/多聚阳离子/助剂/外源DNA四元复合物载体或多肽/多聚阳离子/外源DNA三元复合体载体。筛选出与生长因子受体IGF－ⅡR、TGFR、EGFR、VEGFR、CSF－ⅠR特异结合的多肽E
文档编号A61K35/66GK1181422SQ9611655
公开日1998年5月13日 申请日期1996年10月31日 优先权日1996年10月31日
发明者顾健人, 滕青山, 任圣俊, 任常春, 田培坤 申请人:上海市肿瘤研究所