专利名称：治疗癌症的混合反义药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术治疗药物，特别是涉及一种治疗癌症的混合反义药物。
反义核苷(Antisense)是90年代诞生的一种新型生物技术治疗药物，该药物特异地、选择性地攻击引起疾病的基因其特定的碱基序列，从而阻断其活性和某种蛋白质的合成，最终达到治疗效果。反义核苷作为生物技术治疗药物已被公认。许多研究表明，在众多肿瘤病变发展过程中涉及到许多基因的协同作用，包括bcr-abl,p53,c-myc,c-myb等，其它白血病类型的模型也证明bcr-abl与c-myb基因间的协同作用造成细胞肿瘤化，所以单一反义核苷的抑制作用不足以抑制整个肿瘤细胞的繁殖作用性。
本发明的目的在于提供一种尤其对白血病细胞有更强抑制作用且抑制效果持续更久，可作为白血病细胞繁殖的抑制剂的治疗癌症的混合反义药物。
本发明治疗癌症的混合反义药物是由三种反义核苷等重量混合而成，三种反义核苷的DNA序列分别是c-myc反义核苷5’CAC CGA GGG GTC GAT GCACT3；c-myb反义核苷5’AGG TAG CAT CTT CAG GGGAC3；bcr-abl反义核苷5’CTG AAG GGC TTC TTC CTTAT3。
本发明治疗癌症的混合反义药物中的三种反义核苷合成是采用修饰过的固相磷酸硫代合成方法(Phosphorothioate)，利用先进的核酸合成仪自动合成，其基本原理是，根据氰乙基磷酸胺化学合成程序，即把起始核苷的3’端通过连接链接到固相载体上，从此末端开始逐步接长寡核苷酸链，每接长一个核苷，则为一个反应循环。接长的寡核苷酸链一直固定在固相载体(DMP CPG)上。过量的反应物及副产物，通过乙腈洗涤除去。当寡核苷酸合成到所需长度后，它将被从固相载体上切除下来，然后再脱出保护基，分离纯化，最终得到所需产物。每个所接的核苷都需经过保护、脱保护、缩合、戴帽、氧化的循环过程。本发明为20碱基，需要经过20个循环才能完成。其合成反应通过磷酸酯和羟基的缩合而形成3’,5’-磷酸二酯链。对于反义核苷的合成，采用硫代替磷以保护其结构在生物体内不被核酸酶所降解。合成的反义核苷经反相高压液相层析(RHPLC)纯化，其纯化度可达98％以上，最终产品冷冻干燥后贮存于4～-20℃暗处。
本发明治疗癌症的混合反义药物是一种治疗效果特异的新型分子药物，与传统药物的特性相比，其优点在于利用多个反义核苷来抑制相互联系的多个肿瘤基因活性，使其每个反义核苷的部分抑制效果得到累加，其结果达到高效的协同抑制作用，而且其抑制活性大大延长，对正常细胞无明显毒性，适用于进一步的人体实验，作为治疗人体各种肿瘤疾病，尤其对白血病是一种新的途径和方法。
下面结合附图详细说明本发明实施例制备及性质。
图1核酸杂交法电泳2对人体血液细胞生长的抑制作用MTT法鉴定3对人体K562肿瘤细胞植入SCID小鼠后小鼠存活率分析图实施例1本发明治疗癌症的混合反义药物由三种反义核苷等重量混合而成，三种反义核苷的DNA序列分别是c-myc反义核苷5’CAC CGA GGG GTC GAT GCACT3；c-myb反义核苷5’AGG TAG CAT CTT CAG GGGAC3；bcr-abl反义核苷5’CTG AAG GGC TTC TTC CTTAT3。
本发明治疗癌症的混合反义药物合成工艺流程如下(一)本发明治疗癌症的混合反义药物中各反义核苷的合成。
1、本发明由美国Applied Biosystems公司出品的ABI392全自动DNA合成仪自动合成，合成条件严格按照该机的操作手册进行，所得粗产品，收集在4毫升的玻璃瓶内。
2、合成粗产品用真空离心方法(42℃)使氢氧化铵挥发，并用酒精萃取两次，乾燥后溶于10mM Tris-HCl·0.4mM EDTA(PH7.6)的缓冲液中。
3、使用FPLC离子交换层析柱，型号MonoQHR5/5PH12.5(从Phamacia购买)进行提纯，去离子和盐。提纯前、后的分析监定如图1、图2所示。
4、提纯后的产品在冷冻干燥器内降温和去水，冷冻干燥，得反义核苷白色粉末，于0～20℃储存。
其中合成原料β氰乙基DNA磷酰胺(美国Applied Biosystems)腺苷(美国Synthegen)鸟苷(美国Synthegen)胸腺嘧啶苷(美国Synthegen)胞嘧啶苷(美国Synthegen)乙睛(美国Applied Biosystems)腺苷磷酰胺(美国Applied Biosystems)四氮唑(美国Applied Biosyslems)氢氧化铵(美国Applied Biosystems)盖髓物试剂醋酸酐/二甲基吡啶/四氢呒喃氧化反应试剂四乙基硫代硫化物/水/吡啶/四氢呒喃脱三苯甲基作用试剂三氯醋酸/二氯甲烷1号瓶(装有腺苷磷酰胺)乙睛流量1.7毫升/分，用于控制和校准磷酰胺和四唑的流速。
18号瓶(装有乙睛)乙睛流量1.8毫升/分，用于控制和校准盖髓物试剂，四乙基硫代硫化物，三氯醋酸和乙睛流量。
合成柱孔径1000唉玻璃柱，0.2微摩尔流量控制孔。
柱上合成步骤如下1、脱保护核苷酸是一个多功能团的化合物，在合成中除了反应所需的基团需要发生反应外，其它基团都需要保护，否则会产生副产物。在固相合成第一步时，要脱去5’末端的DMT保护基，使5’末端的羟基暴露，以便进行下一步核苷的缩合反应。
2、缩合反应当核苷脱保护后，5’末端的羟基与核苷的3’末端上的亚磷酰胺基团反应，脱去二异丙基胺。反应在供给体四氮唑的催化下，活化了磷酸酯键，使反就速度大大加快。
3、戴帽在固相合成寡核苷酸时，载体上少部分5’末端核苷末起反应，使用乙酰氯试剂封闭，以减少核苷合成的错误。
4、氧化反应为稳定3价磷的不稳定状态，氧化3价磷成为5价磷，使合成的磷酸二酯键不易因PH值的变化而断裂。
氧化反应后，固相合成完成了接长一个核苷的循环，需进一步加长所需合成的反义核苷，进行上述四个步骤的循环，直到合成所需的长度。然后把寡核苷酸从载体上切割下来，得反义核苷粗产品。
(二)本发明治疗癌症的混合反义药物的制备。分别取c-myc反义核苷、c-myb反义核苷和bcr-abl反义核苷各5毫克，混合均匀得本发明治疗癌症的混合反义药物。
本发明治疗癌症的混合反义药物的实验结果分析(一)反义核苷对基因表达的抑制作用。选用人体慢性骨髓白血病细胞株(K562)作为受体，细胞生长在10％胎牛血清的RPMI-1640培养条件下，利用核酸杂交法(Northernblol)来鉴定c-myc反义核苷，c-myb反义核苷和bcr-abl反义核苷分别对受体细胞K562其基因c-myc,c-myb和bcr-abl的表达抑制，采用阳离子的脂质体(Lipofectin)作为反义核苷处理细胞的载体，脂质体(20μg/ml,Gibco公司)与10μM反义核苷以相同体积混合，二者均采用无血清培养基作为稀释液，反义核苷与脂质体的混合液在常温下放置10分钟后，加入培养的细胞中，细胞需经PBS清洗二次，然后加入反义核苷脂质体混合液，最终的反义核苷的浓度为250nM。对照采用培养基，正义核苷以及单独的运载体(脂质体)，2×166细胞经反义核苷分别处理后提取总的RNA(采用Trizol一步法，Gibco公司)。每个样品取20μg走电泳，然后经转移和32P探针杂交后鉴定其抑制效应，结果如图1所示。表明三种反义核苷处理K562细胞均可达到抑制其本身攻击的目标基因mRNA表达的活性，而对照和正义核苷均无明显影响。
(二)利用细胞集落形成(colonyForming)方法鉴定本发明治疗癌症的混合反义药物对白血病细胞集落形成的协同效用。正常的白血病细胞分别收集后培养在24孔细胞培养板中，每孔细胞数为105(350μl培养基)，培养基为10％的胎牛血清的RPM11640，细胞经培养后，每孔分别加入50μg/ml上述三种反义核苷、本发明和本发明正义(即与上述三种反义核苷对应的正义核苷的等量混合物)，每天加一次，直到7天，然后把细胞培养液在半固体的甲基纤维素培养基上(HCC4230,TerryFox Lab提供)，大约10天左右再鉴定细胞集落数，结果如表1、表2所示。表明各反义核苷对肿瘤细胞的集落形成具有显著的抑制作用，而采用本发明其作用更为明显，且显示出具有显著的抑制作用，对正常骨髓细胞增长无明显抑制效用。
(三)利用MTT方法测定本发明治疗癌症的混合反义药物对人体白血病细胞生长的抑制作用。简单程序为，1×104细胞生长在96孔细胞培养板中，培养液0.2ml，细胞培养过然后再分别用上进三种反义核苷和本发明处理，每隔48小时收获一次，用MTT方法处理(MTT,MetylthiazoleTetrazolium,Sigma公司)，每孔加40μlMTT(5mg/ml)37℃培养2小时，然后用用50％N,N-dimethyl formaide和20％SDS(Sodiumdodecy sulfate,PH4.7)混合液37℃处理，读取570nM的吸收光谱数。对照为100％,MTT鉴定结果如图2所示。表明每个反义核苷均具有很强的抑制活性，但6天后抑制活性逐渐消失，肿瘤细胞生长恢复。采用本发明其抑制活性超过每个单一反义核苷的效率，而且其抑制活性能继续维持至8天以上，说明本发明对肿瘤细胞生长的抑制活性具有单一反义核苷的累加效应，且其抑制活性比单一反义核苷持久。
(四)本发明对白血病癌细胞移植后的SCID小鼠存活率的影响。雄性SCID小鼠(7～8周左右)注射106K562细胞(细胞悬浮于0.2mlRPMI-1640无血清培养基中)，小鼠每两天注射一次上述三种反义核苷、本发明和本发明正义，剂量为5mg/公斤，然后观察小鼠的死亡率，结果如图3所示。表明对照和正义核苷注射对小鼠的存活率无明显增强，注射单一反义核苷，小鼠存活率明显增加，增加的幅度达2～3倍左右，而用本发明处理，其小鼠存活率比对照大大增加，增加幅度达5倍以上，而且明显高于单一反义核苷的处理，增加幅度也达2倍以上，因此，采用本发明处理可增加治疗效果。
表1本发明混合反义药物对白血病未成熟危象细胞(CML-BC)集落生长的协同效应
表2本发明混合反义药物对正常骨髓细胞(BM(C)集落生长的作用
权利要求
1.一种治疗癌症的混合反义药物，其特征在于它是由三种反义核苷等重量混合而成，三种反义核苷的DNA序列分别是c-myc反义核苷5’CAC CGA GGG GTC GAT GCACT3；c-myb反义核苷5’AGG TAG CAT CTT CAG GGGAC3；bcr-abl反义核苷5’CTG AAG GGC TTC TTC CTTAT3。
全文摘要
本发明提供一种治疗癌症的混合反义药物,它由三种反义核苷等重量混合而成,三种反义核苷的DNA序列分别是:5’CAC CGA GGG GTC GAT GCA CT3;5’AGG TAG CAT CTT CAG GGG AC3;5’CTG AAG GGC TTC TTC CTT AT3。它是利用三个反义核苷来攻击三个有机互作用的多个肿瘤基因c－myc、c－myc和bcr－abl,抑制作用强,抑制效果持久,可作为白血病细胞的生长和增殖的抑制剂。
文档编号A61K31/715GK1230410SQ98111920
公开日1999年10月6日 申请日期1998年3月30日 优先权日1998年3月30日
发明者李伯刚 申请人:中科院成都地奥制药公司