专利名称：Pkc抑制剂在制备治疗aids药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抑制潜伏的人免疫缺陷病毒(HIV)活化的方法。本发明还涉及一种抑制HIV复制的方法。特别是，本发明涉及一类特定的同功酶选择性蛋白激酶C(PKC)抑制剂用于治疗HIV感染的用途。
2．有关现有技术HIV的流行以很快的速度在不断扩大，而与此病毒感染有关的临床表现成为更复杂的医学和社会经济学问题。急性HIV感染可引起一个病毒快速复制期，随后的病毒血症将导致1％或更多循环T淋巴细胞感染，这是病毒的首选目标。然而，病毒血症只是短暂的，因为被HIV感染的细胞将被宿主有效的免疫应答由循环中除去，结果HIV感染的T细胞将减少10-100倍。遗憾的是，感染后尚没有有效的治疗方法来阻止病毒活化。因此，尽管最初宿主应答可有效地减低和控制HIV感染细胞的数量，但其不足以阻止后整合潜伏或低水平存留(LLP)宿主贮源细胞的无症状感染，例如循环的CD4+T淋巴细胞和单核细胞/巨噬细胞。这样，HIV的最终致病作用不能被阻止，而且当潜伏或LLP状态被诱导后，将发展成为获得性免疫缺陷综合症(AIDS)。
对于HIV感染尚没有发现治愈的病历。现在对HIV感染的治疗只试图延缓疾病的发展或缓解其症状。如今应用于治疗中的包括某些二脱氧核苷酸例如叠氮胸苷(AZT或齐多呋定、Burroughs Wellcome)、二脱氧肌苷(ddI、Bristol-Myers Squibb)或二脱氧胞嘧啶核苷(ddC,Hoffman-LaRoche)。这些制剂均可以导致中毒。它们的应用是有限的，因为对于某些患者会出现一些麻烦，并且有时会出现致死、副作用。这些副作用包括骨髓抑制、末梢神经病和胰腺炎。对于有些患者，长期使用AZT后会失效。而对于建议可用于治疗HIV感染的其他药物，包括最近引用的几种HIV蛋白酶抑制剂，尚没有一种表明是完全有效的。因此，在该领域仍需要开发其他治疗HIV感染的治疗剂。
发明概述因此，本发明一个目的是提供一种抑制感染细胞中人免疫缺陷病毒复制的方法。
本发明另一个目的是提供一种抑制感染细胞中人免疫缺陷病毒活化的方法。
本发明还有一个目的是提供一种治疗人免疫缺陷病毒感染的哺乳动物的方法。
本发明的这些以及其他目的将由一个或多个下文所述实施方案给出。
本发明一个实施方案是提供一种抑制感染细胞中人免疫缺陷病毒复制的方法，该方法包括将所述细胞与病毒复制抑制量的蛋白激酶C的β同功酶抑制剂相接触。
本发明另一个实施方案是提供一种抑制感染细胞中人免疫缺陷病毒活化的方法，该方法包括将所述细胞与病毒活化抑制量的蛋白激酶C的β同功酶抑制剂相接触。
本发明还有一个实施方案是提供一种治疗人免疫缺陷病毒感染的哺乳动物的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的蛋白激酶C的β同功酶抑制剂。
这样，本发明为本领域提供了有效治疗HIV感染的化合物的证明。发明详述本发明发现，在治疗上应用特定的一类蛋白激酶C抑制剂，即蛋白激酶C的β同功酶抑制剂，并且特别是PKCβ同功酶选择性抑制剂，可抑制HIV的活化和复制，特别是与PKC信号转导途径有关的此类活化和复制。所述特定的一类PKC抑制剂还可抑制与cAMP信号转导途径有关的HIV活化和复制。因此，此类化合物可用于对HIV感染的患者的治疗。
HIV感染过程有这样一个特点，即在出现短暂的病毒血症高峰期后，尽管可能不尽相同，但通常会出现一个较长的无疾病症状的潜伏期或持续感染期。HIV前病毒躲藏在例如外周单核细胞和T淋巴细胞的细胞中，在单核细胞和T淋巴细胞中潜伏的HIV前病毒的活化是引起与AIDS综合症有关的临床病症发作的重要步骤。HIV活化包括生产性感染阶段和潜伏感染的再活化阶段。HIV复制包括在生产性感染和潜伏感染的再活化过程中HIV病毒基因组的倍增。整合的潜伏HIV基因组的再活化包括HIV复制，例如形成HIV基因组的多重转录，HIV表达，例如病毒特异性蛋白例如p24的翻译，病毒组装以及释放传染性的HIV颗粒和HIV蛋白。
本申请表明，本发明所述化合物可阻断HIV表达、因PKC和cAMP信号转导途径活化因子诱导的HIV-1p24的产生。尽管不希望对技术问题作限定性解释，但本申请人确信PKC可经宿主细胞转录因子和病毒反一活化剂蛋白影响病毒的活化。各种细胞因子包括有丝分裂原、抗原和细胞激活素可触发潜伏的前病毒或LLP状态，诱发病毒表达。
病毒表达取决于宿主细胞的活化状态并且由于被PMA潜伏感染细胞激活因而与细胞PKC的活化有关，一种已知的PKC活化剂可以以浓度依赖方式诱导病毒的复制(Gosh等人，Nature(自然)，344:678-682(1990)；Jakobovits，等人，EMBO，9:1165-1170(1990))。PKC抑制剂和长期用佛波酯处理引起的PKC细胞衰减会降低佛波酯、肿瘤坏死α-因子、IL-6或脂多糖诱导的慢性感染的单核细胞内HIV复制(Kinter等人，病毒学杂志(J.Virol.),64:4306-4312(1990))。
现已有报导，PKC对病毒基因组的作用由宿主细胞转录因子例如NF-κ B和病毒反式激活蛋白tat调节来调控(Gosh等人，自然(Nature),344:678-682(1990)；Jakobovits等人，EMBO,9:1165-1170(1990))。现已发现，在慢性感染的MOLT-4HIV细胞系中，TPA可增强HIV-1复制，并且有证据表明，这一作用是由连接在HIV LTR强化因子区上的NF-κB诱导的(Nabel等人，Nature,326:711-713(1987))。在基本的和有丝分裂原刺激的HIV复制的活化中，PKC-β异构体的特异性作用隐含着与PKC-β重构的PKC的细胞衰减可诱导HIV复制的转录活化(Jakobovits等人，EMBO,9:1165-1170(1990))。
在生产性感染的过程中，HIV tat蛋白可使基因表达增强最多至100倍。有证据表明，在HIV-1反式激活作用中，PKC排空细胞具有显著的减缓作用，而对tat蛋白的合成没有任何明显的影响。在这些PKC缺乏细胞中，反式激活作用可以被多种类型的PKC表达载体转染恢复(Jakobovits等人，J.RMBO,9:1165-1170(1990))。
DNA拓扑异构酶Ⅱ磷酸化作用及其活性也与HIV的产生有关。用PKC抑制剂(O-烷基甘油磷脂(O-alkylglucerophospholipid)类似物)抑制所述磷酸化作用，结果会减缓HIV的产生(Matthes等人，Antiviral Res.,13:273-286(1990))。因此，其他PKC活化剂、OAG和苔藓抑制素-1(bryostatin-1)可诱导在慢性感染的U1细胞中的HIV表达(Kinter等人，J.Virol.,64:4306-4312(1990))。
因此，本发明所述PKC抑制剂化合物可通过抑制病毒活化和抑制病毒复制两种方式用于治疗HIV感染。所述PKC抑制剂化合物也可以通过调节PKC和/或cAMP信号转导路径，或者通过与调节PKC和/或cAMP路径的蛋白因子相互作用有效地治疗HIV感染。
本发明所述方法优选地是利用可有效地抑制所述β同功酶的蛋白激酶C抑制剂。一组较适宜的化合物通常是现有技术中所公开的双-吲哚基马来酰亚胺或大环双-吲哚基马来酰亚胺。双-吲哚基马来酰亚胺在现有技术中一般认为包括作为本文参考文献的美国专利5,621,098、5,545,636、5,481,003、5,491,242和5,057,614中所述化合物。大环双-吲哚基马来酰亚胺特别是式Ⅰ所示化合物。这些化合物及其制备方法已公开于作为本文参考文献的美国专利5,552,396中。为了抑制HIV感染的细胞中HIV复制和潜伏的HIV活化，或者为了治疗HIV感染，可给人施用治疗有效量的这些化合物。在有上述疾病危险的情况下，也可以出于预防目的给患者施用这些化合物。
用于本发明所述方法中的优选的一类化合物是下列式(Ⅰ)化合物或其药物上可接受的盐、前药或酯(Ⅰ)
其中W是-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-CO-、C2-C6亚烷基、取代的亚烷基、C2-C6亚烯基、-芳基-、-芳基(CH2)mO-、-杂环-、-杂环-(CH2)mO-、-稠合双环-、-稠合双环-(CH2)mO-、-NR3-、-NOR3-、-CONH-或-NHCO-；X和Y独立地是C1-C4亚烷基、取代的亚烷基、或者X、Y和W一起形成-(CH2)n-AA-；R1是氢或者独立地选自下列基团的至多4个任选的取代基，所述基团是卤素、C1-C4烷基、羟基、C1-C4烷氧基、卤代烷基、硝基、-NR4R5或-NHCO(C1-C4烷基)；R2是氢、CH3CO-、NH2或羟基；R3是氢、-(CH2))m芳基、C1-C4烷基、-COO(C1-C4烷基)、-CONR4R5、-(C=NH)NH2、-SO(C1-C4烷基)、-SO2(NR4R5)或-SO2(C1-C4烷基)；R4和R5独立地是氢、C1-C4烷基、苯基、苄基，或者与它们所连接的氮原子一起形成饱和或不饱和5或6元环；AA是氨基酸残基；m独立地是0、1、2或3；而n独立地是2、3、4或5。
用于本发明中的更优选的一类化合物是式Ⅰ所示化合物，其中所述基团-X-W-Y-含有4-8个原子，其可以被取代或未被取代。最优选的是，所述基团-X-W-Y-含有6个原子。
用于本发明所述方法中的其他优选的化合物是式Ⅰ化合物，其中R1和R2是氢；而W是取代的亚烷基、-O-、S-、-CONH-、-NHCO-或-NR3-。用于本发明中的最优选的化合物是下列式Ⅰa化合物或其药物上可接受的盐、前药或酯
其中Z是-(CH2)p-或-(CH2)p-O-(CH2)p-；R4是羟基、-SH、C1-C4烷基、(CH2))m芳基、-NH(芳基)、-N(CH3)(CF3)、-NH(CF3)或-NR5R6；R5是氢或C1-C4烷基；R6是氢、C1-C4烷基或苄基；p是0、1或2；而m独立地是2或3。最优选的式Ⅰa化合物是其中Z是CH2；而R4是-NH2、-NH(CF3)或-N(CH3)2的化合物或其药物上可接受的盐、前药或酯。
用于本发明所述方法中的其他优选的化合物是式Ⅰ中W是-O-,Y是取代的亚烷基和X是亚烷基的化合物。这些优选的化合物是下列式Ⅰb所示化合物或其药物上可接受的盐、前药或酯
其中Z是-(CH2)p-；R4是-NR5R6、-NH(CF3)或-N(CH3)(CF3)；R5和R6独立地是H或C1-C4烷基；p是0、1或2；和m独立地是2或3。最优选的式Ⅰb化合物是其中p是1并且R5和R6是甲基的化合物。
由于它们含有碱性基团，因此所述式Ⅰ、Ⅰa和Ⅰb化合物还可以以药物上可接受的酸加成盐的形式存在。通常用于形成此类盐的酸包括无机酸例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸和磷酸，以及有机酸例如对甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、对溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、乙酸以及有关的无机和有机酸。此类药物上可接受的盐包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、2-丁炔-1,4-二酸盐、3-己炔-2,5-二酸盐、苯甲酸盐、氯代苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、二甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、马尿酸盐、β-羟基丁酸盐、甘醇酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、扁桃酸盐等。特别是选用盐酸盐和甲磺酸盐。
除了药物上可接受的盐以外，还可以是其他盐。它们可以在所述化合物的纯化中、在其他盐的制备中，或者在所述化合物或中间体的鉴定和定性中用作中间体。
所述式Ⅰ、Ⅰa和Ⅰb化合物的药物上可接受的盐还可以以各种溶剂化物存在，例如与水、甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺、乙酸乙酯等形成的溶剂化物。也可以制得此类溶剂化物的混合物。此溶剂化物可来源于结晶溶剂，制备或结晶过程中的固有溶剂，或者与此类溶剂偶然形成。
可以理解的是，所述式Ⅰ、Ⅰa和Ⅰb化合物可以以各种立体异构体存在；例如，W可以在所述取代的亚烷基基团中含有手性碳原子。所述化合物通常以外消旋体形式制得并且通常可以以这种形式使用。另外，如果需要，也可以通过常规方法分离或者合成得到两种单一对映体。此外消旋体和单一对映体及其混合物构成了用于本发明所述方法中的所述化合物的一部分。
用于本发明的所述化合物还包括所述式Ⅰ、Ⅰa和Ⅰb化合物的药物上可接受的前药。前药是已经被化学修饰的并且在其作用部位可以不具有生物活性的药物，但其可以被体内一种或多种酶催化或其他方法降解或修饰成具有生物活性的母体。此前药可能与所述母体具有不同的药物动力学性质，经粘膜上皮更易吸收、形成盐更有利或者具有较好的溶解性，和/或改善系统稳定性(例如提高在血浆中的半衰期)。
典型地是，这样的化学修饰包括1)可被酯酶或脂肪酶裂解的酯或酰胺衍生物；2)可被特异性或非特异性蛋白酶识别的肽；或3)经膜选择前药或被修饰的前药可在作用部位聚积的衍生物；或者上文所述1-3任何组合形式。例如H.Bundgaard,前药的设计(Design ofProdrugs),(1985)公开了选择和制备适宜前药衍生物的常规方法。
Davis等人的美国专利5,057,614公开了各种双-吲哚-N-马来酰亚胺衍生物的合成方法，并且在上述同一人的美国专利5,552,396和Faul等人的欧洲专利申请0 657 411 A1中公开了适用于本发明的所述优选化合物的合成方法，所有这些文献在此均作为本文参考文献。
用于本发明所述方法中的一种特别优选的蛋白激酶-β抑制剂是上述美国专利5,552,396中实施例5g所述化合物((S)-3,4-[N,N′-1,1′-((2″-乙氧基)-3(O)-4-(N,N-二甲氨基)-丁烷)-双-(3,3′-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2,5-二酮盐酸盐)。此化合物是有效的蛋白激酶C抑制剂。它对蛋白激酶C的选择性高于其他激酶并且具有较高的同功酶选择性，即它对β-1和β-2同功酶具有选择性。此化合物的其他盐也是较优选的，特别是甲磺酸盐。
优选的甲磺酸盐可由下述方法制备，即在非反应性有机溶剂，优选有机溶剂/水混合物，并且特别优选水-丙酮中，将下列式Ⅱ化合物与甲磺酸反应。
也可使用其他溶剂例如甲醇、丙酮、乙酸乙酯以及它们的混合物。对于溶剂与水的比例并没有严格限定并且通常由所述试剂的溶解性来确定。优选的溶剂与水的比例关系通常为溶剂比水0.1∶1至100∶1(体积比)，优选的是，所述比例是1∶1至20∶1，并且最优选的是5∶1至10∶1。最佳比例取决于所选用的溶剂并且优选是丙酮溶剂与水的比为9∶1。
尽管也可以以其他比例进行反应，特别是在甲磺酸过量的情况下进行，但所述反应通常在约等摩尔量的所述两种试剂存在下进行。对于向反应中加入甲磺酸的速度并没有严格限定，可以以较快的速度(＜5分钟)或者在6小时或更长时间内以较慢的速度加入。所述反应可在0℃至回流温度下进行。将反应混合物搅拌直至经x-射线衍射测定完全形成盐，并且可以持续5分钟至12小时。
本发明所述盐优选并且较容易地是以结晶的形式制得。干燥或暴露于相对湿度20-60％下后，所述盐的三水合物可容易地转变成一水合物。所述盐基本上是具有确定的熔点、双折射和x-射线衍射图谱的结晶。通常，所述结晶含有低于10％的非晶形固体，优选低于5％并且最优选低于1％的非晶形固体。
所述甲磺酸盐可通过过滤或本领域适宜的其他分离方法由反应混合物中直接分离得到，产率在50％-100％范围内。如果需要，可以用重结晶以及本领域公知的其他纯化方法对所述盐进行进一步纯化。
本领域技术人员可以理解的是，本发明所述蛋白激酶C抑制剂的治疗有效量是指足以抑制HIV复制和/或活化或者抑制HIV作用的量。对于本领域技术人员来讲，利用公知的指标例如T细胞数、病毒数、病毒特异性蛋白及其活性等可测定HIV的活化和复制。用药量可以各不相同，除了其他因素以外，取决于治疗制剂中所述化合物的浓度以及患者的体重。通常，作为用于治疗HIV感染的治疗制剂，施用蛋白激酶C抑制剂的量将由处置的医生根据各个病例确定。作为一种指导，当确定适宜的剂量时，应当考虑感染的程度、免疫系统强度、患者的体重和年龄。
通常，适宜的剂量是在所述治疗部位所述蛋白激酶C抑制剂浓度达到0.5nM-200μM，一般0.5nM-20μM并且最好0.5nM-200nM范围的剂量。可以理解的是，在绝大多数情况下，血清浓度达到0.5nM-20nM应当是足够了。
为了获得所述治疗浓度，可给需要治疗的患者每日每公斤体重施用约0.001mg至50.0mg。通常，每天每公斤体重应当需要不超过约10.0mg蛋白激酶C抑制剂。如上所述，上述剂量可根据不同病例而改变。
本发明所述化合物的效果可在体外和体内系统中进行试验。对于体外试验，如作为本文参考文献的Kinter等人在病毒学杂志(J.Virology)64:4306-4312,1990和Sardoroski等人在科学(Science)227:171-173,1985中所述，可用慢性HIV感染的单核细胞和T淋巴细胞进行。由体外试验系统所得结果表明，在基础状态所述化合物可有效降低HIV的复制，并且所述化合物可有效降低由佛波酯、肿瘤坏死α-因子、IL-6和脂多糖激活的HIV复制。对于体内试验，可利用很人道的HIV感染的严重联合免疫缺陷病(SCID)小鼠模型(Moiser等人，当代免疫学(Immunology Today)15:332-339,1994)。在此模型中，将SCID小鼠用HIV感染的人单核细胞或CD4+T淋巴细胞接种。作为基本的终点，通过评估CD4+T细胞的衰减情况对疾病的发展过程进行监测。在用HIV感染的单核细胞或CD4+T细胞感染的模型中，本发明所述化合物能够减缓所述细胞衰减，这表明对于HIV感染的人来讲无论对于延长潜伏期还是延缓AIDS的临床发展都能产生正反应。
所述式Ⅰ化合物以及优选的式Ⅰa和Ⅰb化合物优选在施用前配制成制剂。适宜的药物制剂可利用公知的和容易获得的组份经公知方法制备。在制备适用于本发明方法中的组合物时，所述活性成份通常与载体混合，或者用载体稀释，或者包覆在可以是胶囊、药包、纸或其他容器的载体中。当所述载体用作稀释剂时，其可以是可用作所述活性成份载体、赋形剂或介质的固体、半固体或液体材料。因此，所述组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、锭剂、药包、扁囊剂、酏剂、悬浮剂、乳剂、溶液、糖浆、气雾剂(固体形式或者在液体介质中)、软和硬明胶胶囊剂、栓剂、无菌注射液以及可口服或者局部施用的无菌包装的粉剂。
适宜的载体、赋形剂和稀释剂的某些实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸酯、西黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、甲基和丙基羟基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。所述制剂还可含有润滑剂、润湿剂、乳化剂和悬浮剂、防腐剂、甜味剂和调味剂。本发明组合物可配制成给患者施用后能快效、长效或缓释所述活性成份的制剂。所述组合物优选配制成单位剂型，每一剂型含有约0.05mg至约3g，通常约750mg的所述活性成份。但是，可以理解的是，所施用的治疗剂量将由医生根据相关因素包括所治疗疾病的严重程度、所选择的施用化合物以及所选用的用药方式而定。因此，上述剂量范围对本发明范围不起任何限定作用。术语“单位剂型”是指与人和其他哺乳动物单位剂量相适宜的物理上分立的单元，每一单位含有根据产生所需治疗效果计算的预测定量的活性成份以及有关的适宜药物载体。
除了上述大部分可以口服的制剂以外，应用于本发明所述方法中的所述化合物还可以局部施用。局部施用的制剂包括软膏剂、乳膏和凝胶。
软膏剂通常可用下述任何一种基质制备(1)油脂性基质，即不挥发性油或烃构成的基质，如白色凡士林或矿物油，或者(2)吸收性基质，即由可吸水的一种或多种无水物质构成的基质，如无水羊毛脂。无论是油脂性基质还是吸收性基质，通常在配制所述基质后，以获得所需浓度的量加入所述活性成份(化合物)。
乳膏是指油/水乳剂，它们由油相(内相)和水相(连续相)构成，所述油相典型地是含有不挥发性油、烃等，例如蜡、凡士林、矿物油等，而水相含有水和任何水溶性物质，例如加成盐。利用乳化剂可使两相稳定，所述乳化剂例如是表面活性剂，如十二烷基硫酸钠；亲水胶体，如阿拉伯胶体粘土、V字胶等。通常，在形成乳剂后，以获得所需浓度的量加入所述活性成份(化合物)。
凝胶含有选自油脂性基质、水或乳液-悬浮剂基质的基质。向所述基质中加入凝胶剂，可在所述基质中形成基体，提高了其粘性。凝胶剂的实例有羟丙基纤维素、丙烯酸聚合物等。通常，在加入所述凝胶剂之前，以所需浓度向所述制剂中加入所述活性成份(化合物)。
对于向所述局部施用的制剂中所混入的化合物的量并没有严格限制；所述浓度应当在足以使所述制剂以一定量容易地施用到染病组织区域的范围在内，所述一定量指可使所需量化合物施用到所需治疗部位的量。
施用到染病组织上的局部施用制剂的常用量取决于所述制剂中化合物的浓度。通常，所述制剂以每平方厘米染病组织约1-500μg化合物的量施用到所述染病组织上。优选的是，所述化合物的施用量范围在约30-300μg/cm2，更优选约50-200μg/cm2，并且最优选约60-100μg/cm2。
下列制剂实施例仅用于说明目的，而对本发明范围不起任何限定作用。
制剂1用下列组份制备硬明胶胶囊量(mg/胶囊)活性剂 5干淀粉 200硬脂酸镁10总计215mg将上述组份混合并以460mg的量装填到硬明胶胶囊中。
制剂2用下列组份制备片剂量(mg/片)活性剂 15
微晶纤维素 10发烟二氧化硅 10硬脂酸 5总计 40mg将上述组份混合并以每片重665mg压制成片剂。
制剂3如下所述制得每片含60mg活性成份的片剂量(mg/片)活性剂 60mg淀粉 45mg微晶纤维素 35mg聚乙烯吡咯烷酮(10％水溶液) 4mg羧甲基淀粉钠 4.5mg硬脂酸镁 0.5mg滑石 1mg总计 150mg将所述活性成份、淀粉和纤维素经U.S.45目筛并充分混合。将所述聚乙烯吡咯烷酮溶液与所得粉末混合，然后再经过U.S.14目筛。将所制备的颗粒于50℃下干燥并经U.S.18目筛。向所述颗粒中加入预先经过U.S.60目筛的羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁和滑石，混合后，将其在压片机中模压，制成每片重150mg的片剂。实施例所有这些实施例均说明用(S)-3,4-[N,N′-1,1′-((2″-乙氧基)-3(O)-4-(N,N-二甲氨基)-丁烷)-双-(3,3′-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2,5-二酮抑制HIV在U1细胞中的表达。实施例1在此实施例中，对所述化合物对PKC活化剂激活的HIV表达的抑制作用进行考察。将U1细胞用PMA或者与所述化合物混合的PMA处理，通过HIV-1p24的产生量测定HIV表达。如表1所示结果表明，所述化合物对PKC活化剂诱导的HIV表达具有抑制作用。
表1处理物 HIV-1p24产生量(pg/ml)RMA(10μg/ml) 3974RMA(10μg/ml)+PKC抑制剂(1nM) 1899RMA(10μg/ml)+PKC抑制剂(10nM) 36RMA(10μg/ml)+PKC抑制剂(100nM) 1.8RMA(10μg/ml)+PKC抑制剂(500nM) 9.1实施例2在此实施例中，对所述化合物对霍乱毒素激活的HIV表达的抑制作用进行考察。已知霍乱毒素可引起细胞中cAMP水平升高。将U1细胞用霍乱毒素或者与所述化合物混合的霍乱毒素处理，通过HIV-1p24的产生量测定HIV表达。如表2所示结果表明，所述化合物对霍乱毒素诱导的HIV表达具有抑制作用。
表2处理物HIV-1p24产生量(pg/ml)霍乱毒素(CT)(10ng/ml) 55CT(10μg/ml)+PKC抑制剂(1nM) 21CT(10μg/ml)+PKC抑制剂(10nM) 10CT(10μg/ml)+PKC抑制剂(100nM) 6CT(10μg/ml)+PKC抑制剂(500nM) 22实施例3此实施例阐明了所述化合物对TNF诱导的HIV表达的作用。将U1细胞用TNF或者与所述化合物混合的TNF处理，通过HIV-1p24的产生量测定HIV表达。如表3所示结果表明，TNF可以通过与PKC不相关的方式激活HIV的表达。处理物 HIV-1p24产生量(pg/ml)TNF(10U/ml)176TNF(10U/ml)+PKC抑制剂(1nM) 269TNF(10U/ml)+PKC抑制剂(10nM)176TNF(10U/ml)+PKC抑制剂(100nM) 185TNF(10U/ml)+PKC抑制剂(500nM) 167上文已阐明了本发明的原理、优选实施方案以及实施方法，在此试图保护本发明，而不是将本发明限定到所公开的具体形式，因为它们只起说明作用，而非限定作用。在不脱离本发明精神的情况下，本领域技术人员可以作出各种变化和改变。
权利要求
1．一种抑制感染细胞中人免疫缺陷病毒活化的方法，该方法包括将所述细胞与病毒激活抑制量的蛋白激酶C的β同功酶抑制剂相接触。
2．权利要求1所述方法，其中所述蛋白激酶C的β同功酶抑制剂是双-吲哚基马来酰亚胺或大环双-吲哚基马来酰亚胺。
3．权利要求1所述方法，其中所述抑制剂具有同功酶选择性并且其中所述同功酶选择性是选自β-1和β-2同功酶。
4．权利要求3所述方法，其中所述蛋白激酶C抑制剂是下式化合物或其药物上可接受的盐、前药或酯
其中W是-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-CO-、C2-C6亚烷基、取代的亚烷基、C2-C6亚烯基、-芳基-、-芳基(CH2)mO-、-杂环-、-杂环-(CH2)mO-、-稠合双环-、-稠合双环-(CH2)mO-、-NR3-、-NOR3-、-CONH-或-NHCO-；X和Y独立地是C1-C4亚烷基、取代的亚烷基、或者X、Y和W一起形成-(CH2)n-AA-；R1是氢或者独立地选自下列基团的至多4个任选的取代基，所述基团是卤素、C1-C4烷基、羟基、C1-C4烷氧基、卤代烷基、硝基、NR4R5或-NHCO(C1-C4烷基)；R2是氢、CH3CO-、NH2或羟基；R3是氢、(CH2)m芳基、C1-C4烷基、-COO(C1-C4烷基)、-CONR4R5、-(C=NH)NH2、-SO(C1-C4烷基)、-SO2(NR4R5)或-SO2(C1-C4烷基)；R4和R5独立地是氢、C1-C4烷基、苯基、苄基，或者与它们所连接的氮原子一起形成饱和或不饱和5或6元环；AA是氨基酸残基；m独立地是0、1、2或3；而n独立地是2、3、4或5。
5．权利要求4所述方法，其中所述蛋白激酶C抑制剂是下式化合物或其药物上可接受的盐、前药或酯
其中Z是-(CH2)p-或-(CH2)p-O-(CH2)p-；R4是羟基、-SH、C1-C4烷基、(CH2)m芳基、-NH(芳基)、-N(CH3)(CF3)、-NH(CF3)或-NR5R6；R5是氢或C1-C4烷基；R6是氢、C1-C4烷基或苄基；p是0、1或2；而m独立地是2或3。
6．权利要求4所述方法，其中所述蛋白激酶C抑制剂是下式化合物或其药物上可接受的盐、前药或酯
其中Z是-(CH2)p-；R4是-NR5R6、-NH(CF3)或-N(CH3)(CF3)；R5和R6独立地是H或C1-C4烷基；p是0、1或2；而m独立地是2或3。
7．权利要求4所述方法，其中所述蛋白激酶C抑制剂包括(S)-3,4-[N,N′-1,1′-((2″-乙氧基)-3(O)-4-(N,N-二甲氨基)-丁烷)-双-(3,3′-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2,5-二酮或其药物上可接受酸的盐。
8．权利要求7所述方法，其中所述药物上可接受的酸盐选自盐酸盐和甲磺酸盐。
9．一种抑制感染细胞中人免疫缺陷病毒复制的方法，该方法包括将所述细胞与病毒复制抑制量的蛋白激酶Cβ同功酶抑制剂相接触。
10．权利要求9所述方法，其中所述蛋白激酶Cβ同功酶抑制剂是双-吲哚基马来酰亚胺或大环双-吲哚基马来酰亚胺。
11．权利要求9所述方法，其中所述抑制剂具有同功酶选择性并且其中所述同功酶选择性是选自β-1和β-2同功酶。
12．权利要求11所述方法，其中所述蛋白激酶C抑制剂是下式化合物或其药物上可接受的盐、前药或酯
其中W是-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-CO-、C2-C6亚烷基、取代的亚烷基、C2-C6亚烯基、-芳基-、-芳基(CH2)mO-、-杂环-、-杂环-(CH2)mO-、-稠合双环-、-稠合双环-(CH2)mO-、-NR3-、-NOR3-、-CONH-或-NHCO-；X和Y独立地是C1-C4亚烷基、取代的亚烷基、或者X、Y和W一起形成-(CH2)n-AA-；R1是氢或者独立地选自下列基团的至多4个任选的取代基，所述基团是卤素、C1-C4烷基、羟基、C1-C4烷氧基、卤代烷基、硝基、NR4R5或-NHCO(C1-C4烷基)；R2是氢、CH3CO-、NH2或羟基；R3是氢、(CH2)m芳基、C1-C4烷基、-COO(C1-C4烷基)、-CONR4R5、-(C=NH)NH2、-SO(C1-C4烷基)、-SO2(NR4R5)或-SO2(C1-C4烷基)；R4和R5独立地是氢、C1-C4烷基、苯基、苄基，或者与它们所连接的氮原子一起形成饱和或不饱和5或6元环；AA是氨基酸残基；m独立地是0、1、2或3；而n独立地是2、3、4或5。
13．权利要求12所述方法，其中所述蛋白激酶C抑制剂是下式化合物或其药物上可接受的盐、前药或酯
其中Z是-(CH2)p-或-(CH2)p-O-(CH2)p-；R4是羟基、-SH、C1-C4烷基、(CH2)m芳基、-NH(芳基)、-N(CH3)(CF3)、-NH(CF3)或-NR5R6；R5是氢或C1-C4烷基；R6是氢、C1-C4烷基或苄基；p是0、1或2；而m独立地是2或3。
14．权利要求12所述方法，其中所述蛋白激酶C抑制剂是下式化合物或其药物上可接受的盐、前药或酯
其中Z是-(CH2)p-；R4是-NR5R6、-NH(CF3)或-N(CH3)(CF3)；R5和R6独立地是H或C1-C4烷基；p是0、1或2；而m独立地是2或3。
15．权利要求12所述方法，其中所述蛋白激酶C抑制剂包括(S)-3,4-[N,N′-1,1′-((2″-乙氧基)-3(O)-4-(N,N-二甲氨基)-丁烷)-双-(3,3′-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2,5-二酮或其药物上可接受酸的盐。
16．权利要求15所述方法，其中所述药物上可接受酸的盐选自盐酸盐和甲磺酸盐。
17．一种治疗人免疫缺陷病毒感染的哺乳动物的方法，该方法包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的蛋白激酶C的β同功酶抑制剂。
18．权利要求17所述方法，其中所述蛋白激酶C的β同功酶抑制剂是双-吲哚基马来酰亚胺或大环双-吲哚基马来酰亚胺。
19．权利要求17所述方法，其中所述抑制剂具有同功酶选择性并且其中所述同功酶选择性是选自β-1和β-2同功酶。
20．权利要求19所述方法，其中所述蛋白激酶C抑制剂是下式化合物或其药物上可接受的盐、前药或酯
其中W是-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-CO-、C2-C6亚烷基、取代的亚烷基、C2-C6亚烯基、-芳基-、-芳基(CH2)mO-、-杂环-、-杂环-(CH2)mO-、-稠合双环-、-稠合双环-(CH2)mO-、-NR3-、-NOR3-、-CONH-或-NHCO-；X和Y独立地是C1-C4亚烷基、取代的亚烷基、或者X、Y和W一起形成-(CH2)n-AA-；R1是氢或者独立地选自下列基团的至多4个任选的取代基，所述基团是卤素、C1-C4烷基、羟基、C1-C4烷氧基、卤代烷基、硝基、NR4R5或-NHCO(C1-C4烷基)；R2是氢、CH3CO-、NH2或羟基；R5是氢、(CH2)m芳基、C1-C4烷基、-COO(C1-C4烷基)、-CONR4R5、-(C=NH)NH2、-SO(C1-C4烷基)、-SO2(NR4R5)或-SO2(C1-C4烷基)；R4和R5独立地是氢、C1-C4烷基、苯基、苄基，或者与它们所连接的氮原子一起形成饱和或不饱和5或6元环；AA是氨基酸残基；m独立地是0、1、2或3；而n独立地是2、3、4或5。
21．权利要求20所述方法，其中所述蛋白激酶C抑制剂是下式化合物或其药物上可接受的盐、前药或酯
其中Z是-(CH2)p-或-(CH2)p-O-(CH2)p-；R4是羟基、-SH、C1-C4烷基、(CH2)m芳基、-NH(芳基)、-N(CH3)(CF3)、-NH(CF3)或-NR5R6；R5是氢或C1-C4烷基；R6是氢、C1-C4烷基或苄基；p是0、1或2；而m独立地是2或3。
22．权利要求20所述方法，其中所述蛋白激酶C抑制剂是下式化合物或其药物上可接受的盐、前药或酯
其中Z是-(CH2)p-；R4是-NR5R6、-NH(CF3)或-N(CH3)(CF3)；R5和R6独立地是H或C1-C4烷基；p是0、1或2；而m独立地是2或3。
23．权利要求20所述方法，其中所述蛋白激酶C抑制剂包括(S)-3,4-[N,N′-1,1′-((2″-乙氧基)-3(O)-4-(N,N-二甲氨基)-丁烷)-双-(3,3′-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2,5-二酮或其药物上可接受酸的盐。
24．权利要求23所述方法，其中所述药物上可接受酸的盐选自盐酸盐和甲磺酸盐。
全文摘要
本发明公开了一种特别是应用同功酶选择性PKC抑制剂,(S)－3,4－[N,N′－1,1′－((2″－乙氧基)－3″′(O)－4″′－(N,N－二甲氨基)－丁烷)－双－(3,3′－吲哚基)]－1(H)－吡咯－2,5－二酮或其酸盐治疗HIV感染的方法。
文档编号A61P43/00GK1228696SQ97197537
公开日1999年9月15日 申请日期1997年8月28日 优先权日1996年8月30日
发明者M·R·金洛瑟克, D·K·韦斯, L·E·斯特拉姆 申请人:伊莱利利公司