具有免疫调节作用的新肽的制作方法

专利名称：具有免疫调节作用的新肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及无抗原特异性的免疫调节，包括免疫抑制和免疫兴奋。具体地说，本发明涉及能够在哺乳动物体内诱导免疫调节应答的免疫调节肽及其治疗作用和应用。
背景技术：
当机能正常时，免疫系统保护个体免于感染和癌细胞生长。要发挥这些功能，免疫系统必须能够识别并反击侵入机体的外来抗原(包括癌特异性抗原)，但对机体正常细胞所带的自身抗原不发生作用。
刺激免疫系统有可能提高其防护水平。疫苗，包括象白喉类毒素这样的单蛋白抗原，被广泛用于对某种特异性抗原及其疾病产生免疫性。免疫系统的一般性刺激有时可用象佐剂、白细胞介素、干扰素和集落刺激因子这类非特异性抗原来产生。
有时，免疫系统失去了区别自身和异己这种重要能力。由此而导致的对于个体自身组织的免疫攻击会形成自身免疫病例如，红斑狼疮、I型糖尿病，或风湿性关节炎。在这种情况下，或当个体是组织或器官移植地受体时，人们希望的是免疫抑制而非免疫兴奋。
通常用皮质类固醇、硫唑嘌呤、环孢菌素、他利莫司(FK506)、雷帕霉素或麦考酚酸吗啉乙酯治疗可引起免疫应答的非特异性抑制。一些免疫球蛋白，包括单克隆抗体OKT3，也可用于这个目的。对一种特异性抗原的免疫抑制，又称“耐受诱导”，也是有可能发生的。已有许多方法用于诱导对于某一特定抗原的耐受，其中包括静脉内或重复性局部施用稀释的抗原、极高剂量抗原治疗法和口服抗原法。
EP635621描述了一种口服给药系统，它特别依赖于一种表面有一层正电性多糖薄膜的可胶凝的水状胶体，胶体内可掺入一种药物(肽)。
WO94/20136描述了一种在糊精复合物中引入药物活性肽的方法。该肽可作为受体激活剂、受体拮抗剂及疫苗。该方法表明，长度在3～20个氨基酸的肽大多数都不稳定，易丧失其生物活性。这些肽并未指明含有半胱氨酸残基。该方法指出糊精的应用提高了这些肽的稳定性。
EP566135描述了一种系统，以口服给药的方式，使与胞苷核苷酸衍生物相连接的肽作用于粘膜系。EP566135指出，当口服且没有某些保护或稳定性物质时，肽或蛋白会失去活性，同时还引述了许多专利申请，这些申请声称对于肽的口服的稳定问题提供了不同的解决方法。
患者的不适与采用注射法施用肽或蛋白有关，除此以外，实际使用的肽或蛋白的总量还可引起毒副作用。
目前已经发现，某些肽具有免疫调节剂的活性。一个与免疫调节活性相关的令人惊讶的性质是，该活性具有免疫抑制或免疫兴奋作用，在此和其它实验基础上，免疫调节活性已显示出对某些疾病具有治疗效果，例如癌症和关节炎。此外，还发现当通过口服作用于上皮细胞时，肽的作用与肿瘤生长的调节有关。一个更令人惊讶的发现是，口服本发明的“裸”肽无需附加的转运药剂。因此，本发明的肽不需要与传送载体(例如提高向内脏粘膜上皮细胞传送能力的泡状载运体系)这类转运药剂联合施用。另外还发现，要达到同样的疗效，口施用药的肽量要显著低于全身给药方式，例如肠胃外注射。
本发明的目的之一是提供一种用免疫调节肽治疗疾病的有效方法。
本发明的另一目的是提供可用于治疗疾病的免疫调节肽。
本发明的其他一些目的可从下列的描述和实施例中体现。发明概述
本发明提供了一种纯化的具有生理活性的肽，其至少包含两个半胱氨酸残基，这两个残基直接相连或被不多于一个氨基酸残基隔离，该肽可被哺乳动物上皮细胞吸收而导致免疫调节应答进而产生抗病疗效。
这些肽由分别具有下列侧链基团的氨基酸残基组成脂肪族侧链，脂肪羟基侧链，碱性侧链，酸性侧链，仲氨基基团，酰胺侧链和含硫侧链。本发明的肽必须具有生理活性，即它们必须能够诱导一种免疫调节应答进而产生抗病疗效。适宜的氨基酸可独立地选自天然和非天然的氨基酸。天然氨基酸残基的实例包括Ile、Leu、Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Met、Val和His。因此，本发明的肽可包含附加的半胱氨酸残基，其既可相邻又可远离上文所提及的至少两个半胱氨酸残基。技术人员知道，天然氨基酸残基就是指那些存在于活体组织的肽和/或蛋白质中的氨基酸。技术人员也知道，这些天然氨基酸残基可以化学修饰的形式出现于本发明的肽中，这些化学修饰包括加入诸如乙基、三苯甲基(Trt)、烯丙基、叔丁基等在内的保护基团。技术人员应该知道，任何出现于本发明的肽中的保护性基团基本上不会干扰其免疫调节性质，因而对其治疗效果无碍。
本发明的纯化肽可人工合成，如通过化学方法，或用DNA重组技术获得。或者，本发明的肽可从多肽或蛋白质等分离。
本发明的肽由两个相同或不同的肽单体通过二硫键结合成二聚体，第一肽与第二肽单体都包含至少两个半胱氨酸残基，第一肽单体的至少一个半胱氨酸残基通过二硫键与第二肽单体的至少一个半胱氨酸残基连接。一方面，这些肽通过二硫键彼此连接，即第一肽单体的至少两个半胱氨酸残基通过二硫键与第二肽单体的至少两个半胱氨酸残基连接。本发明的二聚体可为平行形式，这两个肽单体彼此平行排列，使得两肽都可从一个方向读出，例如从N-末端到C-末端。形成二聚体的肽单体长度可相同或不同。优选方案为，两肽长度相同，且一种单体的N-和C-末端氨基酸残基相邻于第二条肽单体的N-和C-末端氨基酸残基。或者，本发明的二聚体可反平行排列。也就是说，自N-末端到C-末端阅读的第一单体与自C-末端到N-末端阅读的第二单体对应排列，即第二单体为第一肽单体的反方向；按上述描述，本发明的平行或反平行二聚体是通过二硫键将两个肽单体的半胱氨酸残基相连接。当形成本发明的肽二聚体的两个肽单体彼此不同时，该二聚体被称为异二聚体。异二聚体可以是平行或反平行形式。因此，异二聚体可以由两个同样长度的肽单体组成，例如，两肽可因L-型氨基酸残基被D-型氨基酸残基替换而不同。另外，构成二聚体的肽单体可以有不同的长度。优选地，形成本发明二聚体的第一肽和第二肽应完全相同。
本发明的肽也包括这样的单体，其中至少两个连续或间隔排列的必需半胱氨酸残基通过二硫桥连接。这些单体可为链状或环状。优选地，单体应为链状。
此处的实施例表明，施用本发明的肽，例如口服，气管内、鼻腔或肠胃外给药，会产生明显的免疫调节应答。
“上皮细胞层”定义为覆盖于机体内表面和外表面(包括管系和其他小腔)的细胞层及其相关细胞。对于本发明而言，上皮细胞为至少一层和至多层细胞层。“上皮细胞层”这一范畴还包括特化的淋巴组织和其他细胞，即那些位于上皮细胞层中或与之相关的、对免疫应答有影响的细胞，例如T-淋巴细胞、B-淋巴细胞、肠细胞、NK-细胞、单核细胞、树突细胞和包含与粘膜相关的淋巴组织(MALT)在内的细胞，如集合淋巴结等。因此技术人员知道，所谓的游移细胞。如属于上述的上皮细胞层中的I-淋巴细胞和B-淋巴细胞这样的短暂停留细胞，也属于上皮细胞的范畴。本发明的肽可被上皮细胞层主动或被动吸收。例如，肽可被细胞表面吸收，或被位于上皮细胞层内表面的的细胞主动或被动吸收，还可从上皮细胞内表面的细胞间穿过而被位于上皮细胞层更深处的细胞吸收，如T-淋巴细胞或集合淋巴结。技术人员知道，此处所指的“吸收”包括这样的情况，即本发明肽无需物理性穿透上皮细胞，其通过与膜内或膜上的细胞表面受体作用而引发免疫应答，这些细胞为位于上皮细胞内的某些特化细胞，如肠细胞和内皮淋巴细胞。因此，可以理解，本发明的肽可以作用于上皮细胞层，结合于上皮细胞层，通过或穿透上皮细胞层。
本发明肽的优选施用法为以口服剂、鼻用药剂或气管内制剂方式进行口腔、鼻腔或气管内给药。已发现，要达到某一疗效，口腔给药时本发明肽的用药量明显低于其他的用药方式，如肠胃外给药。
一方面，本发明提供了一种包含一种免疫调节肽的口服剂，该肽包含至少两个半胱氨酸残基，这两个残基直接相连或被不多于一个氨基酸残基隔离，并被哺乳动物消化道上皮细胞层吸收而导致免疫调节应答进而产生抗病疗效。该肽可以是单体或二聚体。
另一方面，本发明提供了一种包含至少一种免疫调节肽的口服剂，这些肽都包含至少两个半胱氨酸残基，这两个残基直接相连或被不多于一个氨基酸残基隔离，且这些肽中至少一种被哺乳动物消化道上皮细胞吸收而导致免疫调节应答进而产生抗病疗效，其中，要在某一哺乳动物体内产生一同样显著的免疫调节应答，至少一种口服肽的用量低于肠胃外给药时该药的至少一种肽的用量。
另一方面，本发明提供了一种鼻用药剂形式的免疫调节肽，它包含至少两个半胱氨酸残基，这两个残基直接相连或被不多于一个氨基酸残基隔开，并被哺乳动物鼻腔通道上皮细胞吸收而导致免疫调节应答进而产生抗病疗效。
另一方面，本发明提供了一种包含至少一种免疫调节肽的鼻用药剂，这些肽都包含至少两个半胱氨酸残基，这两个残基直接相连或被不多于一个氨基酸残基隔开，且这些肽中至少一种被哺乳动物鼻腔通道上皮细胞吸收而导致免疫调节应答进而产生抗病疗效，其中，要在某一哺乳动物体内产生一同样显著的免疫调节应答，至少一种鼻用药剂肽的施用量低于肠胃外给药时该药的至少一种肽的施用量。
另一方面，本发明提供了一种包含一种免疫调节肽的气管内制剂，该肽包含至少两个半胱氨酸残基，这两个残基直接相连或被不多于一个氨基酸残基隔开，并被哺乳动物肺部上皮细胞吸收而导致免疫调节应答进而产生抗病疗效。
另一方面，本发明提供了一种包含至少一种免疫调节肽的气管内制剂，这些肽都包含至少两个半胱氨酸残基，这两个残基直接相连或被不多于一个氨基酸残基隔开，且这些肽中至少一种被哺乳动物肺部上皮细胞吸收而导致免疫调节应答进而产生抗病疗效，其中，要在某一哺乳动物体内产生一同样显著的免疫调节应答所需的至少一种气管内制剂的肽的用量低于肠胃外给药时该药的至少一种肽的用量。
本发明的肽可为任意长度，只要它们能够诱导免疫调节应答并具治疗效果。通常，本发明的肽为4～30个氨基酸残基的短肽。优选地，肽的长度应为4～约20个氨基酸残基。更优选地，本发明的肽为4～15个氨基酸残基长度(例如4～10或4～9)，而4～7个氨基酸长度为最优选。例如，肽可为4、5、6、7或8个氨基酸长度，具有或不具保护性基团。
本发明的肽可以与此处所指的转运药剂结合，也可不结合。优选地，本发明的肽是以“裸露”形态施用，即无需附加的转运药剂。附加的转运药剂是指这样一类物质，即在施用前、施用时或施用后，可与本发明的肽有意识地接触或结合，从而促进肽的吸收和/或增加肽的稳定性。
因此，更进一步，本发明提供了一种纯化的无需附加的转运药剂的生理活性肽，该肽长度为4～15个氨基酸残基，包含至少两个半胱氨酸残基，这两个残基直接相连或被不多于一个氨基酸残基隔开，该肽被哺乳动物上皮细胞层吸收而产生免疫调节应答进而产生抗病疗效。该肽可为单体，或由相同或不同的肽组成的二聚体。
本发明的适宜的肽将以下列通式描述
通式(I)
(A)n-X-Cys-Cys-Y-(B)m(I)
其中
每个A独立地选自H，一个保护基团如乙基、三苯甲基(Trt)，烯丙基和叔丁基，或至少一个氨基酸残基，它独立地选自具有下列侧链基团的氨基酸残基脂肪族侧链，脂肪羟基侧链，碱性侧链，酸性侧链，仲氨基基团，酰胺侧链，芳香侧链和含硫侧链；
n是一个选自1～11的整数；
X选自NH和具有下列侧链基团的氨基酸残基仲氨基基团，酰胺侧链和脂肪族侧链。优选地，X应选自Gly、Pro、Gln、Ile、Val、Asp、Leu、Glu、Ala或NH。
Y选自NH和具有下列侧链基团的氨基酸残基仲氨基基团、脂肪族侧链、酸性侧链、脂肪羟基侧链、芳香侧链和酰胺侧链。优选地，Y应选自Pro、Gly、Leu、Glu、Val、Ile、Ser、Phe、Tyr、Thr、Asp、Gln或NH；
每个B独立地选自包括H，OH，NH2，一个保护基团如乙基、三苯甲基(Trt)、烯丙基或叔丁基，或至少一个氨基酸残基，它独立地选自具有下列侧链基团的氨基酸残基脂肪族侧链，脂肪羟基侧链，碱性侧链，酸性侧链，仲氨基基团，酰胺侧链，芳香侧链和含硫侧链；
m是一个选自1～11的整数；
条件是当A不是至少一个氨基酸残基时n为1，当B不是至少一个氨基酸残基时m为1；整个肽链包含不超过15个氨基酸残基。
当A和/或B代表一个氨基酸残基或一个氨基酸残基序列时，此氨基酸残基或残基序列可包含天然氨基酸残基，例如上述的氨基酸残基或其类似物，也可包含非天然氨基酸残基，如人工合成的氨基酸残基和其类似物，亦可同时包含天然氨基酸残基和/或其类似物与非天然氨基酸残基和/或其类似物。
技术人员知道，属于通式(I)范畴中的肽，其分子间的二硫桥出现于两半胱氨酸残基之间。这种肽代表了通式(I)肽的氧化形式。显然，通式(I)的肽可为平行或反平行排列的同二聚体或异二聚体。这些同二聚体或异二聚体由通式(I)中的单体肽构成，并通过半胱氨酸残基由二硫键连接。
亦属于本发明范畴的是通式(I)肽的药用盐或其生理功能衍生物，以及其药用载体。
依照通式(I)，本发明的优选肽如下
X是Gly，Y是Gly；
X是Pro，Y是Pro；
X是Pro，Y是Val；
X是Ile，Y是Leu；
X是Pro，Y是Glu；
X是Glu，Y是Tyr；
X是Pro，Y是Phe；
X是Glu，Y是Phe；
X是Ala，Y是Val；
X是Val，Y是Ile；
X是Gln，Y是Ser；
X是Ile，Y是Thr；
X是Leu，Y是Asp；
X是Asp，Y是Ile；
X是Leu，Y是Gln；
X是Gly，Y是Asn；
X是Gly，Y是Pro；或
X是Ala，Y是Gly；
其中A和B按上述定义。
依据本发明的通式(I)，其它的更优选肽为
Gly-Pro-Cys-Cys-Pro-Gly；
Ala-Pro-Cys-Cys-Val-Pro；
Lys-Pro-Cys-Cys-Glu-Arg；
Pro-Asp-Cys-Cys-Ile-Pro；
Ac Ala Pro Cys Cys Val Pro；
Arg Cys Ser Gly Cys Cys Asn；
Pro-Gly-Cys-Cys-Gly-Pro；
Pro-Gly-Cys-Cys-Gly-Pro；
Gly-Pro-Cys-Cys-Pro-Gly；
Trp-Pro-Cys-Cys-Pro-Trp；
Val-Ile-Cys-Cys-Leu-Thr；
Thr-Pro-Cys-Cys-Phe-Ala；
Glu-Glu-Cys-Cys-Phe-Tyr；
Lys-Leu-Cys-Cys-Asp-Ile；
Lys-Glu-Cys-Cys-Tyr-Val；
Ala Pro Cys Cys Glu Ser；
Pro Ala Cys Cys Gly Pro；
Pro Gly Cys Cys Gly Pro
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Pro Gly Cys Cys Gly Pro
依据本发明的通式(I)，其它的更优选肽为
Gly-Pro-Cys-Cys-Pro-Gly；
Pro-Gly-Cys-Cys-Gly-Pro；
Ala-Pro-Cys-Cys-Val-Pro；
Lys-Pro-Cys-Cys-Glu-Arg；
Arg Cys Ser Cys Cys Asn；
Gly-Pro-Cys-Cys-Pro-Gly；
Pro-Gly-Cys-Cys-Gly-Pro；
Val-Ile-Cys-Cys-Leu-Thr；
Pro Ala Cys Cys Gly Pro；
Pro Gly Cys Cys Gly Pro
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Pro Gly Cys Cys Gly Pro
应当理解，上述肽中分别位于C-末端和N-末端的氨基酸残基不包含修饰。
通式(II)
(A)n-X-Cys-Z-Cys-Y-(B)m(II)
其中
每个A独立地选自H，一个保护基团如乙基、三苯甲基(Trt)、烯丙基或叔丁基，或至少一个氨基酸残基，它独立地选自具有下列侧链基团的L-型或D-型氨基酸残基脂肪族侧链，脂肪羟基侧链，碱性侧链，酸性侧链，仲氨基基团，酰胺侧链，芳香侧链和含硫侧链；
n是一个选自1～10的整数；
X选自NH和具有以下侧链基团的氨基酸残基脂肪族侧链，仲氨基基团，酸性侧链，芳香侧链，酰胺侧链。优选地，X应选自Gly、Pro、Gln、Ile、Val、Asp、Leu、Glu、Ala、Lys或NH；
Z选自具有脂肪族侧链，脂肪羟基侧链，碱性侧链的氨基酸残基。优选地，Z选自Ile、Gly、Thr、Ala和Lys。
Y选自具有以下侧链基团的氨基酸残基酰胺侧链，碱性侧链，脂肪族侧链，酸性侧链和仲氨基基团。优选地，Y选自Pro、Gly、Glu、Val、Gln和Arg；
B独立地选自包括H、OH、NH2，一个保护基团如乙基、三苯甲基(Trt)、烯丙基或叔丁基，或至少一个具有下列侧链基团的氨基酸残基脂肪族侧链，脂肪羟基侧链，碱性侧链，酸性侧链，仲氨基基团，酰胺侧链，芳香侧链和含硫侧链；
m是一个选自1～10的整数；
条件是当A不是至少一个氨基酸残基时n为1，当B不是至少一个氨基酸残基时m为1；每条肽链包含不超过15个氨基酸残基。
对于通式(I)，显然，当A和/或B代表一个氨基酸残基或一个氨基酸残基序列时，此氨基酸残基或残基序列可包含天然氨基酸残基，例如上述的氨基酸残基或其类似物，也可包含非天然氨基酸残基，如人工合成的氨基酸残基和其类似物，亦可同时包含天然氨基酸残基和/或其类似物与非天然氨基酸残基和/或其类似物。
技术人员知道，属于通式(II)范畴中的肽，其分子间的二硫桥出现于两个连续排列或隔开开的半胱氨酸残基之间。这种肽代表了通式(II)肽的氧化形式。
技术人员同样知道，通式(II)的二聚体可为平行或反平行排列，也可包含异二聚体，通过二硫键与两单体的半胱氨酸残基连接。亦属于本发明范畴的是，通式(II)肽的药用盐或其生理功能衍生物，及其药用载体。
依照通式(II)，本发明的优选肽如下
Val Cys Ile Cys Gln；
Val Cys Gly Cys Arg；
Asp Cys Ile Cys Gln；
Ile Cys Thr Cys Glu；
Phe Cys Ile Cys Lys；
Ala Cys Lys Cys Gln；
Lys Cys Arg Cys Lys；
Ile Cys Thr Cys Glu；
Leu Cys Ala Cys Val；
Asp Cys Ile Cys Gln；
Gly Pro Cys Ile Cys Pro Gly
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Gly Pro Cys Ile Cys Pro Gly；
Val Cys Gly Cys Arg
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Val Cys Gly Cys Arg.
本发明的肽可与转运药剂一起使用，或不需转运药剂。优选地，本发明的肽可以无需附加的转运药剂而由口腔、气管内、鼻腔、或机体施用。更优选地，本发明的肽应由气管内、鼻腔、或口腔施用。最优选地，本发明的肽应口腔施用。“转运药剂”包括传送的附加手段，如泡状传送、微粒、脂质体等系统，这些方法用于将药物(例如肽)运送到上皮细胞或内皮细胞。“转运药剂”也包括化学药剂或附加的肽段，它们与药物肽发生耦联、融合或与之混合，并有助于维持本发明肽段的生理学活性，例如以预前肽或前肽形式提供肽、将肽与载运蛋白(如葡萄糖基转移酶)融合、或与化学药剂如环状糊精等混合。优选地，本发明的肽以自由肽形式与常规佐药、赋形剂和药物制剂中常用的稀释剂一起施用。因此，本发明的肽可以以简单的口腔或全身制剂形式由口腔或全身给药，这些制剂包含口腔和全身药剂通常采用的佐剂、稀释药和赋形剂。优选地，该肽以口服剂形式施用，无需附加的转运药剂。
已发现粘膜相关的淋巴组织(MALT)也存在于消化道的上皮细胞，即食道、胃、十二指肠、回肠和结肠；肺部的支气管系；和鼻腔通道的表层。虽然理论上尚未证实，但具认为本发明的肽可与MALT作用并导致一系列免疫调节应答从而对某些疾病起治疗作用。
免疫调节应答在功效上可以是免疫抑制或免疫兴奋。已有迹象显示免疫应答可用于治疗癌症。现已表明，在对起源于间充质的癌症如肉瘤的治疗中，具有免疫调节作用的本发明肽有优势，例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤或脊椎肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜肉瘤或间皮肉瘤；白血病和淋巴瘤如粒细胞白血病、单核细胞白血病、淋巴细胞白血病、恶性淋巴瘤、浆细胞瘤、网状组织细胞肉瘤或何杰金氏病；肉瘤如平滑肌肉瘤或横纹肌肉瘤、上皮细胞肿瘤如鳞状上皮癌、基底细胞癌、汗腺癌、皮脂腺癌、腺癌、乳头状腺癌、乳头状腺瘤、囊腺癌、髓样癌、未分化癌、支气管癌、黑素瘤，肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、胆管腺癌、乳头状癌、转移细胞癌、绒毛膜癌、semonoma或胚胎瘤；及中枢神经系统肿瘤如神经胶质瘤、脑膜瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤或室管膜瘤。本发明肽依其活性可用于治疗恶性肿瘤如黑素瘤、乳癌、胃肠道癌如结肠癌、神经胶质瘤、膀胱癌、头颈部鳞状上皮癌。而且，产生免疫调节作用的上述肽可治疗与自身免疫疾病相关的急性和/或慢性感染，如无肥胖的糖尿病、全身性红斑狼疮、韧带硬化、斯耶格伦综合症、皮肌炎或多发性硬化、风湿性关节炎、动脉硬化，和牛皮藓、哮喘、鼻炎、纤维化、慢性支气管炎、肝炎、感染后无反应症、获得性免疫缺损症如AIDS、以及创伤后免疫无反应症。
此外，依据本发明，这些具有免疫调节作用的肽作为佐剂非常有益，可应用于各种疫苗制剂和抑制移植器官排异的制剂。
另一方面，本发明提供了一种在哺乳动物体内诱导免疫调节应答的方法，该方法包括将纯化的具有生理活性和免疫调节作用的药物肽作用于哺乳动物上皮细胞层，这种肽包含至少两个半胱氨酸残基，这两个残基直接相连或被不多于一个氨基酸残基隔开，并能够诱导上述免疫调节应答进而产生抗病疗效。
再一方面，本发明提供了一种在哺乳动物体内诱导免疫调节应答的方法，其包括1)确定需要调节其免疫应答的一种哺乳动物，2)将纯化的具有生理活性的药物肽作用于哺乳动物至少一种上皮细胞，该肽无需附加的转运药剂，具有4～15个氨基酸残基，并包含至少两个半胱氨酸残基，这两个残基直接相连或被不多于一个氨基酸残基隔开，并能够诱导上述免疫调节应答进而产生抗病疗效。优选地，消化道上皮细胞层为肽的作用对象。最优选地，肽应作用于MALT。
更进一步地，本发明提供了一种在哺乳动物体内诱导免疫调节应答的方法，此方法包括将通式(I)的具有生理活性剂量的肽作用于哺乳动物MALT，该肽无需附加的转运药剂，并能够诱导上述免疫调节应答进而产生抗病疗效。该肽可以是单体或二聚体。
更进一步地，本发明提供了一种在哺乳动物体内诱导免疫调节应答的方法，此方法包括将通式(II)的具有生理活性剂量的肽作用于哺乳动物MALT，该肽无需附加的转运药剂，并能够诱导上述免疫调节应答进而产生抗病疗效。该肽可以是单体或二聚体。
进一步地，本发明提供了长度为4～15个氨基酸残基的生理活性肽在药剂制备中的应用，该肽包含至少两个半胱氨酸残基，这两个残基直接相连或被不多于一个氨基酸残基隔开，且无需附加的转运药剂。本发明肽可用于治疗以上例举的一些特殊形式的癌症。进一步，本发明提供了通式(I)具有生理活性且无需附加的转运药剂的肽在药剂制备中的应用，特别是对癌症和风湿性关节炎。同样，本发明提供了通式(II)具有生理活性且无需附加的转运药剂的肽在药剂制备中的应用，特别是对癌症和风湿性关节炎。
本发明的另一实施方案中提供了通过化学过程生产本发明肽的方法，在此法中单个氨基酸残基或本发明的肽段通过肽键连接，并在此过程的开始和/或结束时加入保护性基团。
本发明的另一实施方案中，作为本发明的可选方面，提供了可用于治疗的无需附加的转运药剂的生理活性肽，该肽长度为4～15个氨基酸残基，包含至少两个半胱氨酸残基，这两个残基直接相连或被不多于一个氨基酸残基隔开，该肽可治疗如癌症和风湿性关节炎。更者，本发明提供了可用于治疗例如癌症或风湿性关节炎的通式(I)或通式(II)的肽。
在治疗癌症或风湿性关节炎过程中，通式(I)或通式(II)的肽的施用量显然会不同，这一点医生或兽医应始终慎重考虑。要考虑的因素包括要治疗的疾病状况、用药途径、药剂性质、体重、表面积、年龄、一般条件和所施用的特殊肽。本发明肽的适宜的有效剂量按体重一般约为0.0001μmol/kg至1000μmol/kg，优选地，按体重约为0.003μmol/kg至300μmol/kg，例如在约0.001μmol/kg至100μmol/kg范围内，例如，0.03μmol/kg至3.0μmol/kg。总剂量可以是一次或多次用药量，如每天2～6次。例如，对于一个75公斤的哺乳动物(如人)，用药量约2.25μmol/kg/天至225μmol/kg/天，通常肽的剂量为100μmol。如果是多次施用，本发明肽的服法通常为每天至多4次，每次25μmol。本发明肽也可隔天施用或每周一至两次。当然，合适的施用方法应在医生或兽医的指导下进行。
虽然活性肽可以单独施用，但将其制成药剂则更好。本发明的制剂包含通式(I)或通式(II)的肽或其盐，和一种或数种合适的药用载体，以及其它一些任选的治疗成分。这些载体应是药物学可接受的，即与制剂的其它成分相容并基本上对患者无害。显然，上述肽的游离酸加成盐(如卤酸盐)及碱盐都属于本发明范畴。最优选地，这些盐是药物学可接受的。
适合的酸性附加盐由下列物质形成盐酸、氢溴酸、硝酸、高氯酸、磺酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、苯甲酸、谷氨酸、草酸、天门冬氨酸、丙酮酸、醋酸、琥珀酸、延胡索酸、草酸、羟乙基磺酸、硬脂酸、酞酸、甲烷磺酸、甲苯磺酸、乳糖酸和葡萄糖醛酸。合适的碱盐包括无机碱盐如碱金属(如钠和钾)盐和碱土金属(如钙)盐；有机碱盐如苯基乙基苄胺、二苄基乙二胺、乙醇胺和双乙醇胺盐；和氨基酸盐如赖氨酸和精氨酸盐。最优选地，这些盐是药物学可接受的。
因而，本发明进一步提供了一种药剂，其包含通式(I)或通式(II)的肽及合适的药用载体。
自然，任何包含通式(I)肽的药学制剂可以包含不止一种通式(I)的肽。因此，一种药学制剂可以包含至少两种通式(I)或(II)的肽，或一种通式(I)或(II)的肽的混合物。换言之，该药剂可包含至少两种肽，其中至少一种选自通式(I)并且至少一种选自通式(II)，并可包含选自通式(I)或(II)的肽的混合物。
本发明还提供了一种药剂的制备方法，其包括将本发明的肽，例如至少一种通式(I)的肽和/或至少一种通式(II)的肽或它们的生理功能衍生物，与一种合适的药学载体耦联。
本发明的肽及其生理功能衍生物在合适的治疗条件下可以通过任何途径施用，这些途径包括口腔、气管内、直肠、鼻腔、局部(包括颈部和舌下)、阴道和肠外(包括皮下、肌肉、静脉、真皮内、鞘内、腹膜内和硬膜外)。应注意，用药途径会因例如病人的状况而变化。优选制剂为适于口腔、鼻腔或气管内施用的制剂。最优选剂型为适于口腔施用的制剂。
在口腔局部施用的制剂包括糖锭，其包含处于通常为蔗糖、金合欢胶和黄蓍胶一类的香味基质中的肽；锭剂，其包含处于诸如明胶和甘油、或蔗糖和金合欢胶一类惰性基质中的活性成分；漱口药，其包含肽及合适的液体载体。
适于口服的本发明制剂可为分立单位，如胶囊、扁形胶囊剂，片剂、含有肽和通常为蔗糖、金合欢胶和黄蓍胶一类香味基质的糖锭；含活性成分及诸如明胶和甘油、或蔗糖和金合欢胶一类惰性基质的锭剂；含有活性成分及合适液体载体的漱口药。每种制剂一般包含确定剂量的活性肽，以粉末或颗粒、水性或非水性的溶液或悬液如糖浆、配剂、乳剂或饮剂等形式存在。
片剂可由压挤或铸模生产，并可任选一种或多种辅助成分。压制的片剂可用适当的机器将非流质形态(如粉末或颗粒)的活性肽压挤而成，并可任意与下列物质混合结合剂(例如聚乙烯吡咯烷酮、明胶、羟丙甲基纤维素)，润滑剂、惰性稀释剂、保存剂、分散剂(例如淀粉、羟乙酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、羟甲基纤维素钠)，表面活性或弥散剂。铸模的片剂可用适当的机器将惰性液体稀释剂调配的肽铸模而成。该片剂可任选涂层或刻痕，这样可使药物在使用过程中缓慢或可控释放其活性成分，例如，羟丙甲基纤维素以不同的比例释放所要求的剂量。
糖浆可由活性肽加入浓缩的糖的水溶液而制成，例如蔗糖，也可加入其它的必需成分。这类必需成分可包含香料，防止糖结晶的药剂或能促进其它成分溶解的药剂，例如象甘油或山梨醇一类的多羟基醇。
除了上述的成分外，本发明的制剂还可包含一种至数种下列成分稀释剂、缓冲剂、香料、结合剂、表面活性剂、增稠剂、润滑剂、保存剂(包括抗氧化剂)等。
对本发明制剂适用的乳化剂和乳液稳定剂包括吐温60、斯潘80、鲸十八烷酰基醇、单硬脂酸、甘油酯和月桂磺酸钠。
选择适于本制剂的油或脂应基于要获得的治疗性质，因为对于大多数药物乳剂常用的油，活性化合物的溶解度很低。因此脂油最好应为无油腻、无污染和可洗的物质，具有适当的强度以防止从管状或其它容器中泄漏。可用的为直链或具有分支链的、单盐或二盐烷基酯如二异己二酸酯、异十六烷硬脂酸酯、可可酸乙二醇丙烯酯、异丙基肉豆蔻酯、癸基油酸酯、棕榈酸丙酯、硬脂酸丁酯、2-乙基己基棕榈酸酯或一种被称为CrodamolCAP具有支链的酯的混合物，后三种为优选酯。根据所需性质，它们可单独或混合使用。另外，高熔点脂如白凡士林和/或液状石蜡或其它矿物油也可使用。
直肠施用的制剂可制成任何适宜的形式，例如具有合适基质的栓剂，其包含本发明肽与中性脂基(如可可油)的混合物，或者与水杨酸盐的混合物；或者制成溶液或悬液的形式。另外，胶状直肠胶囊制剂包含本发明的活性肽与植物油或石蜡油之混合物。
适合鼻腔给药、载体为固体的制剂包括粗粉末，例如颗粒大小为20～500微米范围。当颗粒大小从根本上取决于颗粒状的活性物质时，颗粒大小应在2～500微米之间。粗粉末制剂施用法为，将装有粉末的药瓶靠近鼻子并快速吸入呼吸道。载体为液体的制剂，如适于鼻腔喷雾或鼻腔点滴的制剂，包括该活性成分的水性或油性溶液。因此，本发明肽可制成加压的定量的吸入剂或干粉吸入剂，用于口腔或鼻腔摄入，或制成液剂用于喷雾。活性肽被微细化或处理成颗粒，其大小要适合于吸入治疗(总平均直径＜10μm)。
作为加压的定量的吸入剂，微细化的肽可悬浮于一种液体喷射剂或液体喷射剂的混合物。这种喷射剂也可作为溶剂，但并非必须。另外，微细化的肽还可装入具有如一定规格的瓶中。
合适的喷射剂包括那些在此领域常用的如氢氟烷烃(HFA)。HFA喷射剂可制成任何适于将本发明肽送至MALT的混合物。用于本发明的合适的HFA实例包括四氟乙烷(如喷射剂134a(Hoechst))和七氟丙烷(如喷射剂227(Hoechst))。自然，很明显这类制剂还可包含适当浓度的表面活性剂，例如三油酸脱水山梨糖醇、卵磷脂、油酸等，表面活性剂的使用可增加肽制剂的物理稳定性。该制剂也可含有溶剂如乙醇，以提高肽在所选喷射剂中的溶解度。
本发明的活性肽可通过适于干粉吸入的呼吸设备吸入，如便携式呼吸器等。在这些干粉制剂中，本发明的活性肽可单独使用，或与诸如乳糖、甘露醇或葡萄糖之类的载体结合使用。载体的选择不是很严格，只要其基本无损于本发明肽的生理作用。粉剂还可包括其它一些添加剂，以例如保持稳定性等。再者，这些添加剂应基本不与本发明肽的生理及治疗作用相抵触。呼吸设备可为现有的任何一种形式，如具有确定剂量的单剂量吸入器或多剂量吸入器，其剂量可通过测量刻度来计算或由确定剂量的包装决定。
适于肠胃外施用的制剂适宜地包含活性混合物的无菌水制剂，它应优选地与受者的血液等渗。这类制剂适合包含一种本发明肽的药物学和药理学可接受的酸加成盐溶液，并与受者血液等渗。
适用的制剂包括含有本发明肽的浓缩溶液或固体，用合适的溶剂稀释可制成上述适于肠胃外施用的溶液。
本发明将通过下列非限制性实施例给以阐述。
1.肽的合成
需明确的是，在此处的本发明肽当未指明其N-和C-末端基团时，N-末端为氨基形式(NH2)，C-末端为羧基形式(-COOH)。
下列实施例中的肽采用与表1相同的编号方式，表1显示了实施例43的结果。
实施例1Pro-Gly-Cys-Cys-Gly-Pro的合成
用于本合成过程的是Fmoc-嘌呤，其连接于一种由具有聚乙二醇支链的交叉连接的聚苯乙烯主链组成的树脂(1.11g，0.18mmol/g，0.20mmol)，并与Rapp Polymer公司的连接物p-羧基-三苯甲烷联合使用(Sheppard，R.C.，Williams，B.J.用于固相肽合成的对酸不稳定的树脂连接剂，国际肽、蛋白研究杂志，1982，20，451-454)。Nα-Fmoc-保护的L-氨基酸五氟苯购自Bachem公司和Millipore公司，Cys由一个三苯甲烷(Mrt)基团保护。肽药剂品质的DMF和20％哌啶/DMF购自Millipore。连接剂1-酚三唑(HOBT)来自Fluka公司。合成过程在Millipore公司的9050+型肽合成器中进行。
C-末端氨基酸、挂于树胶的Tentagel S trt-Pro-Fmoc(1.11g，0.18mmol/g，0.20mmol)(来自Rapp Polymer公司)在DMF中浸泡30分钟，然后向合成器中加入浆料。合成器不断工作于解封闭、清洗和耦联过程，每一循环8分钟，在每个Fmoc-解封闭过程加入20％哌啶/DMF，并用HOBT(0.9mmol)活化Nc-Fmoc-保护的L-氨基酸五氟苯酯(0.8mmol)。将活化的氨基酸加入合成室并每次循环30分钟。合成器中止合成过程时，对N-末端的Fmoc-基团解封闭并用DMF进行最终清洗。合成于树脂上的肽被转移至烧结的玻璃漏斗中，用MeOH(2×10ml)清洗两次，并用CH2Cl2(3×10ml)清洗三次。树脂于真空中干燥过夜，然后肽链侧链去保护，并用二硫基乙烷/TFA 5/95(20ml)于室温处理3小时将其从树脂上分开。滤去树脂并用3×10ml的醋酸冲洗。将与酸结合的部分蒸发，残渣与醚研磨三次。
粗品肽溶于1/1的H2O/CH3CN并冰冻干燥。获得的物质经HPLC纯化，采用Gilson 305和306 HPLC装置，其具有Kromasil 100-5C1825cm×22mm内径的留相体积(A＝0.1％TFA/H2O-B＝0.1％TFA/CH3CN5-80％/25min；10ml/min，220nm)。HPLC的结合部分经冰冻干燥获得84mg的本化合物。MH+(m/z)＝533
实施例2Lys-Leu-Cys-Cys-Gln-Met的合成
按实施例1的相似方案制备Lys-Leu-Cys-Cys-Gln-Met(39.6mg，54.7μmol)。将Lys-Leu-Cys-Cys-Gln-Met溶于5％的醋酸水溶液(80ml)，用碳酸铵将此溶液调至pH6。
加入二甲基亚砜(60ml)，在室温下将此混合物搅拌24小时。之后，将此反应混合物在真空中浓缩至8ml。此溶液通过半制备HPLC纯化(APEX Prep Sil ODS，8μm，25cm×20mm内径，线性梯度洗脱为CH3CN，5-60％，0.1％TFA水溶液，50分钟，流量10ml/min，220nm紫外监测)，然后通过冰冻干燥得到本肽(19.7mg，50％为白色粉末)。按C28H51N8O8S3计算的HRMS(FAB+)严格质量为723.299；实际获得为723.302。
实施例3分子间氧化的平行二聚体的合成
Pro-Gly-Cys-Cys-Gly-Pro (平行二聚体)
| |
Pro-Gly-Cys-Cys-Gly-Pro
要制备平行同质二聚体，按实施例1的相似过程合成一种单肽链(Pro-Gly-Cys-Cys(Acm)-Gly-Pro)，其一个半胱氨酸带有Acm(甲基乙酰胺)保护基团而另一个半胱氨酸不带保护基团。按实施例2的相似过程，单体肽通过自由半胱氨酸的氧化而形成二聚体。第二个二硫桥采用Ruiz-Gayo法获得(Ruiz-Gayo et al，1988，Tetrahedron Letters，29，3845-3848)，此法中单氧化的二聚体肽(100mg，83μmol)溶于MeOH(16ml)。加入新制备的0.2MI2/CH3OH(8.2ml，1.64mmol)，将此混合物于室温搅拌2小时。向混合物中加入H2O(20ml)，然后缓慢加入0.5M抗坏血酸(aq)直至碘的颜色消失。在室温下让此混合物缓慢蒸发至原体积的一半。此粗品经过冰冻干燥，然后用HPLC纯化。
实施例4反平行二聚体的合成
Pro-Gly-Cys-Cys-Gly-Pro(反平行二聚体)
×
Pro-Gly-Cys-Cys-Gly-Pro
制备反平行同质二聚体采用常规的Ruiz-Gayo法(Ruiz-Gayo et al，1988，Tetrahedron Letters，29，3845-3848)。按实施例1的相似方案合成两种单肽链(Pro-Gly-Cys(Acm)-Cys-Gly-Pro和Pro-Gly-Cys-Cys(Acm)-Gly-Pro)，其各有一个半胱氨酸带有Acm(甲基乙酰胺)保护基团而另一个半胱氨酸不带保护基团。其中的一种单体肽中的未加保护的半胱氨酸用二硫吡啶活化，即将单体肽(62μmol)溶于异丙醇/2M醋酸(50/50，20ml)，并加入2，2’-二硫吡啶(205μmol溶于15ml异丙醇/2M醋酸(50/50))。混合物在室温下搅拌过夜。将混合物蒸发，然后加入CH3CN(25ml)并再次蒸发。残留的粗品与醚(4×25ml)研磨，获得的硫吡啶衍化物Pro-Gly-Cys(SPyr)-Cys(Acm)-Gly-Pro无需进一步纯化就可直接使用。将活化的肽链溶于0.01M醋酸铵溶液(50ml，pH＝6.5)，加入另一种肽链(溶于17ml 0.01M醋酸铵(aq))并搅拌30分钟，使此活化衍生物与第二条肽链(62μmol)反应。反应混合物经冰冻干燥，粗品经HPLC纯化得到单二硫桥二聚体。第二个二硫桥可按实施例3的相同方案获得，其中CH3OH中的碘，经过HPLC纯化后，可促使终产物的形成。
实施例5Gly-Pro-Cys-Cys-Pro-Gly的合成
合成按实施例1的相似方案进行。
实施例6Ala-Pro-Cys-Cys-Val-Pro的合成
合成按实施例1的相似方案进行。
实施例7Phe-Cys-Ile-Cys-Lys的合成
合成按实施例1的相似方案进行。
实施例8Lys-Pro-Cys-Cys-Glu-Arg的合成
合成按实施例1的相似方案进行。
实施例9Arg-Cys-Ser-Gly-Cys-Cys-Asn的合成
合成按实施例1的相似方案进行。
实施例10分子内氧化的Gly-Pro-Cys-Cys-Pro-Gly的合成
合成按实施例2的相似方案进行。
实施例11分子内氧化的Val-Ile-Cys-Cys-Leu-Thr的合成
合成按实施例2的相似方案进行。
实施例12分子内氧化的Lys-Leu-Cys-Cys-Asp-Ile的合成
合成按实施例2的相似方案进行。
实施例13分子内氧化的Thr-Pro-Cys-Cys-Phe-Ala的合成
合成按实施例2的相似方案进行。
实施例14分子内氧化的Lys-Glu-Cys-Cys-Tyr-Val的合成
合成按实施例2的相似方案进行。
实施例15分子内氧化的Lys-Cys-Arg-Cys-Lys的合成
合成按实施例2的相似方案进行。
实施例16分子间氧化的反平行二聚体的合成
Val-Cys-Gly-Cys-Arg(反平行二聚体)
×
Val-Cys-Gly-Cys-Arg
合成按实施例4的相似方案进行。
实施例17分子内氧化的Pro-Gly-Cys-Cys-Gly-Pro的合成
合成按实施例2的相似方案进行。
实施例18分子内氧化的Trp-Pro-Cys-Cys-Pro-Trp的合成
合成按实施例2的相似方案进行。
实施例19分子内氧化的Leu-Leu-Phe-Gly-Pro-Cys-Cys-NH2的合成
合成按实施例2的相似方案进行。
实施例20分子内氧化的Glu-Glu-Cys-Cys-Phe-Tyr的合成
合成按实施例2的相似方案进行。
实施例21Pro-Val-Cys-Cys-Ile-Gly的合成
合成按实施例1的相似方案进行。
实施例22分子内氧化的Pro-Val-Cys-Cys-Ile-Gly的合成
合成按实施例2的相似方案进行。
实施例23分子内氧化的Ser-Gln-Cys-Cys-Ser-Leu的合成
合成按实施例2的相似方案进行。
实施例24分子内氧化的Ser-Ile-Cys-Cys-Thr-Lys的合成
合成按实施例2的相似方案进行。
实施例25Pro-Asp-Cys-Cys-Ile-Pro的合成
合成按实施例1的相似方案进行。
实施例26Leu-Ala-Cys-Cys-Val-Val的合成
合成按实施例1的相似方案进行。
实施例27Pro-Gly-Cys-Cys-Pro-Gly的合成
合成按实施例2的相似方案进行。
实施例28Ac-Ala-Pro-Cys-Cys-Val-Pro的合成
合成按实施例1的相似方案进行，在Millipore公司的9050+型肽合成器中，于合成过程的最后增加一个甲基化步骤，即在DMF中向树脂增加0.3M N-乙酰咪唑，并使溶液在合成管中循环2小时，然后用DMF清洗。
实施例29Lys-Glu-Cys-Cys-Tyr-Val的合成
合成按实施例1的相似方案进行。
实施例30Lys-Leu-Cys-Cys-Gln-Met的合成
合成按实施例1的相似方案进行。
实施例31Ala-Pro-Cys-Cys-Glu-Ser的合成
合成按实施例2的相似方案进行。
实施例32Pro-Ala-Cys-Cys-Gly-Pro的合成
合成按实施例2的相似方案进行。
实施例33Val-Cys-Ile-Cys-Gln的合成
合成按实施例1的相似方案进行。
实施例34Gly-Pro-Cys-Ile-Cys-Pro-Gly的合成
| |
Gly-Pro-Cys-Ile-Cys-Pro-Gly
合成按实施例3的相似方案进行。
实施例35Val-Cys-Gly-Cys-Arg的合成
合成按实施例1的相似方案进行。
实施例36Val-Cys-Gly-Cys-Arg的合成
| |
Val-Cys-Gly-Cys-Arg
合成按实施例3的相似方案进行。
实施例37Ile-Cys-Thr-Cys-Glu的合成
合成按实施例1的相似方案进行。
实施例38Ile-Cys-Thr-Cys-Glu的合成
合成按实施例2的相似方案进行。
实施例39Leu-Cys-Ala-Cys-Cal的合成
合成按实施例2的相似方案进行。
实施例40Asp-Cys-Ile-Cys-Gln的合成
合成按实施例1的相似方案进行。
实施例41Asp-Cys-Ile-Cys-Gln的合成
合成按实施例2的相似方案进行。
实施例42Ala-Cys-Lys-Cys-Gln的合成
合成按实施例1的相似方案进行。
实施例43延迟型过敏性(DTH)试验
依据本发明，肽调节免疫应答的能力可通过其在小鼠DTH试验中的作用予以阐明。DTH试验用于阐明免疫调节，例如下面引入作为参考的文献就描述了这一方法，Carlsten H.，et al(1986)国际变态反应应用进展，81322。肽按一或多种下列剂量试验0.0003μmol/kg，0.003μmol/kg，0.03μmol/kg，0.3μmol/kg，3.0μmol/kg。
雄性和雌性的Balb/c小鼠取自Bomholtsgaard(丹麦)，每只体重为18～20克。DTH试验用的抗原为4-乙氧亚甲基-2-苯基噁唑啉-5-one(OXA)(Sigma化学药剂公司)。
在第0天，于小鼠去毛的腹部epicutaneous施加150μl含有3％OXA的乙醇-丙酮(3∶1)纯溶液以使其致敏。致敏后立即开始喂养处理，每天(上午)一次直至第6天，处理采用包括1～41号肽或媒介物(磷酸盐缓冲液，pH7.4，包含63％∶37％比例混合的缓冲液A和缓冲液B的混合物(缓冲液ANa2HPO4 0.89g/100ml，EDTA 0.05g/100ml；缓冲液BNaH2PO40.69g/100ml，EDTA 0.05g/100ml))。七天后，在所有小鼠双耳的两侧用20μl溶于花生油的1％OXA进行表面敷用来激发免疫应答。在激发前24或48小时和激发后24或48小时，用Oditest弹簧测径器测量耳的厚度。敷用和测量在轻度戊巴比妥麻醉下进行。
依据van Loveren H.等(1984)免疫方法杂志67311所描述的方法对DTH反应的强度进行测量，并由公式表述为Tt24/48-Tt0μm单位，在各个测试(T)中的t0、t24和t48分别代表0时刻、敷用后+24小时或+48小时耳的厚度。结果表述为平均值+/-S.E.M.。由Student’s双尾t检测方法获得各组平均值之间的显著水平。与对照组(磷酸盐缓冲液)相比，耳厚增减的显著偏差反应了肽的免疫调节作用。
表1给出了DTH试验中用的1～41号肽的结构。与对照组相比，在至少一种测试过的剂量下，这些肽在免疫兴奋和免疫抑制作用方面显示了明显的差异。
表1在DTH试验中引起免疫调节应答的1～41号肽
1.Gly Pro Cys Cys Pro Gly
2.Gly Pro Cys Cys Pro Gly
3.Pro Gly Cys Cys Gly Pro
4.Pro Gly Cys Cys Gly Pro
5.Trp Pro Cys Cys Pro Trp
6.Leu Leu Phe Gly Pro Cys Cys NH2
7.Ala Pro Cys Cys Val Pro
8. Val Ile Cys Cys Leu Phr
9. Thr Pro Cys Cys Phe Ala
10.Glu Glu Cys Cys Phe Tyr
11.Pro Val Cys Cys Ile Gly
12.Pro Val Cys Cys Ile Gly
13.Val Cys Ile Cys Gln
14.Leu Ala Cys Cys Val Val
15.Val Cys Gly Cys Arg
16.Ser Gln Cys Cys Ser Leu
17.Lys Pro Cys Cys Glu Arg
18.Lys Cys Arg Cys Lys
19.Lys Glu Cys Cys Tyr Val
20.Ser Ile Cys Cys Thr Lys
21.Lys Leu Cys Cys Asp Ile
22.Pro Asp Cys Cys Ile Pro
23.Lys Glu Cys Cys Tyr Val
24.Asp Cys Ile Cys Gln
25.Ile Cys Thr Cys Glu
26.Ile Cys Thr Cys Glu
27.Leu Cys Ala Cys Val
28.Lys Leu Cys Cys Gln Met
29.Phe Cys Ile Cys Lys
30.Asp Cys Ile Cys Gln
31.Lys Leu Cys Cys Gln Met
32.Ac Ala Pro Cys Cys Val Pro
33.Arg Cys Ser Gly Cys Cys Asn
34.Ala Cys Lys Cys Gln
35.Gly Pro Cys Ile Cys Pro Gly
| |
Gly Pro Cys Ile Cys Pro Gly
36.Pro Gly Cys Cys Gly Pro
| |
Pro Gly Cys Cys Gly Pro
38.Val Cys Gly Cys Arg
||
Val Cys Gly Cys Arg
39.Pro Gly Cys Cys Pro Gly
40.Ala Pro Cys Cys Glu Ser
41.Pro Ala Cys Cys Gly Pro
实施例44以不同途径给药时肽的免疫调节作用之比较
按照实施例43，用0.0003μmol/每公斤体重至3.0μmol/每公斤体重的剂量，给小鼠(10只组)口服和肠胃外注射(静脉和皮下注射)肽(4号肽—衍生于SEQ ID NO.2)。按实施例43对这些动物进行检查；发现耳的厚度有变化。记录每组小鼠(每组10只)的平均值和其标准差，结果发现，以口服方式给肽比其它肠胃外方式给肽所产生的免疫调节应答更显著。
实施例45以不同途径给药时肽二聚体(36号肽—衍生于SEQ IDNO.2)的免疫调节作用之比较
用0.03μmol/每公斤体重和3.0μmol/每公斤体重的剂量，给小鼠(10组)施用肽(36号肽)。按实施例43对这些动物进行检查；发现耳的厚度有变化。计算每组小鼠(每组10只)的平均值和其标准差，结果发现，在DTH试验中肽二聚体产生的免疫调节应答比对照组显著，并发现以口服给药比其它肠胃外方式给以相同剂量的肽所产生的免疫调节应答更强。
实施例46肽(1，2，7和4号肽；及8号肽)对肿瘤生长的作用
培养于等渗盐溶液和5％同质大鼠血清中的104个自发主长的大鼠乳房癌细胞皮下接种于Wistar大鼠的右后腿(每组8只)。肿瘤大小可通过触诊估计，也可用测径器测量其第一直径(a)即最大直径和一个与之垂直的直径(b)。肿瘤的体积用下面的公式计算
V＝0.4ab2
肿瘤的体积以mm3为单位，为每组大鼠的平均值(每组8只)。
药物和对照(等渗盐溶液)以管饲法(喂食管)给药，在4～8和11～15天期间每天(上午)一次，投放下列肽
i)Gly Pro Cys Cys Pro Gly(1号肽(SEQ ID NO1 )3μmol/kg/day)；
ii)Ala Pro Cys Cys Val Pro(7号肽(SEQ ID NO5)0.03，0.3μmol/kg/day)；
iii)Val Ile Cys Cys Leu Thr(8号肽(SEQ ID NO6)0.03，0.3
μmol/kg/day)；和
iv)Pro Gly Cys Cys Gly Pro(4号肽(衍生于SEQ ID NO2)0.03，0.3
μmol/kg/day)；并在6-9天和13-20天，每天加入下肽
Gly Pro Cys Cys Pro Gly(2号肽(衍生于SEQ ID NO1)0.003，0.03，0.3，3.0μmol/kg/day)。
与对照在所有测药剂量水平上相比，1、2和4肽的结果显示，肿瘤的体积显著减小。
序列表(1)一般信息 (i)申请人
(A)姓名ASTRA AB
(B)街道Vaestra Maelarehamnen 9
(C)城市Soedertaelje
(E)国别瑞典
(F)邮编S-151 85
(G)电话+46-8-553 260 00
(H)传真+46-8-553 288 20
(I)电传19237 astras (ii)发明名称免疫调节肽 (iii)序列数目30 (iV)计算机可读形式
(A)介质类型软盘
(B)计算机IBM PC兼容型
(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS
(D)软件Patent In Release#1.0，Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的资料 (i)序列特征
(A)长度6个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑结构线性 (ii)分子类型肽 (ix)特征
(A)名称/关键词肽
(B)定位1..6 (xi)序列描述SEQ ID NO1Gly Pro Cys Cys Pro Gly 1 5(2)SEQ ID NO2的资料 (i)序列特征
(A)长度6个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑结构线性 (ix)特征
(A)名称/关键词肽
(B)定位1..6 (xi)序列描述SEQ ID NO2
Pro Gly Cys Cys Gly Pro
1 5(2)SEQ ID NO3的资料 (i)序列特征
(A)长度6个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑结构线性 (ix)特征
(A)名称/关键词肽
(B)定位1..6 (ix)特征
(A)名称/关键词二硫键
(B)定位3..4 (xi)序列描述SEQ ID NO3
Trp Pro Cys Cys Pro Trp
1 5(2)SEQ ID NO4的资料 (i)序列特征
(A)长度7个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑结构线性 (ix)特征
(A)名称/关键词肽
(B)定位1..7 (ix)特征
(A)名称/关键词修饰位点
(B)定位7
(D)其它信息/产品＝”OTHER”/符号＝”Cys-NH2” (ix)特征
(A)名称/关键词二硫键
(B)定位6..7 (xi)序列描述SEQ ID NO4
Leu Leu Phe Gly Pro Cys Xaa
1 5(2)SEQ ID NO5的资料 (i)序列特征
(A)长度6个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑结构线性 (xi)序列描述SEQ ID NO5
Ala Pro Cys Cys Val Pro
1 5(2)SEQ ID NO6的资料 (i)序列特征
(A)长度6个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑结构线性 (ix)特征
(A)名称/关键词二硫键
(B)定位3..4 (xi)序列描述SEQ ID NO6
Val Ile Cys Cys Leu Thr
1 5(2)SEQ ID NO7的资料 (i)序列特征
(A)长度6个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑结构线性 (ix)特征
(A)名称/关键词二硫键
(B)定位3..4 (xi)序列描述SEQ ID NO7
Thr Pro Cys Cys Phe Ala
1 5(2)SEQ ID NO8的资料 (i)序列特征
(A)长度6个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑结构线性 (ix)特征
(A)名称/关键词二硫键
(B)定位3..4 (xi)序列描述SEQ ID NO8
Glu Glu Cys Cys Phe Tyr
1 5(2)SEQ ID NO9的资料 (i)序列特征
(A)长度6个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑结构线性 (xi)序列描述SEQ ID NO9
Pro Val Cys Cys Ile Gly
1 5(2)SEQ ID NO10的资料 (i)序列特征
(A)长度5个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑结构线性
(xi)序列描述SEQ ID NO10
Val Cys Ile Cys Gln
1 5(2)SEQ ID NO11的资料 (i)序列特征
(A)长度6个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑结构线性 (xi)序列描述SEQ ID NO11
Leu Ala Cys Cys Val Val
1 5(2)SEQ ID NO12的资料 (i)序列特征
(A)长度5个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑结构线性 (xi)序列描述SEQ ID NO12
Val Cys Gly Cys Arg
1 5(2)SEQ ID NO13的资料 (i)序列特征
(A)长度6个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑结构线性 (ix)特征
(A)名称/关键词二硫键
(B)定位3..4 (xi)序列描述SEQ ID NO13
Ser Gln Cys Cys Ser Leu
1 5(2)SEQ ID NO14的资料 (i)序列特征
(A)长度6个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑结构线性 (xi)序列描述SEQ ID NO14
Lys Pro Cys Cys Glu Arg
1 5(2)SEQ ID NO15的资料 (i)序列特征
(A)长度5个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑结构线性 (ix)特征
(A)名称/关键词二硫键
(B)定位2..4 (xi)序列描述SEQ ID NO15
Lys Cys Arg Cys Lys
1 5(2)SEQ ID NO16的资料 (i)序列特征
(A)长度6个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑结构线性 (xi)序列描述SEQ ID NO16
Lys Glu Cys Cys Tyr Val
1 5(2)SEQ ID NO17的资料 (i)序列特征
(A)长度6个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑结构线性 (ix)特征
(A)名称/关键词二硫键
(B)定位3..4 (xi)序列描述SEQ ID NO17
Ser Ile Cys Cys Thr Lys
1 5(2)SEQ ID NO18的资料 (i)序列特征
(A)长度6个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑结构线性 (ix)特征
(A)名称/关键词二硫键
(B)定位3..4 (xi)序列描述SEQ ID NO18
Lys Leu Cys Cys Asp Ile
1 5(2)SEQ ID NO19的资料 (i)序列特征
(A)长度6个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑结构线性 (xi)序列描述SEQ ID NO19
Pro Asp Cys Cys Ile Pro
1 5(2)SEQ ID NO20的资料 (i)序列特征
(A)长度5个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑结构线性 (xi)序列描述SEQ ID NO20
Asp Cys Ile Cys Gln
1 5(2)SEQ ID NO21的资料 (i)序列特征
(A)长度5个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑结构线性 (xi)序列描述SEQ ID NO21
Ile Cys Thr Cys Glu
1 5(2)SEQ ID NO22的资料 (i)序列特征
(A)长度5个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑结构线性 (ix)特征
(A)名称/关键词二硫键
(B)定位2..4 (xi)序列描述SEQ ID NO22
Leu Cys Ala Cys Val
1 5(2)SEQ ID NO23的资料 (i)序列特征
(A)长度6个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑结构线性 (xi)序列描述SEQ ID NO23
Lys Leu Cys Cys Gln Met
1 5(2)SEQ ID NO24的资料 (i)序列特征
(A)长度5个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑结构线性 (xi)序列描述SEQ ID NO24
Phe Cys Ile Cys Lys
1 5(2)SEQ ID NO25的资料 (i)序列特征
(A)长度7个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑结构线性 (xi)序列描述SEQ ID NO25
Arg Cys Ser Gly Cys Cys Asn
1 5(2)SEQ ID NO26的资料 (i)序列特征
(A)长度5个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑结构线性 (xi)序列描述SEQ ID NO26
Ala Cys Lys Cys Gln
1 5(2)SEQ ID NO27的资料 (i)序列特征
(A)长度7个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑结构线性 (xi)序列描述SEQ ID NO27
Gly Pro Cys Ile Cys Pro Gly
1 5(2)SEQ ID NO28的资料 (i)序列特征
(A)长度6个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑结构线性 (ix)特征
(A)名称/关键词二硫键
(B)定位3..4 (xi)序列描述SEQ ID NO28
Pro Gly Cys Cys Pro Gly
1 5(2)SEQ ID NO29的资料 (i)序列特征
(A)长度6个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑结构线性 (ix)特征
(A)名称/关键词二硫键
(B)定位3..4 (xi)序列描述SEQ ID NO29
Ala Pro Cys Cys Glu Ser
1 5(2)SEQ ID NO30的资料 (i)序列特征
(A)长度6个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型
(D)拓扑结构线性 (ix)特征
(A)名称/关键词二硫键
(B)定位3..4 (xi)序列描述SEQ ID NO30
Pro Ala Cys Cys Gly Pro
1 权利要求
1.一种纯化的具有生理活性的肽，其包含至少两个半胱氨酸残基，这两个残基直接相连或被不多于一个氨基酸残基隔离，该肽可被哺乳动物上皮细胞层吸收而导致免疫调节应答并由此产生抗病疗效。
2.权利要求1的肽，其为二聚体形式，二聚体中的第二肽通过第一肽的至少两个半胱氨酸残基和第二肽的至少两个半胱氨酸残基之间的二硫键与第一肽相连。
3.权利要求2的肽，其中二聚体选自平行二聚体、反平行二聚体和混合二聚体。
4.权利要求1至3中任一权项的肽，其长度为4至约30个氨基酸。
5.权利要求1至4中任一权项的肽，其长度为4至约20个氨基酸。
6.权利要求1至5中任一权项的肽，其长度为4至15个氨基酸。
7.权利要求1至6中任一权项的肽，其包含天然存在的氨基酸和/或非天然存在的氨基酸。
8.权利要求1至7中任一权项的肽，组成此肽的氨基酸残基独立地选自Ile、Leu、Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Met、His和Val。
9.通式(I)所示的权利要求1至8中任一权项的肽
(A)n-X-Cys-Cys-Y-(B)m (I)
其中
每个A独立地选自H、一个保护基团、或至少一个氨基酸残基，该氨基酸残基独立地选自L-型或D-型氨基酸残基，这些残基具有选自脂肪侧链、脂肪羟基侧链、碱性侧链、酸性侧链、仲氨基基团、酰胺侧链、芳香侧链和含硫侧链的基团；
n是一个选自1～11的整数；
X选自NH和具有选自脂肪族侧链、仲氨基基团、酰胺侧链、酸性侧链和脂肪族侧链的基团的氨基酸残基。
Y选自NH和具有选自仲氨基基团、脂肪族侧链、酸性侧链、脂肪羟基侧链、芳香侧链和酰胺侧链的基团的氨基酸残基；
每个B独立地选自H、OH、NH、一个保护基团或至少一个氨基酸残基，该氨基酸残基具有选自脂肪族侧链，脂肪羟基侧链，碱性侧链，酸性侧链，仲氨基基团，酰胺侧链，芳香族侧链和含硫侧链的基团；
m是一个选自1～11的整数；
条件是当A不是至少一个氨基酸残基时n为1，当B不是至少一个氨基酸残基时m为1；每个肽序列包含不超过15个氨基酸残基。
10.权利要求9的肽，其中
X选自Gly、Pro、Gln、Ile、Val、Asp、Leu、Glu、Ala和NH；
Y选自Pro、Gly、Leu、Glu、Val、Ile、Ser、Phe、Tyr、Thr、Asp、Gln和NH。
11.权利要求9或权利要求10的肽，其中
X是Gly且Y是Gly；
X是Pro且Y是Pro；
X是Pro且Y是Val；
X是Ile且Y是Leu；
X是Pro且Y是Glu；
X是Glu且Y是Tyr；
X是Pro且Y是Phe；
X是Glu且Y是Phe；
X是Ala且Y是Val；
X是Val且Y是Ile；
X是Gln且Y是Ser；
X是Ile且Y是Thr；
X是Leu且Y是Asp；
X是Asp且Y是Ile；
X是Leu且Y是Gln；
X是Gly且Y是Asn；
X是Gly且Y是Pro；或
X是Ala且Y是Gly；
12.权利要求9至11中任一权项的肽，其为两种肽序列形成的二聚体形式，其中第二肽的两个半胱氨酸残基与第一肽的两个半胱氨酸残基以二硫键连接。
13.权利要求12的二聚体形式的肽，它由两种相同肽序列组成。
14.权利要求11的肽，其选自
Gly-Pro-Cys-Cys-Pro-Gly；
Pro-Gly-Cys-Cys-Gly-Pro；
Ala-Pro-Cys-Cys-Val-Pro；
Lys-Pro-Cys-Cys-Glu-Arg；
Pro-Asp-Cys-Cys-Ile-Pro；和
Arg Cys Ser Gly Cys Cys Asn。
15.权利要求11的肽，其选自
Gly-Pro-Cys-Cys-Pro-Gly；
Pro-Gly-Cys-Cys-Gly-Pro；
Trp-Pro-Cys-Cys-Pro-Trp；
Val-Ile-Cys-Cys-Leu-Thr；
Thr-Pro-Cys-Cys-Phe-Ala；
Glu-Glu-Cys-Cys-Phe-Tyr；
Lys-Leu-Cys-Cys-Asp-Ile；
Lys-Glu-Cys-Cys-Tyr-Val；和
Pro Ala Cys Cys Gly Pro。
16.下列肽
Pro Gly Cys Cys Gly Pro
| |
Pro Gly Cys Cys Gly Pro。
17.权利要求14的肽，其选自
Gly-Pro-Cys-Cys-Pro-Gly；
Pro-Gly-Cys-Cys-Gly-Pro；
Ala-Pro-Cys-Cys-Val-Pro；
Lys-Pro-Cys-Cys-Glu-Arg；和
Arg Cys Ser Gly Cys Cys Asn。
18.权利要求15的肽，其选自
Pro-Gly-Cys-Cys-Gly-Pro；
Val-Ile-Cys-Cys-Leu-Thr；
Lys-Glu-Cys-Cys-Tyr-Val；
Gly-Pro-Cys-Cys-Pro-Gly；和
Pro Ala Cys Cys Gly Pro。
19.如通式(II)所示的权利要求1至8中任一权项的肽
(A)n-X-Cys-Z-Cys-Y-(B)m (II)
其中
每个A独立地选自H、一个保护基团、或一个氨基酸残基，该氨基酸残基为L-型或D-型，并具有选自脂肪族侧链、脂肪羟基侧链、碱性侧链、酸性侧链、仲氨基基团、酰胺侧链和含硫侧链的基团；
n是一个选自1～1O的整数；
X选自NH和具有选自脂肪族侧链、仲氨基基团、芳香侧链、酸性侧链和酰胺侧链的基团的氨基酸残基。
Z选自具有选自脂肪族侧链、脂肪羟基侧链和碱性侧链的基团的氨基酸残基；
Y选自具有选自酰胺侧链、碱性侧链、脂肪族侧链、酸性侧链和仲氨基基团的基团的氨基酸残基；
每个B独立地选自H、OH、NH、一个保护基团或一个氨基酸残基，此氨基酸残基具有选自脂肪族侧链、脂肪羟基侧链、碱性侧链、酸性侧链、仲氨基基团、酰胺侧链和含硫侧链的基团；
m是一个选自1～10的整数；
条件是当A不是至少一个氨基酸残基时n为1，当B不是至少一个氨基酸残基时m为1；并且每个肽序列包含不超过15个氨基酸残基。
20.权利要求19的肽，其中
X选自Gly、Pro、Gln、Ile、Phe、Val、Asp、Leu、Glu、Ala、Lys或NH；
Y选自Pro、Gly、Glu、Val、Lys、Gln和Arg
Z选自Ile、Arg、Gly、Thr、Ala和Lys。
21.权利要求19或20的肽，其为两种肽序列形成的二聚体形式，其中第二肽的两个半胱氨酸残基与第一肽的两个半胱氨酸残基以二硫键连接。
22.权利要求21的二聚体形式的肽，其由两种相同肽序列组成。
23.权利要求19或20的肽，它选自
Val Cys Ile Cys Gln；
Val Cys Gly Cys Arg；
Asp Cys Ile Cys Gln；
Ile Cys Thr Cys Glu；
Phe Cys Ile Cys Lys；和
Ala Cys Lys Cys Gln。
24.一种肽，它选自
Ile Cys Thr Cys Glu；
Lys Cys Arg Cys Lys；
Leu Cys Ala Cys Val；和
Asp Cys Ile Cys Gln。
25.一种肽，它选自
Gly Pro Cys Ile Cys Pro Gly
| |
Gly Pro Cys Ile Cys Pro Gly；
Val Cys Gly Cys Arg
| |
Val Cys Gly Cys Arg。
26.权利要求1至25中任一权项的肽，其不含附加的转运药剂。
27.权利要求1至26中任一权利的肽的酸加成盐。
28.权利要求27的酸加成盐，其选自下列酸的酸加成盐盐酸、氢溴酸、硝酸、高氯酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、苯甲酸、谷氨酸、草酸、天门冬氨酸、丙酮酸、醋酸、琥珀酸、延胡索酸、顺丁烯二酸、草酰乙酸、烃乙基磺酸、硬脂酸、苯二甲酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、乳糖酸和葡萄糖醛酸。
29.权利要求1至26中任一权项的肽的碱盐。
30.权利要求29的碱盐，其选自碱金属和碱土金属盐、有机碱盐和氨基酸盐。
31.包含权利要求1至26中任一权项的免疫调节肽的口服剂型。
32.权利要求31的口服剂型，其中口服给药时能够在哺乳动物体内引起显著免疫调节应答的免疫调节肽的剂量，少于注射给药时在该哺乳动物体内引起相同水平免疫调节应答的相同免疫调节肽的剂量。
33.权利要求32的口服剂型，其不含附加的转运药剂。
34.包含权利要求1至26中任一权项的免疫调节肽的气管内剂型。
35.权利要求34的气管内剂型，其中气管内给药时能够在哺乳动物体内引起显著免疫调节应答的免疫调节肽的剂量，少于注射给药时在该哺乳动物体内引起相同水平免疫调节应答的相同免疫调节肽的剂量。
36.权利要求35的气管内剂型，其不含附加的转运药剂。
37.包含权利要求1至26中任一权项的免疫调节肽的鼻用剂型。
38.权利要求37的鼻用剂型，其中鼻腔给药时能够在哺乳动物体内引起显著免疫调节应答的免疫调节肽的剂量，少于注射给药时在该哺乳动物体内引起相同水平免疫调节应答的相同免疫调节肽的剂量。
39.权利要求38的鼻用剂型，其不含附加的转运药剂。
40.包含至少一种权利要求1至26中任一权项的肽或其盐的药物制剂，其还含有药用载体。
41.权利要求40的药物制剂，其中药物制剂是用于口服的。
42.权利要求40或权利要求41的药物制剂，其包含至少一种通式(I)的肽或其生理衍生物以及一种药用载体。
43.权利要求40至42中任一权项的药物制剂，其包含至少一种通式(I)的肽或其盐和至少一种通式(II)的肽或其盐以及一种药物载体。
44.权利要求1至26中任一权项的肽或其盐，其以口服剂型用于治疗。
45.权利要求1至26中任一权项的肽或其盐，其以口服剂型用于癌症治疗。
46.权利要求1至26中任一权项的肽或其盐，其以口服剂型用于自身免疫疾病治疗。
47.权利要求1至26中任一权项的肽或其盐，其用于治疗。
48.权利要求1至26中任一权项的肽或其盐，其用于癌症治疗。
49.权利要求1至26中任一权项的肽或其盐，其用于风湿性关节炎治疗。
50.权利要求1至26中任一权项的生理活性肽或其盐在制备适于治疗疾病的药物中的应用。
51.权利要求1至26中任一权项的生理活性肽及其盐在制备适于治疗癌症的药物中的应用。
52.权利要求1至26中任一权项的生理活性肽及其盐在制备适于治疗自身免疫疾病的药物中的应用。
53.不含附加的转运药剂的权利要求1至26中任一权项的生理活性肽及其盐在制备适于治疗风湿性关节炎的药物中的应用。
54.一种药物制剂的制备方法，其包括将权利要求1至26中任一权项的至少一种肽或其至少一种盐与药用载体结合。
55.权利要求54的方法，其包括将至少一种通式(I)的肽和/或至少一种通式(II)的肽或其盐与药用载体结合。
56.一种在哺乳动物体内引起免疫调节应答的方法，其包括确定需要调节免疫应答的哺乳动物，和向哺乳动物上皮细胞层施用一定剂量的权利要求1至26中任一权项的生理活性肽或其盐，该剂量足以引起所述免疫调节应答并由此产生治疗效果。
57.权利要求56的方法，其包括向哺乳动物MALT施用一定剂量的通式(I)的生理活性肽或其盐，该剂量足以引起所述免疫调节应答并由此产生治疗效果。
58.权利要求56或权利要求57的方法，其包括向哺乳动物MALT施用一定剂量的通式(II)的生理活性肽或其盐，该剂量足以引起所述免疫调节应答并由此产生治疗效果。
59.一种通过化学方法制备权利要求1至26中任一权项的肽的方法，其包括将单个氨基酸残基或本发明的肽段连接而形成肽键，并在此过程开始和/或结束时加入保护基团。
全文摘要
可被哺乳动物上皮细胞层吸收，产生免疫调节应答，并由此对疾病产生疗效的肽，包含该肽的制剂及其应用。
文档编号A61K38/08GK1154704SQ9619054
公开日1997年7月16日 申请日期1996年3月22日 优先权日1996年3月22日
发明者H·贝里斯特兰德, T·埃里克松, M·林德瓦尔, B·泽尔施特兰德 申请人:阿斯特拉公司