专利名称：核酸的细胞特异性转移所用的多功能配体系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及将多核苷酸转移至细胞的改良方法和所用试剂。
对于将基因转移至细胞内而言，基因构建体结合到细胞表面即使不是足够的和必要的，也是必需的。这种结合越紧密，基因构建体被细胞成功接纳并在细胞中转录的可能性则越大。这种结合的细胞特异性越强，基因构建体越可能占优势地或单独地与靶细胞结合并被此细胞接纳。当除了基因构建体和靶细胞以外，还存在另一种类型的细胞，但基因构建体优先地或全部地由靶细胞接纳时，基因构建体与靶细胞结合的特异性尤其重要。
已开发出多种能使基因构建体以细胞特异性方式结合的技术，所有这些技术的共同之处是它们利用了(1)配体与其受体的结合，后者表达于细胞膜上，或(2)抗体与其抗原或半抗原的结合，所述抗原、半抗原暴露于细胞膜上。这些技术的例子包括将如heregulin(Han etal.，PNAS 92，9747(1995))，促红细胞生成素(Kasahara et al.，Science266，1373(1994))的配体，如单链Fv(Marin et al.，J.Virol.70，2957(1996)的抗体片段或如Fc受体胞外部分的受体(Dougherty etal.，Transfusion Science 17，121(1996)掺入逆转录病毒载体的外被糖蛋白并以此方法造成靶细胞特异性的重组方法。
也已使用了化学方法将如脱唾液酸糖蛋白(Wu et al.，J.Biol.Chem.269，1152(1994)或此蛋白质合成衍生物(Marwin et al.，Bioconjugate Chem.5，612(1994))的配体与多聚赖氨酸相连，并且或者将后者与基因构建体络合，或者将其化学结合到腺病毒载体的外被蛋白上。另一种方法是将配体结合到抗生蛋白链菌素上，后者转而与生物素结合，所述生物素与脂质体的磷脂头部基团缀合，脂质体被基因构建体络合(Redelmeir et al.，Drug Deliv.J.Deliv.Targeting Therap.Agents 2，98，(1995))。第一个配体系统由Fominaya et al.，J.Biol.Chem.271，10560，1996提供，此配体系统含有特异于肿瘤细胞上的ErbB2受体的抗体片段，假单胞菌融合肽外毒素A和酵母菌Gal-4蛋白的DNA-结合区，所述结合区与插入含转移基因之质粒的相应Gal-4结合序列结合。尽管此配体系统导致靶细胞特异性转染，但它仍会碰到酵母菌Gal-4蛋白免疫原性的不利之处。
这些公开的方法无一能以靶细胞特异性的方式充分解决结合载体的难题，缺乏特异性的主要原因包括(1)经修饰的病毒载体功能的削弱；(2)所用配体系统相当大的复杂性和大小；(3)异源或经修饰蛋白质或所用抗生蛋白链菌素-生物素偶联系统的免疫原性和相容性；和(4)结合的基因构建体影响靶细胞特异性细胞转导能力的不足。
这些局限性的结果是很需要易于制备，功能上有用的配体以用于将病毒和非病毒载体结合到靶细胞上。
因此，本发明的一个目的是提供用于靶细胞特异性转移核苷酸序列的配体系统，所述系统相对已知系统而言，是非免疫原性的，并且较易制备和使用。另一个目的是增加载体与靶细胞结合的特异性，从而改善将核酸转移至靶细胞的效力和选择性。
为了实现这些和其他目的，本发明的一个方面提供了用于靶细胞特异性转移核苷酸序列的多功能配体系统，它含有至少一个靶细胞特异性配体，至少一个含有抗体或抗体部分的基因构建体特异性配体，以及连接这两个配体的接头，其中所述系统是非免疫原性的。在一个有利的实施方案中，至少一个配体是人源化抗体或抗体片段。在另一个有利的实施方案中，提供了治病的组合物，它含有用于靶细胞特异性转移核苷酸序列的多功能配体系统，所述系统含有至少一个靶细胞特异性配体，至少一个含有抗体或抗体部分的基因构建体特异性配体，以及连接这两个配体的接头，其中所述系统是非免疫原性的，它在适当的载体中被提供以施用给病人。
在另一个有利的实施方案中，配体系统含有将两个配体连接在一起的连接物，所述连接物含有两个接头。另一个有利的实施方案所提供的配体系统含有(a)TS配体，它含有抗-NCAM重组单链Fv片段，其中通过短肽序列使Fv片段的可变重链和轻链共价相连；(b)含有融合肽的接头，所述融合肽具有序列GLFEALLELLESLWELLLEA(SEQ ID No.1)；和(c)GS配体，它含有N-6--甲基腺嘌呤的重组抗体。
在另一个有利的实施方案中，本发明涉及根据本发明的配体系统用于制备药物的用途，所述药物可预防或治疗皮肤病，粘膜病，神经系统疾病，内部器官疾病，血液凝结疾病，造血系统疾病，免疫系统疾病，肌肉系统疾病，和支持组织或关节病。将配体系统作为疫苗局部施用或注射给病人或，可选择地，施予得自病人的细胞以预防或治疗与由皮肤，粘膜，神经系统，内部器官，血液凝结，造血系统，免疫系统，肌肉系统，支持组织和关节组成的组中的一个或多个相关的疾病。
根据本发明，通过连接细胞特异性配体和基因构建体可能会有利。
从下列详细描述中看，本发明的其他目的，特征和益处将是显而易见的。然而应理解，指示本发明较优选实施方案的详细描述和具体实施例仅为了阐明本发明，因为从此详细描述中得到的多种改变和修饰在本发明的精神和范围内，这对本领域技术人员而言是显而易见的。
图1表示三个可选择的配体系统，由靶细胞特异性配体和基因构建体特异性配体组成。其中配体由“接头”(图1a和1b)或“连接物”(图1c)连接。
图2表示图1C配体系统的实施方案，其中“连接物”含有抗体的绞链区。
图3表示图1C配体系统的另一个实施方案，其中“连接物”含有Gal 80蛋白和Gal4的Gal80-结合区。
图4表示的实施方案中融合肽被用来连接两个抗体片段。
图5表示在本发明中有用的表达载体pHENIS和pAB1。
本发明人发现通过图1所示的接头可以将靶细胞特异性配体与基因构建体特异性配体相互连接，而不会形成免疫原性的复合物。而且，尤其是通过使用图1C和图2和3所示的“连接物”所构建的配体系统可以克服现有技术中转导细胞免疫原性，特异性差，效力低的缺陷。
本文术语“靶细胞特异性配体”(TS配体)是与靶细胞表面决定簇结合的分子，即与靶细胞特异性配体的结合伙伴，如受体或粘着分子结合的分子。
“接头”在最简单的例子中是连接靶细胞特异性配体和基因构建体特异性配体的分子，并且有利地具有融合特性，即允许新的配体系统穿入细胞膜和/或溶酶体膜，即从溶酶体进入胞质的特性。在本发明有利的实施方案中，接头也具有融合特性。
“基因构建体特异性配体”(GS配体)是通过抗体或其部分直接或间接与基因构建体结合的分子。
在本发明适当的实施方案中，TS配体和GS配体通过“连接物”连接，另外，任一或两个配体可含有独立的接头，依据所用的特殊GS配体和TS配体，利用连接物的实施方案可采取不同的形式(例如1×接头，2×TS配体，1×GS配体或1×接头，1×TS配体，2×GS配体)。
通过共价结合[技术描述见Sedlacek et al.Contrib.to Oncol.32，42-49和81-85，Karger Verlag Munich(1988)]或如以电荷差异为基础的非-共价方式(离子结合)可实现TS配体，接头和GS配体之间的偶联。然而，也可使用重组技术将配体系统制备成融合蛋白的形式，这一点在EP-Al-0 464 533中已有描述。
通过本发明的配体系统被导入靶细胞的核酸序列可以是裸露的RNA或DNA，与非病毒载体或病毒混合的裸露RNA或裸露DNA。使用时将本发明配体系统与基因构建体相混合，将所得复合物加到欲被转导的细胞中，或者可以将复合物施予病人。
对本发明有用的靶细胞特异性配体，基因构建体特异性配体，接头和连接物的例子列于下文以阐明经发明人仔细考虑过的一些可能的组合。TS配体在本发明的上下文中，TS配体可以是与靶细胞上的受体结合的活性化合物，活性化合物的一部分或活性化合物的类似物。内源性物质，内源性物质部分和其他模拟内源性物质一个或多个表位的物质是有利的，因为与大多数外源物质相比，当导入体内时它们的免疫原性较低。
这种活性化合物的例子是生长因子，如VEGF，PDGF，EGF，TGFα，TGFβ，KGF，SDGF，FGF，IGF，HGF，NGF，BDNF，神经营养蛋白，BMF，铃蟾肽，M-CSF，血小板生成素，促红细胞生成素，SCF，SDGF，制癌蛋白，PDEGF和内皮肤1；细胞因子，如IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14和IL-15；干扰素α，β和γ；肿瘤坏死因子TNFα和TNFβ；趋化因子，如RANTES，MCAF，MIP-1α，MIP-1β，NAP和β-血小板球蛋白；肽激素，如SRH，SIH，STH，MRH，MSH，PRH，PIH，促乳素，LH-RH，FSH-RH，LH/ICSH，FSH，TRH，TSH，CRH，ACTH；血管紧张肽，细胞分裂素，或组胺或它们的同系物或类似物；类固醇激素，如雌激素，孕激素，雄激素，糖皮质激素或盐皮质激素，或它们的同系物或类似物；和维生素，如叶酸。
在本发明的上下文中，TS配体也可以是粘附分子，粘附分子的一部分或粘附分子的类似物，它们与位于细胞膜中的相应的粘附分子结合或与特异性结合粘附分子的靶细胞的另一结构结合。
这种能作为TS配体起作用的粘附分子的例子是Lewis X(对GMP-140而言)，S-Lewis X(对ELAM-1而言)，LFA-1(对ICAM-1和ICAM-2而言)，MAC-1(对ICAM-1而言)，VLA-4(对VCAM-1而言)，PECAM(对PECAM而言)，玻连蛋白(对玻连蛋白受体而言)，GMP-140(对于Lewis X)，S-Lewis X(对于ELAM-1)，ICAM-1，ICAM-2(对于LFA-1，MAC-1)，VCAM-1(或VLA-4)，纤连蛋白(对于VLA-4)，层粘连蛋白(对于VLA-6)，纤连蛋白，层粘连蛋白(对于VLA-1，VLA-2，VLA-3)，纤连蛋白(对于VLA-4)，血纤蛋白原(对于GPIIb-IIIa)，B7(对于CD28)，CD28(对于B7)，CD40(对于CD40L)和CD40L(对于CD40)。
在本发明上下文中，TS配体也可以是Fc受体的胞外部分(Dougherty et al.，Trahsfusion Science 17，121(1996))，特异于靶细胞的抗体通过其Fc部分与之结合。
在本发明上下文中，TS配体也可以是VDL受体或LDL受体(如LDL受体，LDL-相关受体蛋白，IgG的FC-受体(如FcγRII-B2，FcγRI)；88 KDa糖蛋白受体，乙酰化LDL受体，氧化LDL受体或megalin)的配体。这种特性的配体已被详细描述于文献中，它们是例如含有羧基末端部分的载脂蛋白B-100或其片段，载脂蛋白E，蛋白酶/抑制剂复合物，如tPA/PAI-1复合物，2-巨球蛋白，血小板反应蛋白或其结合肝素的氨基末端区(如氨基酸1-214)，氧化的LDL，乙酰化的LDL或乙酰基乙酰化的LDL，乙酰化的赖氨酸，脱唾液酸化LDL，丙二醛-缀合的LDL，甲醛-处理或戊二醛-处理过的白蛋白，马来酰化的白蛋白，39KDa受体-相关的蛋白质或其片段，例如那些含有氨基酸18-112，113-218和219-323或氨基酸1-114和114-319的蛋白质，乳铁蛋白，抑蛋白酶肽，脂蛋白脂肪酶，淀粉样前体蛋白(蛋白酶微管连接蛋白2)和假单胞菌外毒素。
在本发明的上下文中，TS配体也可以是抗体分子或抗体分子的表位-结合部分。
如使用鼠单克隆抗体，应优选使用其人源化的形式以限制其免疫原性，人源化可由Winter et al.(Nature 349，293(1991))和Hoogenboom etal.(Rev.Tr.Trahsfus.Hemobiol.36，19(1993))所描述的方式实现。可根据本技术领域的现成方法制备抗体片段，如通过Winter et al.，Nature349，293(1991)，Hoogenboom et al.Rev.Tr.Transfus.Hemobiol.36，19(1993)，Girol，Mol.Immunol. 28，1379(1991)或Huston et al.，Int.Rev.Immunol.10，195(1993)描述的方法。
重组抗体片段可从现成的杂交瘤直接制备，或也可使用噬菌体-展示技术(Smith，Science 228，1315(1985))(Winter et al.，Annu.Rev.Immunol.12，433(1994))从鼠或人抗体片段文库中分离，然后在基因水平上直接使用这些抗体片段以进一步操作(例如与其他蛋白质融合)。
为了由杂交瘤制备重组的抗体片段，通过分离mRAN，逆转录RNA得到cDNA，随后使用聚合酶链反应(Saiki et al.，Science230，1350(1985))和与可变片段的5’和3’末端分别互补的寡核苷酸(Orlandi et al.，PNAS-USA 86，3833(1989))扩增可得到编码抗体的抗原-结合区(VH，VL)的遗传信息。然后以例如Fv片段(Skerra&Pluckthun，Science 240，1038(1988))，单链Fv片段(sc-Fc)(Bird et al.，Science 242，423(1988)，Huston et al.，PNAS-USA 85，5879(1988))或Fab片段(Better et al.，Science 240，1041(1988))的形式将VH和VL片段克隆到细菌表达载体中。
也可使用噬菌体-展示技术从鼠或人源的抗体文库(免疫文库，首次用于实验的文库)中直接分离新的抗体片段。在抗体片段的噬菌体展示中，抗原-结合区作为与丝状噬菌体的g3P外被蛋白的融合蛋白，以scFv片段(McCafferty et al.，Nature 348，552(1990))或Fab片段(Hoogenboom et al.，Nucl.Acid Res.19，4133(1991)，Barbas et al.，PNAS-USA 88.7978(1991))的形式，或被克隆到噬菌体基因组中(McCafferyt al.，Nature 348，552(1990))，或被克隆到噬粒载体中(Breitling et al.，Gene 104，147(1991))。在载有抗原的塑料容器(淘选) (Marks et al.，J.Mol.Biol.222，581(1991))上，在与抗原缀合的顺磁珠(Hawkins et al.，J.Mol.Biol.226，889(1992))上或通过与细胞表面结合(Marks et al.，Bio/Technol.11，1145(1993))来选择与抗原结合的噬菌体。
通过PCR扩增得自人源化动物(Sastry et al.，PNAS-USA 86，5728(1989)，Ward et al.，Nature 341，544(1989)，Clackson et al.，Nature352，624(1991)或病人(Mullinax et al，.PNAS-USA87，8095(1990)，Barbas et al.，PNAS-USA 88，7978(1991))的B淋巴细胞的可变抗体片段可制备免疫文库。为此目的利用了特异于鼠(Orlandiet al.，PNAS-USA 86，3833(1989)，Sastry et al.，PNAS-USA86，5728(1989))或人免疫球蛋白基因(Larrick et al.，BBRC160，1250(1989))或特异于人免疫球蛋白基因家族(Marks et al.，Eur.J.Immunol.21，985(1991))的寡核苷酸的组合。
通过使用未被免疫接种的供体作为免疫球蛋白基因的来源可制备天然的基因文库(Marks et al.，J.Mol.Biol.222，581(1991))。另外，可使用免疫球蛋白种系基因制备半合成的抗体所有组成成分，同时使用简并的引物经PCR扩增可变片段的互补-决定区3(Hoogenboom&Winter，J.Mol.Biol.227，381(1992)，Barbas et al.，PNAS-USA 89.4457(1992)，Nissim et al.，EMBO J.13，692(1994)，Griffiths et al.，EMBO J.13，3245(1994))。与免疫文库相比，这些所谓的单-击(single-pot)文库具有优点，即可从一个单库中分离抗大量抗原的抗体片段(Nissim et al.，EMBO J.13，692(1994))。
通过使用噬菌体-展示技术仍可进一步增加抗体片段的亲和性，通过随机诱变(Hawkins et al.，J.Mol.Biol.226，889(1992)，Gram et al.，PNAS-USA 89，3576(1992))，以密码子为基础的诱变(Glaser et al.，J.Immunol.149，3903(1992))或定点诱变(Balint&Larrick，Gene 137，109(1993))，通过使用得自首次用于实验的所有组成成分的片段使各个区链改组(Marks et al.，Bio/Technol.10，779(1992))或使用细菌增变株(Low et al.，J.Mol.Biol.260，359(1996))，在严紧条件下重新选择分离出具有改良特性的抗体片段(Hawkins et al.，J.Mol.Biol.226，889(1992))可由现存的抗体片段制备新的文库。另外，通过逐步用人所有组成成分取代一个可变区，然后用原始抗原选择(指导选择)可使鼠抗体片段人源化(Jespers et al.，Bio/Technol.12，889(1994))。另外，通过用原始鼠抗体的相应区特异性取代人抗体的超变区也可使鼠抗体人源化(Jones et al.，Nature 321，522(1987))。
在本发明上下文中，TS配体也可以是通过其包膜蛋白与选定细胞特异性结合的病毒的包膜蛋白或包膜蛋白的一部分。TS配体的选择取决于欲被基因构建体转导的靶细胞。
对本发明有用的配体的例子包括的物质可激活内皮细胞，巨噬细胞和淋巴细胞；结合肌肉细胞，造血细胞，滑液细胞和炎性细胞；结合被病毒感染的细胞；结合如肝细胞的组织细胞；结合神经胶质细胞；和结合白血病细胞。此处只概括了这些配体的一些代表性例子。激活内皮细胞的TS配体在本发明的意义上，这些配体包括针对于内皮细胞膜结构的抗体或抗体片段，这一点描述于例如Burrows et al.，Pharmac.Ther.64，155(1994)，Hughes et al.，Cancer Res.，49，6214(1989)和Maruyama et al.，PNAS-USA 87，5744(1990)。具体地说这些配体包括抗VEGF受体的抗体。
TS配体也包括与内皮细胞膜结构或膜受体结合的所有活性化合物。例如这些配体包括在末端位置含有甘露糖的物质，而且还包括IL-1或生长因子，或它们的片段或其部分序列，这些配体能与内皮细胞表达的受体结合，所述受体为例如PDGF，bFGF，VEGF或TGFβ(Pusztain et al.，J.Pathol.169，191(1993))。
TS配体也包括针对LDL受体的配体，例如针对乙酰化LDL受体，氧化的LDL受体，LDL-相关受体蛋白(LRP)，88KDa糖蛋白受体和IgG的Fc受体的配体。这种性质的配体已在文献中有详细描述。
TS配体进一步包括与激活的和/或增殖的内皮细胞结合的粘附分子，这种性质的粘附分子如Slex，LFA-1，MAC-1，LECAM-1，VLA-4或玻连蛋白已经被描述(见Augustin-Voss et al.，J.Cell.Biol.119，483(1992)，Pauli et al.，Cancer Metast.Rev.9，175(1990)和Honn etal.，Cancer Matast.Rev.11，353(1992))。在本发明的意义上，TS配体具体地包括对内皮细胞具有嗜性的病毒外被糖蛋白，这些病毒的例子有线状病毒，例如带有其GP(糖蛋白)和sGP(第二糖蛋白)外被蛋白的马堡病毒或在每种场合下都带有其GP和sGP外被蛋白的Ebola病毒，特别地具有其gB蛋白的巨细胞病毒，人α疤疹病毒1型，HIV-1病毒，麻疹病毒，汉坦病毒，甲病毒原，如寒姆利基森林病毒，流行性出血热病毒，背髓灰质炎病毒，以及如ECHO9，ECHO12或柯萨奇B3病毒的肠道病毒。激活巨噬细胞和/或激活淋巴细胞的TS配体在本发明的意义上，配体可包括与免疫细胞表面特异性结合的物质，这种物质包括针对于免疫细胞膜结构的抗体或抗体片段，例如Powelson et al.，Biotech.Adv.11，725(1993)中有述。
TS配体进一步包括上文已有描述的LDL受体的所有配体，TS配体也可进一步包括通过其结合抗原的可变部分与免疫细胞上的Fc-y或Fc-ε或Fc-μ受体结合的单克隆或多克隆抗体或抗体片段(Rojanasakul et al.，Pharm.Res.11，1731(1994))。
这些配体也包括人单克隆或多克隆免疫球蛋白的Fc片段，通过例如使用重组DNA的基因操作法或根据Haupt et al.，Klin Wschr.47，270(1969)，Kranz et al.，Dev.Biol.Standard 44，19(1979)；Fehr et al.，Adv.Clin.Pharmac 6，64(1974)，Menninger et al.，Immunochem.13，633(1976)的方法可制备具有此特性的Fc片段。
TS配体进一步包括与免疫细胞表面的膜受体结合的所有物质，这些配体包括细胞因子，如IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-6，IL-10，TNFα，GM-CSF和M-CSF，和生长因子，如EGF，TGF，FGF，IGF或PDGF或它们的片段或其部分序列，所述配体与免疫细胞表达的受体结合。
TS配体进一步包括与细胞膜结构，如脾脏、肝脏、肺和其他组织巨噬细胞上的甘露糖6-磷酸酯受体结合的粘附分子和其他配体。这些配体和膜结构的选择见Perales et al.，Eur.J.Biochem.226，255(1994)。
在本发明的意义上，TS配体也包括来自对淋巴细胞和/或巨噬细胞有嗜性之病毒的包膜糖蛋白。感染巨噬细胞的这些病毒的例子是HIV-1，特别是那些在gP120的V3区具有突变的毒株，所述突变可导致对巨噬细胞的结合增加，HIV-2，汉坦病毒，例如Punmala病毒，巨细胞病毒，呼吸道合胞病毒，单纯疤疹病毒和线状病毒。
感染淋巴细胞的病毒的例子是人α疱疹病毒3型(VZV)，疤疹病毒6型(HHV-6)，狂犬病病毒，HIV-1，HTLV-II，HTLV-I，丙型流感病毒(因为丙型流感病毒通过血凝素-酯酶融合(HEF)蛋白与N-乙酰基-β-乙酰基神经氨酸(Neu5，9Ac)结合，这一事件优先在B淋巴细胞上发生，而在较低程度上或根本不在T淋巴细胞上发生)；在核苷酸位置872(编码HEF氨基酸序列的284位)处具有突变的丙型流感病毒，例如用异亮氨酸取代苏氨酸，因为具有此突变的HEF表面蛋白与野生型病毒的相比，对N-乙酰基-9-O-乙酰基神经氨酸受体有明显更强的亲和性；丙型流感病毒HEF裂解产物，它含有与N-乙酰基-9-β-乙酰基神经氨酸结合的结构，因为这一结合结构是由催化的三联体丝氨酸71，组氨酸368或369和天冬氨酸261确定的；人γ疤疹病毒4型，因为EBV感染B细胞，人α疱疹病毒2型，因为HSV-2感染T细胞，和麻疹病毒。肌肉细胞的TS配体与肌肉细胞表面结合的配体包括例如针对于肌肉细胞，尤其是平滑肌细胞膜结构的抗体或抗体片段。这一特性的抗体的例子是抗体10F3，抗肌动蛋白的抗体，抗血管紧张肽II受体的抗体或抗生长因子受体的抗体或针对于例如EGF受体，PDGF受体或FGF受体的抗体或抗内皮肽A受体的抗体。
TS配体进一步包括与肌肉细胞膜结构或膜受体结合的所有活性物质，这些配体包括例如生长因子或其片段或其部分序列，所述配体与平滑肌细胞表达的受体结合，所述受体如PDGF；EGF；TGFβ；TGFα；FGF和内皮肽A。
在本发明的意义上，TS配体也包括对肌肉细胞有嗜性的那些病毒的包膜糖蛋白，这些病毒包括例如巨细胞病毒。造血细胞的TS配体TS配体包括针对于相对未分化的血细胞上表达的受体的抗体或抗体片段，例如针对下列受体的这一特性的抗体已被描述干细胞因子受体，IL-1受体(I型)，IL-1受体(II型)，IL-3受体α，IL-3受体β，IL-6受体和GM-CSF受体。
TS配体也可进一步包括通过其恒定区与免疫细胞上的Fc-γ受体结合的单克隆或多克隆抗体或抗体片段。TS配体也包括与相对未分化的血细胞上的膜结构或膜受体结合的所有物质，这些配体包括例如与血细胞表达的受体结合的生长因子，如SCF，IL-1，IL-3，IL-6和GM-CSF或其片段或其部分序列。滑液细胞和炎性细胞的TS配体这些配体包括通过其可变区与滑液细胞或炎性细胞的膜结构结合的单克隆或多克隆抗体或抗体片段，这种膜结构的例子是波形蛋白，纤连蛋白和Fc受体。这些配体也包括通过其恒定区与Fc受体结合的单克隆或多克隆抗体或抗体片段。这些配体进一步包括与滑液细胞上的膜结构或膜受体结合的所有活性化合物，这些化合物包括例如细胞因子或生长因子或其片段或其部分序列，它们与滑液细胞表达的受体如IL-1-RA，TNFα，IL-4，IL-6，IL-10，IGF和TGFβ结合。这些配体进一步包括必需成分为末端甘露糖的TS配体，它与巨噬细胞上的甘露糖6-磷酸酯受体结合。被病毒感染的细胞的TS配体TS配体也可以是针对于被病毒感染的细胞的细胞膜上表达的病毒抗原的抗体或抗体片段，例如，被HBV，HCV，HSV，HPV，HIV，EBV和HTLV病毒感染的细胞的这一特性的抗体已被描述。肝细胞和其他组织细胞的TS配体TS配体包括与肝细胞表面膜结构或膜受体结合的所有物质，这些配体包括例如与此类细胞表达的受体结合的生长因子，如细胞因子，EGF，TGF，FGF或PDGF或其片段或其部分序列，这些配体进一步包括与细胞膜结构结合的TS配体，所述细胞膜结构相对于特殊组织而言是选择性的。例如
表1膜结构 TS配体 组织细胞脱唾液酸糖蛋白 脱唾液酸血清类粘蛋 肝细胞白受体新糖蛋白(neoglycoprotein)半乳糖运铁蛋白受体运铁蛋白肝脏和其他组织细胞胰岛素受体 胰岛素 肝脏和其他组织细胞甘露糖6-磷酸酯 甘露糖 脾、肝、肺和其他组织受体中的巨噬细胞Fc-γ受体 免疫球蛋白G 网状内皮系统和其他组织这些配体和膜结构参见Perales et al.，Eur.J.Biochem.226，255(1994)。在本发明意义上，TS配体具体包括对选择性细胞有嗜性的病毒的包膜糖蛋白，如支气管细胞呼吸道合胞病毒的糖蛋白，肝细胞丙型肝炎病毒，线状病毒，乙型肝炎病毒和丁型肝炎病毒的糖蛋白。例如，肝细胞通过脱唾液酸糖蛋白受体与马堡病毒结合或者肝细胞优选通过脱唾液酸糖蛋白受体与HBV的pre S2和pre S1区结合。另一例子是肝脏窦状细胞乙型肝炎病毒的糖蛋白，因为HBV通过纤连蛋白被结合。神经胶质细胞的TS配体这些配体包括已由例如Mirsky et al.，Coakham et al.，和Mckeeveret al良导的针对于神经胶质细胞膜结构的抗体或抗体片段，这些膜结构进一步包括如N-CAM的神经粘附分子，尤其是它的多肽C链。
这些配体也包括与神经胶质细胞膜结构或膜受体结合的所有活性化合物，例如，这些配体包括在末端位置携有甘露糖的物质，所述物质与甘露糖6-磷酸酯受体结合，还包括胰岛素和胰岛素样生长因子和PDGF，以及与相关膜受体结合的这些生长因子的那些片段。
在本发明意义上，TS配体具体包括对神经胶质细胞有嗜性的那些病毒的包膜糖蛋白，这些病毒的例子是HIV-1亚型JRF1和人α疤疹病毒I型。白血病细胞的TS配体这些配体包括针对于白血病细胞上膜结构的抗体或抗体片段，已描述了大量用于诊断和治疗法的这一特性的单克隆抗体(见Kristensen，Danish Medical Bulletin 41，52(1994)；Schranz，TherapiaHungarica 38，3(1990)；Drexler et al.，Leuk，Res.10，279(1986)；Naeim，Dis.Markers 7，1(1989)；Stickney et al.，Curr.，Opin，Oneol，4，847(1992)；Drexler et al.，Blut 57，327(1988)；Freedman et al.，CancerInvest，9，69(1991))。根据白血病的类型，下述单克隆抗体或其与抗原结合的抗体片段适于用作配体(1)对于AML细胞，膜抗原CD13，CD14，CD15，CD33，CAMAL，Sialosyl-Le；(2)对于B-CLL膜抗原CD5，CD1c，CD23，膜免疫球蛋白的独特型和同种型；(3)对于T-CLL膜抗原CD33，M38，IL-2受体，T细胞受体；(4)对于ALL膜抗原CALLA，CD19，非-霍奇金淋巴瘤。
TS配体进一步包括与白血病细胞的膜结构或膜受体结合的所有活性化合物，这些配体包括例如与白血病细胞表达的受体结合的生长因子或其片段或其部分序列。
这一特性的生长因子已被描述(见Cross et al.，Cell64，271(1991)；Aulitzky et al.，Drugs 48，667(1994)；Moore，Clin.CancerRes.1，3(1995)；和Van Kooten et al.，Leuk.Lymph，12，27(1993))。例如在非-霍奇金淋巴瘤的情况下为IFNα；IL-2，尤其在T细胞白血病的情况下；在T细胞，单核细胞，骨髓，红细胞和成巨核细胞白血病的情况下为FGF；在白血病的情况下为TGFβ以及，在急性前髓细胞白血病的情况下为类视色素，如视黄酸。肿瘤细胞的TS配体这些配体包括针对于肿瘤细胞膜结构的抗体和这些抗体的片段，这一特性的抗体已描述于例如Sedlacek et al.，Contrib，toOncol.32，Karger Verlag，Munich(1988)和Contrib.toOncol.43，Karger Verlag，Munich(1992)。
其他例子的抗体抗Sialyl Lewis，被T细胞识别的肿瘤上的肽，由癌基因表达的蛋白质，如GD3，GD2，GM2，9-0-乙酰基GD3和Fucosyl GM1的神经节苷脂，血类抗原和它们的前体，多形内皮粘蛋白上的抗原和热休克蛋白上的抗原。接头接头的选择取决于TS配体和GS配体的化学性质以及用来通过接头将TS配体和GS配体互相连接的方法。如果配体是肽或蛋白质，则优选使用肽或蛋白质作为接头，优选利用肽键使接头将TS配体和GS配体相互连接。优选使用重组DNA技术将这一特性的TS配体-接头-GS配体或TS配体-GS配体-接头分子制备成融合蛋白。一般，有利的接头将是内源生成的物质或类似内源性物质以限制其免疫原性。
如果TS配体不是肽或蛋白质，最简单形式的接头将是连接TS配体和GS配体的结构。用于将分子与蛋白质上的氨基基团，羟基基团，SH基团，羰基基团或醛基结合的不同的化学缀合法可得到这一特性的结构(见Sedlacek et al.，Contrib.to Oncol.32，42-49和81-85，KargerVerlag，Munich(1988))。
在各种情况下，接头和GS配体自身也可以是肽或蛋白质，此时，优选通过肽键和通过使用一个化学缀合法与接头连接实现接头与GS配体间的连接，尤其在本发明实施方案C)中应用了此方法。
接头的选择还取决于被GS配体结合的基因构建体的特性，如果基因构建体是或单独或与非病毒载体复合的裸露的RNA或裸露的DNA，接头优选为具有融合特性的分子。这些融合特性便于基因构建体穿过细胞膜并突破溶酶体从而进入胞质。
如果基因构建体是病毒，可选择具有融合特性的分子作为接头。在本发明的意义上，优选使用具有融合特性的接头。接头的融合特性可以补偿因GS配体与病毒的结合造成的病毒外被蛋白融合特性的损害，或增强病毒外被蛋白的融合特性。
在本发明的意义上，病毒或细菌肽或蛋白质以及合成肽(例如在核内体的酸环境中形成α-螺旋的那些肽)可用作具有融合特性的接头。具有融合特性的分子的例子是含有假单胞菌外毒素A的移位区(III区)的肽(Wels et al.，Cancer Res.52，6310(1992)；Fominaga et al.，J.Biol.Chem.271，10560(1996))，含有肽GLFEALLELLESLWELLLEA(SEQ ID NO.1))的肽(Gottschalk et al.Gene Ther.3 448(1996))，含有肽AALAEA[LAEA]4LAAAAGC(SEQ ID No2))的肽(Wang etal.，Technol. Advances in Vector SVst.For Gene Ther.，May 6-7，1996，Coronado，IBC Conference)，含有麻疹病毒融合蛋白肽FAGVVLAGAALGVAAAAQI(SEQ ID NO.3)的肽(Yeagle et al.，Biochem.Biophys.Acta 1065，49(1991))，含有甲型流感病毒HA2蛋白肽GLFGAIAGFIEGGWWGMIDG(SEQ ID NO.4)的肽(Luneberg et al.，J.Biol.Chem.270，27606(1995))，含有肽GLFGAIAGFIENGWEGMIDGGLFGAIAGFIENGWEGMIDG(SEQ ID NO.5)的肽(Burger et al.，Biochem.30，11173(1991))或肽GLFGAIAGFIE；(SEQ ID NO.6)，ALFGAIAGFIE；(SEQID NO.7)，LFLGAIAGFIE；(SEQ ID NO.8)，LLLGAIAGFIE；(SEQ ID NO.9)，LILGAIAGFIE；(SEQ IDNO.10)，GIFGAIAGFIE；(SEQ ID NO.11)，GLLGAIAGFIE；(SEQ ID NO.12)，GLFAAIAGFIE；(SEQID NO.13)，GLFEAIAGFIE；(SEQ ID NO.14)，GLFGAMAGFIE；(SEQ ID NO.15)GLFGAIAGLIE(SEQ IDNO.16)或肽GLFGAIAGFIV(SEQ ID NO.17)(Steinhauer etal.，J.virol.69，6643(1995))或肽GLFEAIAEFIEGGWEGLIEG(SEQ ID No.18)或肽GLLEALAELLEGGWEGLLEG(SEQ IDNO.19)(Ishiguro et al.，Biochem.32 9792(1993))。
在本发明的上下文中，进一步使用了具有融合特性的病毒蛋白质，大量病毒具有融合的外被蛋白，例如副粘病毒，逆转录病毒和疱疹病毒(Gaudin et al.，J.Gen.Virol.76，1541(1995))。大量病毒还具有对病毒吸附和随后的细胞膜融合起作用的糖蛋白(Gaudin et al.，J.Gen.Virol.76，1541(1995))，通过如甲病毒属，弹状病毒和正粘病毒可形成此特性的蛋白质。
本发明意义上的病毒融合蛋白已被描述于Hughson，Curr.Biol.5，265(1995)；Hoekstra，J.Bioenergetics Biomembranes 22，675(1990)；White，Ann.Rev，Physiol.52，675(1990))。本发明意义上的融合蛋白的例子是甲型或乙型流感病毒的血凝素，尤其是HA2成分，甲型流感病毒的M2蛋白，或单独或与流感病毒血凝素或缺乏酶活性但却带来血凝作用的甲型流感病毒神经氨酸酶的突变体联合使用(Ohuchi et al.，J.Virol.68，920(1994))，流感病毒血凝素的肽类似物，丙型流感病毒的HEF蛋白，HEF蛋白的融合活性通过将HEF0裂解为HEF1和HEF2亚单位而被激活，线状病毒的跨膜糖蛋白，例如马堡病毒和欧鲍拉病毒的跨膜糖蛋白，狂犬病病毒的跨膜糖蛋白，水泡性口炎病毒的跨膜糖蛋白(G)，HIV病毒的融合蛋白，尤其是gp41成分及其融合成分，仙台病毒的融合蛋白，尤其是F1成分的33个氨基末端氨基酸，寒姆利基森林病毒的跨膜糖蛋白，尤其是E1成分，蜱传脑炎病毒的跨膜糖蛋白，人呼吸道合胞病病毒(RSV)的融合蛋白(尤其是gP37成分)，乙型肝炎病毒的融合蛋白(S蛋白)，麻疹病毒的融合蛋白，新城疫病毒的融合蛋白，维斯纳病毒的融合蛋白，鼠白血病病毒的融合蛋白(尤其是p15E)，HTL病毒的融合蛋白(尤其是gp21)和猴免疫缺损病毒(SIV)的融合蛋白。
通过Mannio et al.，BioTechniques 6，682(1988)所述的借助于去污剂(如β-D-辛基吡喃葡糖苷)溶解病毒浓缩液中的外被蛋白并通过离心分离之，或者利用本领域技术人员已知的分子生物学方法可得到病毒融合蛋白。下述融合蛋白的制备已被描述，例如流感病毒血凝素，流感病毒血凝素的融合片段，乙型流感病毒的M2蛋白，丙型流感病毒的HEF蛋白，线状病毒，例如马堡病毒和欧鲍拉病毒的跨膜糖蛋白，狂犬病病毒的跨膜糖蛋白；水泡性口炎病毒的跨膜糖蛋白，寒姆利基森林病毒的跨膜糖蛋白，蜱传脑炎病毒的跨膜糖蛋白和HIV-1病毒的跨膜糖蛋白。基因构建体特异性配体在本发明的上下文中，GS配体是直接或间接与基因构建体结合的结构，它含有整个抗体分子或抗体的结合表位的片段。优选使用人源化形式的鼠单克隆抗体以限制其免疫原性，人源化的实现已被描述于“TS配体的描述”这一节，是以Hoogenboom等人(Rev.Tr.Transfus.Hemobiol.36，19(1993))和Winter等人(Nature 349，293(1991)所描述的方式。根据本技术领域已知的方法和“TS配体的描述”这一节中已述的方法制备抗体片段和重组的Fv片段。
是否使用二价或单价片段取决于抗体特异性和基因构建体的选择，如果选定的抗体损害了病毒基因构建体外被蛋白的融合活性则优选单价抗体片段(例如Ubol et al.，J.Virol.69 1990(1995)所述)。
抗体的特异性取决于所用基因构建体的特性，如果基因构建体是裸露的RNA或裸露的DNA，或单独或与非病毒载体复合，本发明的一个新实施方案是抗体的特异性是针对于那些已被引入DNA中的表位。
通过DNA的一种或多种修饰，引入或不引入外源基团(外源基因物质)可产生这一特性的表位。此例包括将DNA与顺式铂氨交联，用如氮芥，苯丙氨酸氮芥或苯丁酸氮芥的烷基化剂使鸟嘌呤的N7烷基化，将如阿霉素或道诺霉素的蒽类嵌入DNA的双螺旋中。
具有抗经修饰的DNA表位的结合特异性的单克隆抗体的例子包括针对于甲基化DNA，O6-乙基脱氧鸟苷(用乙基亚硝基脲处理DNA后)，N7-乙基鸟嘌呤，N5-甲基-N5-甲酰基-2，5，6-三氨基-4-羟基嘧啶，O6-甲基-2’-脱氧鸟苷，O6-乙基-2’-脱氧鸟苷，O6-正-丁基-2’-脱氧鸟苷，O6-异丙基-2’-脱氧鸟苷，O4-甲基-2’-脱氧胸苷，O4-乙基-2’-脱氧胸苷，苯丙氨酸氮芥和DNA和蒽类的加成产物。本申请上下文中的一些有用的表位是那些通过在DNA代谢过程中DNA的甲基化在DNA中产生的。
已知大肠杆菌菌株可使已引入细菌中的质粒DNA甲基化，甲基化作用发生在腺嘌呤的N6位(Winnacker，From Genes to Clones，p18/19，VCH Publisher，Weinheim(1987))。细菌具有DNA腺嘌呤甲基化酶，该酶在细菌复制过程中特异地使N6位的腺嘌呤甲基化(Hattman et al.，J.Mol.Biol.126，367(1978))。因此，本发明具体地涉及在新的配体系统中，抗甲基化DNA的单克隆抗体的用途，更具体地涉及抗甲基化的腺嘌呤N6的单克隆抗体的用途。
如果基因构建体与非病毒载体复合，本发明另一个特定的实施方案是抗体的特异性为针对于载体上的表位，这些载体包括阳离子聚合物，肽，蛋白质，多胺或阳离子类脂，如阳离子类脂和磷脂。抗这一特性载体的抗体的例子是抗亚精胺，精胺，腐胺，多聚赖氨酸，白蛋白和磷脂的抗体。
如果基因构建体是病毒，抗体的特异性为抗病毒外被蛋白一个或多个相同或不同的表位。由于所用配体系统中的接头优选为融合肽或蛋白质，也可使用通过与外被蛋白结合而损害细胞粘附和/或病毒的融合活性的抗体。抗可用作载体的病毒的外被蛋白的抗体的例子是抗鼠白血病病毒，尤其是抗外被蛋白gp70和p15的抗体，抗HIV病毒，腺病毒，单纯疤疹病毒，尤其是抗此病毒的糖蛋白B，糖蛋白H，糖蛋白L和糖蛋白D的抗体，抗巨细胞病毒，尤其是抗糖蛋白B(gpB)，小鼠微小病毒，腺相关病毒，尤其是抗cap和rep蛋白，新培斯病毒，尤其是抗包膜蛋白E2或E以及牛痘病毒的抗体。
在本发明另一个有利的实施方案中，GS配体是细胞外Fc受体的一部分，上文提及的利用其抗原结合区与基因构建体直接或间接结合的抗体之一通过其Fc部分与此Fc受体结合。
在另一个有利的实施方案中，GS配体是能与基因构建体复合的阳离子结构单位，如阳离子的氨基酸，阳离子的肽或蛋白质或来源于生物的胺。这些阳离子结构单位的例子包括赖氨酸，多聚赖氨酸，精氨酸，多聚精氨酸，组氨酸，多聚组氨酸，含有至少一个赖氨酸，一个精氨酸和/或一个组氨酸的肽以及多胺，如尸胺，亚精胺，精胺，鲱精胺或腐胺。
在另一个有利的实施方案中，GS配体是具有转基因的病毒的外被蛋白的受体，已描述了下述病毒的这一特性的受体涉及CD4分子(可溶的或天然的)和半乳糖神经酰胺的HIV，涉及IL-6受体和膜联蛋白或载脂蛋白的HBV，涉及IL-2受体(β和γ链)的HTLV，涉及CD46分子的麻疹病毒，涉及促红细胞生成素受体的Friend白血病病毒，涉及人免疫球蛋白G的Fc片段的人α疤疹病毒3型，涉及血型糖蛋白的仙台病毒，涉及N-乙酰基-9-乙酰氨基-9-脱氧神经氨酸和9-O-乙酰基-N-乙酰神经氨酸的丙型流感病毒，涉及整联蛋白αVβ3的口蹄疫病毒，涉及补体受体2(CD21)的EBV和涉及275KDa甘露糖6-磷酸酯受体或46KDa甘露糖6-磷酸酯受体的单纯疤疹病毒。作为至少两个分子的复合物(“连接物”)的接头在本发明特殊实施方案c)的意义上，连接物是含有至少两个分子或成分的特殊类型的接头。连接物的一个分子或成分与至少一个基因构建体特异性配体结合，连接物的另一个分子或成分与至少一个靶细胞特异性配体结合。复合物进一步有利地含有至少一个其他“可供选择的接头”，可供选择的接头可以是融合肽。在不止一种接头的情况下，可供选择的接头在化学上可以是相同或是不同的。融合肽有利于核酸进入靶细胞，在本发明上下文中另一个可供选择的接头可以是产生如放射性同位素的物质的信号以允许检测进入细胞的复合物的量。
有利的连接物的例子是抗体的绞链区，籍此抗体的两条重链相互连接(Burbon，TIBS 15，64，(1990)；Oi et al.，Nature 307，136(1984)；Alt etal.，Science 238，1079(1987)；Lorenz，degree dissertationKonstruktionund Expression von rek.Antikorper-Enzym-Hvbridmolekulen fur dieTumortherapie[Construction and expression of rec.antibody/enzyme hybrid molecules for tumor therapy]，Faeulty of HumanMedicine，Marburg University(1991))。
例如，图2的简图C1)中显示了绞链区新的排列，绞链区优选以融合蛋白的形式通过肽键与接头和与GS和TS配体连接，所述融合蛋白是使用重组DNA技术制备的。
连接物的另一个例子是根据图3中的简图C2)，与Gal4的Gal80-结合区(Leuther et al.，Science 256，1333(1992))联合的Gal80蛋白(Leuther et al.，Science 256，1333(1992))。
下述实施例的目的是为了阐明而不是限制本发明，实施例中显示了如图4所示多功能系统的构建。
实施例1TS配体的制备抗-NCAM单克隆抗体575/100/2的杂交瘤被用作TS配体的起始物质(Jaques et al.，Cancer 72，418(1993))。通过离心分离了此杂交瘤的大约107个细胞，使用Pharmacia mRNA提取试剂盒从这些细胞中提取mRNA，然后通过使用cDNA合成试剂盒和随机六寡核苷酸(Pharmacia)的逆转录将此mRNA转录成cDNA，此cDNA被用作通过使用特定的引物(Clackson et al.，Nature 352，624(1991))的聚合酶链反应(Saiki et al.，Science 230，1350(1985))扩增免疫球蛋白的可变重链或可变轻链的起始物质。同时，引物引入了限制性酶切位点以将片段克隆到细菌表达载体pHENIS(从pHENI衍生而来；Hoogenboom et al.，Nucl.Acids Res.19，4133(1991)；见图5)。此载体含有pelB信号序列以供外周质分泌，myc标记物以供用单克隆抗体9E10来检测，组氨酸标记物以通过固定化的金属亲和层析(IMAC)纯化，还含有重链和轻链的编码区和编码14个氨基酸长的甘氨酸-丝氨酸接头的短序列。另外，为了在噬菌体表面展示，应与g3β蛋白融合。用适当的限制性酶(VH用SfiI和ShoI；VL用ApaLI和NotI)消化重链和轻链并依次克隆到载体中，从而得到含有通过短肽序列共价连接的可变重链和轻链的重组单链Fv片段。
实施例2GS配体的制备通过在N6-甲基腺嘌呤-BSA或N6-甲基腺嘌呤-甲状腺球蛋白缀合物上生物淘选(Beiser et al.，Methods Enzymol.XII，889(1968)从天然或半合成的抗体文库中选择对N6-甲基腺嘌呤(Sigma)有特异性的重组抗体(Nissim et al.，EMBO J.13，692(1994))。通过ELISA在被抗原包被的微量滴定板中鉴定阳性抗体片段(Nissim et al.，EMBOJ.13，692(1994))。得自这些文库中的抗体已经是所需的单链Fv形式，可被直接用于随后的克隆。
实施例3接头的制备具有氨基酸序列GLFEALLELLESLWELLLEA(SEQ IDNO.1，Gottschalk et al.，1996)的融合肽被用作接头，编码此肽的DNA被制备成双链合成寡核苷酸，在其末端偶联有适当的限制性切割位点(Ascl和XbaI)。为此，根据制造商的说明，使用T4多多核苷酸激酶(Gibco)使两个合成的寡核苷酸O1(5’GGCCGCAGGCTTATTTGAGGCCCTTCTGGAATTGCTAGAGAGCCTCTGGGAATTGCTTCTGGAGGCAT，SEQ ID No.20)和O2(5’CTAGATGCCTCCAGAAGCAATTCCCAGAGGCTCTCTAGCAATTCCAGAAGGGCCTCAAATAAGCCTG，SEQ ID No.21)磷酸化，加热至80℃达5分钟，然后缓慢冷至室温，此双链DNA片段被直接用于随后的克隆。
实施例4多功能配体的制备在表达载体pAB1(按与pHENIS相似的方法构建，但不包括与g3p融合；见图5)中以3-片段克隆的形式制备完整的配体系统。被限制性酶SfiI和NotI切割的抗-NCAM单链Fv片段(TS配体)，含有克隆位点NotI和XbaI的接头以及抗-N6-甲基腺嘌呤单链Fv片段(GS配体)被用作起始物质。为了克隆，使用分别在N末端和C末端插入限制性切割位点XbaI和AscI的引物重新扩增GS片段，这些片段被克隆到已被限制性酶SfiI和AscI切割的pAB1载体中，将构建体转化到细菌菌株TG1中，配体系统的表达受细菌lacZ启动子的调节，并通过加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导配体系统的表达(如McCafferty et al.，Appl.Biochem.Biotech.47，157(1994)所述)。根据Griffiths et al.，EMBO J.13，3245(1994)的方法使用IMAC从外周质制品中纯化经表达的蛋白质，总蛋白质的分子量约为55,000道尔顿，表现为单聚体。
实施例5检测多功能配体的运作使用本领域技术人员已知的细胞培养技术在细胞培养物中繁殖表达NCAM的肿瘤细胞(小细胞支气管癌)并分离之。通过在大肠杆菌中繁殖质粒(含有β-葡糖醛酸酶的结构基因，见专利申请WO96/06940)来制备腺嘌呤的N6已甲基化的DNA。
以20∶1的摩尔比将多功能配体系统与质粒DNA混合，将混合物置于37℃下保温30分钟，通过ELISA检查质粒DNA的结合，将含有多功能配体和质粒的复合物与肿瘤细胞以10∶1的比例相混合，混合物置于37℃下保温1小时，洗涤肿瘤细胞部分，通过免疫荧光法检查复合物与这些肿瘤细胞的结合，余下的肿瘤细胞再保温24小时，通过使用4-甲基繖形基-β-葡糖苷酸作为底物检测培养基中β-葡糖苷酸酶的酶活性可测定复合物被成功地摄入细胞，接头介导的从核内体中的释放以及效应基因的转录和表达。
权利要求
1.用于靶细胞特异性转移核苷酸序列的多功能配体系统，含有至少一种靶细胞特异性配体，至少一种含有抗体或抗体部分的基因构建体特异性配体，和连接这两个配体的接头，其中所述系统是非免疫原性的。
2.如权利要求1所要求的配体系统，进一步含有将所述两个配体连接在一起的连接物，其中连接物含有两个接头。
3.如权利要求1或2所要求的配体系统，其中所述靶细胞特异性配体与靶细胞表面结合。
4.如权利要求1-3中任一个所要求的配体系统，其中所述靶细胞特异性配体选自由下列物质组成的组生长因子，细胞因子，干扰素，肿瘤坏死因子，趋化因子，肽激素、血管紧张肽，细胞分裂素，组胺，类固醇激素，粘附分子，VDL受体的配体，LDL受体的配体，氧化的LDL受体的配体，LDL相关受体蛋白的配体，IgGFc受体的配体，88KDa糖蛋白受体的配体，乙酰化的LDL受体的配体，megalin配体和维生素。
5.如权利要求1-3中任一个所要求的配体系统，其中所述靶细胞特异性配体是与靶细胞结合的抗体或抗体片段。
6.如权利要求5所要求的配体系统，其中所述抗体片段选自由下列物质组成的组F(ab)2片段，Fab片段，双链Fv片段，单链Fv片段和Fc片段。
7.如权利要求1-3中任一个所要求的配体系统，其中所述靶细胞特异性配体是由抗体Fc片段识别的Fc受体的细胞外区。
8.如权利要求5-7中任一个所要求的配体系统，其中所述抗体或抗体片段至少部分来源于人。
9.如权利要求1-8中任一个所要求的配体系统，其中所述基因构建体特异性配体选自由下列物质组成的组抗体，抗体片段，阳离子结构单位和病毒外被蛋白的受体。
10.如权利要求9所要求的配体系统，其中所述抗体片段选自由下列物质组成的组F(ab)2片段，Fab片段，双链Fv片段和单链Fv片段。
11.如权利要求1-8中任一个所要求的配体系统，其中所述基因构建体特异性配体是由抗体Fc片段识别的Fc受体的细胞外区。
12.如权利要求1-11中任一个所要求的配体系统，其中所述抗体或抗体片段至少部分来源于人。
13.如权利要求1-12中任一个所要求的配体系统，其中所述抗体或所述抗体片段与通过将外源物质与核酸结合，使核酸甲基化或使核酸烷基化而引入的核酸表位特异性结合。
14.如权利要求1-13中任一个所要求的配体系统，其中所述抗体或所述抗体片段与非病毒载体上的表位结合。
15.如权利要求14所要求的配体系统，其中所述非病毒载体选自由下列物质组成的组阳离子聚合物，肽，蛋白质，生物来源的胺、多胺，类脂和磷脂。
16.如权利要求1-15中任一个所要求的配体系统，其中所述抗体或所述抗体片段与病毒外被蛋白的表位结合。
17.如权利要求16所要求的配体系统，其中所述病毒选自由下列物质组成的组鼠白血病病毒，HIV，腺病毒，单纯疱疹病毒，巨细胞病毒，小鼠的微小病毒，腺相关病毒，新培斯病毒和牛痘病毒。
18.如权利要求9所要求的配体系统，其中所述阳离子结构单位单独或联合含有至少一个赖氨酸残基，至少一个精氨酸，至少一个组氨酸和至少一个多胺。
19.如权利要求2-18中任一个所要求的配体系统，其中所述连接物含有与功能性残基共价连接的组成成分，功能性残基选自由下列物质组成的组氨基残基，羟基残基，SH残基，羰基残基和醛残基。
20.如权利要求2-19中任一个所要求的配体系统，其中至少一个所述接头是融合物质。
21.如权利要求20所要求的配体系统，其中所述融合物质选自由下列物质组成的组合成融合肽，细菌融合肤或蛋白质和肤或蛋白质与病毒之间的融合产物。
22.如权利要求2-21中任一个所要求的配体系统，其中所述连接物含有抗体绞链区或与Gal4蛋白结合的Gal80蛋白。
23.如权利要求1所要求的配体系统，含有(a)含有抗NCAM重组单链Fv片段的靶细胞特异性配体，其中通过短肽序列使Fv片段的可变重链和轻链共价连接；(b)含有融合肽的接头，所述融合肽具有序列GLFEALLELLESLWELLLEA(SEQ ID No.1)和(c)含有N6-甲基腺嘌呤的重组抗体的基因构建体特异性配体。
24.如权利要求23所要求的配体系统，进一步含有基因构建体。
25.如权利要求24所要求的配体系统，其中所述基因构建体选自由下列物质组成的组裸露的RNA，质粒，与阳离子聚合物，肽，蛋白质，或类脂结合的裸露的核酸或质粒，和病毒。
26.权利要求1-25中任一个所要求的配体系统在制备用于预防或治疗皮肤病，粘膜病，神经系统疾病，内部器官疾病，血凝结疾病，造血系统疾病，免疫系统疾病，肌肉系统疾病和支持组织或关节病的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及非免疫原性的可对核苷酸序列进行细胞特异性转移的多功能配体系统,所述系统包括至少一种靶细胞特异性配体,至少一种接头和至少一种基因构建体特异性配体,基因构建体特异性配体有利地含有直接或间接与基因构建体结合的抗体或其部分。本发明还涉及配体系统在制备用于预防或治疗皮肤病,粘膜病,神经系统疾病,内部器官疾病,血液凝结疾病,造血系统疾病,免疫系统疾病,肌肉系统疾病和支持组织或关节病的药物或疫苗中的用途。
文档编号A61K48/00GK1188149SQ9710858
公开日1998年7月22日 申请日期1997年11月28日 优先权日1997年11月28日
发明者H－H·塞德拉西克, R·默勒 申请人:赫彻斯特股份公司