用于治疗丙型肝炎的含有黄柏皮和败酱的混合萃取物的药物组合物的制作方法

专利名称：用于治疗丙型肝炎的含有黄柏皮和败酱的混合萃取物的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗丙型肝炎的药物组合物，该组合物含有黄柏皮(Phellodendron amurense RUPRECHT)和败酱(Patrinia scabiosaefoliaFISCH)的混合萃取物作为活性成分。更具体地说，本发明涉及一种药物组合物，该组合物含有黄柏皮和败酱于水或醇萃取中的混合萃取物作为活性成分，由于它具有抗丙型肝炎病毒的活性，与此同时，由于其具有恢复损坏的T-辅助细胞因而增强宿主的免疫系统的能力，因此可有效地治疗丙型肝炎(hepatitis C)和丙型肝炎引起的肝硬化。
背景技术：
慢性丙型肝炎是一种以由于丙型肝炎病毒(HCV)感染而使门静脉区域周围的肝部中心持续引发炎症为特征的疾病，并且很容易引起肝硬化或早期的肝细胞癌。与甲型或乙型肝炎相反的是，即使是在感染初期，大约90％的丙型肝炎的GPT水平(谷丙转氨酶)不正常，并会发展成为慢性病。最近，有报告说丙型肝炎病毒可能直接参与了肝细胞癌的形成[参见Sakamuro,Furukawa和Takegami,J.Virol.,69:3893-3896,1995:Ray,Logging,Meyer和Ray,J.Virol.,70:4438-4443,1996]。此外，还有报告说在西方国家有30％的肝细胞癌病人检测出丙型肝炎病毒[参见Mangia,Vallari和Bisceglie,J.Med.Virol.,43:125-128,1994]。
随着Chiron Inc.(U.S.A.)于1988年开发出HCV抗体(C100-3抗体)检测系统，已经知道大部分非甲、非乙型肝炎是由丙型肝炎病毒引起的。在日本，用抗体检测系统进行的筛选试验说明70％患有非甲、非乙型肝炎的病人，和90％或更多的肝癌病人检出了丙型肝炎病毒。
1989年，由患有非甲、非乙型肝炎的黑猩猩的血浆之中通过分离部分病毒基因首次鉴定出丙型肝炎病毒发性质。这就是说，丙型肝炎病毒属于具有9.5kb正(+)链RNA基因的黄病毒科，并且在宿主细胞中合成病毒多肽的前体。前体蛋白被转化成结构蛋白(核，E1,E2)，该蛋白被包含在其内并可直接成为病毒结构，在用宿主的单个蛋白酶以及由丙型肝炎病毒产生的金属蛋白酶与丝氨酸蛋白酶进行翻译后修饰之后，非结构蛋白(NS2,NS3,NS4A,NS4B,NS5A,NS5B)具有酶活性。具体地说，由于在E2基因的5′端存在两个高变的区域(HVR1和HVR2)，因此可产生各种变体。
虽然尚未确立慢性丙型肝炎发展到肝细胞癌的病程的机理，但是已知与慢性感染和感染的程度密切相关。这就是说，虽然宿主的免疫系统能够产生抑制丙型肝炎病毒的抗体，但是抑制抗体仅作用于有限类型的病毒，各种变体会迅速产生对抑制抗体的耐受性(高速的基因突变)。尽管存在着抑制抗体，各种变体仍然可以继续引发宿主的感染(免疫逃避)。更进一步地，由于持续感染造成的损伤，宿主肝细胞的再生能力可能会引起致癌作用。最近，有报告说宿主的双链的RNA依赖蛋白激酶R(PKR)可使elF-2a磷酰化以刺激病毒的编程性细胞死亡。但是，丙型肝炎病毒会产生能使PKR钝化的蛋白质。例如，丙型肝炎病毒对施用干扰素的耐受性可解释为由于丙型肝炎病毒的变体使PKR钝化而造成的。因此，变体的存在是生产丙型肝炎病毒疫苗的障碍。
由于丙型肝炎病毒的上述特征，现有的用作治疗丙型肝炎治疗剂的许多药物的治疗效果都不够理想。干扰素可能预防丙型肝炎转化为肝硬化和肝细胞癌，实际上不能减少丙型肝炎病毒。而且，临床研究还报告了干扰素的一些有害影响。因此，在科研机构中有理由进行开发和研究工作，以便能够发现和开发出丙型肝炎病毒蛋白酶的抑制剂用于治疗丙型肝炎。
本发明人进行了广泛的研究工作发现了能够解决前述治疗丙型肝炎的治疗剂如干扰素所存在的问题的物质，它们具有免疫增强活性以及可有效治疗丙型肝炎的抗病毒活性。具体地说，本发明人以各种天然药用植物作为研究对象，其结果是在多种天然植物中由黄柏皮和败酱的混合物得到的混合萃取物可达到本发明的上述目的。
发明的公开因此，本发明的目的是开发和提供一种用于治疗丙型肝炎的药物组合物，该组合物含有黄柏皮(芸香科)和败酱(败酱科)的混合萃取物作为活性成分。
更具体地，本发明涉及用于治疗丙型肝炎的药物组合物，该组合物含有黄柏皮和败酱的混合的水或醇萃取物作为活性成分。


为了充分理解本发明的性质和目的，应参看下述对附图的详细说明。
图1表示败酱的水萃取物的UV扫描图；图2表示黄柏皮的水萃取物的UV扫描图；图3表示本发明混合水萃取物的UV扫描图；图4表示败酱的水萃取物的HPLC扫描图；图5表示黄柏皮的水萃取物的HPLC谱图；图6表示本发明混合水萃取物的HPLC谱图；图7表示糖，即蔗糖、乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和果糖的HPLC标准谱图；图8表示糖，即麦芽糖和半乳糖的HPLC标准谱图；图9表示在本发明混合水萃取物中糖的HPLC谱图；图10表示败酱水萃取物中的氨基酸分析色谱图；图11表示黄柏皮水萃取物中的氨基酸分析色谱图；图12表示本发明混合水萃取物中的氨基酸分析色谱图；
图13是试验1的临床试验结果图，本发明的混合水萃取液以口服给药形式给丙型肝炎病人用药。抗病毒效果以抗体的效价或mRNA的拷贝数目表示[图13A病例1，图13B病例2，图13C病例3，图13D病例4，图13E病例5，图13F病例6]；图14说明黄柏皮和败酱各自的水萃取物或它们的混合物对体内依赖T-细胞抗体形成反应的作用；图15说明了本发明黄柏皮和败酱的混合水萃取物和混合醇萃取物对体内依赖T-细胞抗体形成反应的作用；图16说明本发明黄柏皮和败酱的混合水萃取物对T-细胞增生的作用；图17说明本发明黄柏皮和败酱的混合水萃取物对免疫细胞增生的作用；图18说明本发明黄柏皮和败酱的混合水萃取物对免疫细胞有丝分裂原和凝集素引起的免疫细胞增生的作用；图19说明本发明黄柏皮和败酱的混合水萃取物对小鼠的肝、肾和心脏(组织形态学)的影响[剂量15g/kg,H&E染色，图19A肝，×400，图19B肾，×200，图19C心脏，×200]；图20表示本发明的水萃取物的抗氧化活性。
完成本发明的最佳模式下面将更具体的说明本发明。
本发明涉及用于治疗丙型肝炎的药物组合物，该组合物含有混合萃取物作为活性成分，特别是含有黄柏皮和败酱的混合水或醇萃取物作为活性成分。具体地说，本发明的组合物对慢性丙型肝炎和早期肝硬化显示出直接的抗丙型肝炎病毒的活性。同时，此组合物可减少炎症和提高宿主免疫系统中T-辅助细胞的活性。相应的，通过直接干扰和预防的机理本发明的组合物可用于有效地治疗丙型肝炎和由此引起的早期肝硬化。
另外，如下面的试验所证明的，本发明的混合萃取物对丙型肝炎具有高治疗活性，并显示了低毒性，对人的药物耐受性没有任何不利的影响。因此，就安全性和长期治疗而言，本发明的组合物是理想的。
用于制备本发明混合萃取物的植物之一败酱(败酱科)与白花败酱(Patrinia villosa JUSS)、岩败酱(Patrinia sibirica JUSS)等属于同一类植物，是所有温区，包括韩国在内的田野和山区在天然生长的多年生草本植物。在中医药里被用作抗炎剂，用于治疗眼科疾病、酿脓链球菌化脓性感染、水肿、带下症等。此外，已有报道说它们具有下述活性a)在热水中的萃取物具有抗肿瘤(例如子宫癌、食道癌、胃癌、肠癌等)活性；b)对葡萄球菌和酿脓链球菌等具有抗菌活性；c)刺激损坏的肝细胞再生的能力，从而防止肝细胞的退化；d)改进门静脉的血液循环一刺激肝细胞的再生；e)稳定中枢神经系统的作用；f)强止痛活性；g)抗高血压和利尿活性。
败酱，其根部含有精油，各种皂角苷，碳水化合物和痕量的生物碱如香豆素。在根部的皮质内发现有乙酸，甲酸，戊酸等，以及诸如缬草恰碱和缬草碱的生物碱。在这些组分中，已知戊酸是有效的止痛剂。在干燥的种子中，含有19.4％-19.9％的蛋白质和30-34.4％的脂肪。但是，还没有对包含在败酱中的活性成分和它们的药物活性进行专门的研究。而且，研究的结果表明没有报道过败酱的任何萃取物或任何组分具有抗HCV活性。
制备本发明萃取物所用的另一种植物黄柏皮是黄柏木(芸香科)的杆的皮层，该植物天然生长于韩国、日本、中国等。黄柏木的变种包括Phellodendron amurense var.latifoliolatum NAKAI,var.japonicumOHWI,P.insulare NAKAI,P.molle NAKAI,P.sachalinense Sarg.等。黄柏皮含有1.5-4.5％的黄色或黄棕色染料，以及多种生物碱组分。主要的生物碱组分是小蘖碱。此外，还含有巴马亭、木兰花碱、胍、药根碱、黄柏碱、坎底辛、蝙蝠葛碱等。另外其中还含有苦味的组分黄柏酮、黄柏内酯、β-谷甾醇等。这些组分具有强抗菌活性、抗高血压活性、中枢神经系统抑制活性、乙酰胆碱能活性和抗炎活性。在中医药中，此植物用于治疗骨骼疾病和黄疸。另外，黄柏皮还含有治疗伤寒和霍乱的有效成分，并可用作胃肠疾病的治疗剂。同时，作为苦味健胃药、肠内菌群调解剂和抗炎收敛剂，黄柏皮已经被用于治疗胃肠炎、腹痛、黄疸等疾病。但是，从来没有报道过黄柏皮含有任何能够抑制丙型肝炎病毒增生和通过恢复损坏的T-辅助细胞而增强免疫系统的化合物。
在本发明中，通过众多试验确认将黄柏皮和败酱用水或醇进行萃取所得到的混合萃取物具有抗丙型肝炎病毒的抗病毒活性，并通过刺激T-辅助细胞作用于免疫功能。该萃取物显示出的药物协同作用大大高于由黄柏皮或败酱单独萃取所得到的任何萃取物。在此发现的基础上完成了本发明。
用作本发明的活性物质的黄柏皮和败酱的混合萃取物可由下述方法获得。
具体地说，败酱和黄柏皮的混合水萃取物可用下述方法获得将两种植物的混合物用水提取，高压过滤萃取溶液离心除去凝聚蛋白质的沉淀物，取上清液并冷冻干燥水层得到粉末状的残余物(混合水萃取物)。
另外，败酱和黄柏皮的混合醇萃取物可用下述方法获得将两种植物的混合物用醇提取，优选用具有1-4个碳原子的醇如甲醇、乙醇等提取，蒸发溶剂，在残余物中加水，加热和过滤混合物，用有机溶剂除去滤液中的有机溶剂可溶解的物质，冷冻干燥得到的水层(混合醇萃取物)。
在上述方法中，黄柏皮和败酱的混合使用比以重量计为1∶0.1-5，优选为1:1-2。具体地说，优选萃取1∶1的黄柏皮和败酱混合物。
下文将更详细说明制备本发明两种混合萃取物的方法。
按照本发明制备混合水萃取物的方法，在第一步骤中，将黄柏皮和败酱的干燥混合物磨碎，和在标准蒸汽压(121℃,15磅/a2)下用水，例如自来水或蒸馏水进行加热萃取。
在第一步骤中，相对于每一重量份数的植物材料，水的用量比为10-45重量份数，优选25-35重量份数。
然后，在第二步骤中，离心萃取溶液以除去沉淀，在高压下再次使之饱和，例如在高压容器中，于蒸汽压(121℃,15磅/a2)下沸腾，使所有残余的蛋白质凝聚，过滤或离心除去凝聚的蛋白质。
在第三步骤中，用有机溶剂如氯仿、己烷、二氯甲烷、环己烷等，优选用氯仿或己烷萃取分离出的滤液，得到有机溶剂萃取物，以除去不纯物如树脂、纤维等，然后冷冻干燥得到所需的混合水萃取物。
为了制备本发明的醇萃取物，在第一步骤中，将黄柏皮和败酱的干燥混合物磨碎和用醇提取，优选用具有1-4个碳原子的醇如甲醇、乙醇等提取。
在第一步骤中，相对于每一重量份数的植物材料，醇的用量比为5-40重量份数，优选10-20重量份数。
然后，在第二步骤中，使醇萃取物冷却和在旋转蒸发器中蒸发以除去醇。加水将残余的醇萃取物溶解，沸腾，然后过滤得到的水溶液。
在此步骤中，水的用量是混合植物材料重量的5-30倍，特别是5-15份。在蒸发得到的醇萃取物中加水，使混合物沸腾较短的时间，例如5-10分钟，以溶解醇萃取物，然后过滤。
在第三步骤中，用有机溶剂如氯仿、己烷、二氯甲烷、环己烷等，优选用氯仿或己烷萃取分离出的滤液中的有机溶剂可溶解的物质，以除去不纯物如树脂、纤维等，然后水层用滑石等纯化和冷冻干燥得到所需的混合醇萃取物。
如上所述，黄柏皮和败酱的混合萃取物显示出很强的药用抗-HCV作用，并有效的作用于与T-辅助细胞有关的免疫系统。因此，可作为有效地治疗丙型肝炎的药物组合物。
在将本发明黄柏皮和败酱的混合萃取物用于临床治疗丙型肝炎时，混合萃取物可单独制剂，也可以按照药学领域常用的方法将其与药学上可接受的载体结合而成为适当的药物制剂，然后，按照药学领域常用的给药方式给药，优选通过口服途径。一般来说，本发明的组合物可制剂成为口服的给药形式，例如片剂、胶囊、溶液、粉剂、悬浮剂或糖浆，或可制成饮料。
本发明混合萃取物的使用剂量取决于下述因素萃取物的类型(水或醇萃取物)、肝炎的严重程度、患者的性别、年龄、体重，以及所需作用的种类等。成人口服的日剂量通常是每公斤体重施用5-50mg，优选10-40mg。
另外，如果需要，本发明的混合萃取物可与其它制剂如治疗肝炎的药剂、抗炎剂、抗病毒剂等结合用药，或一起给药。可与本发明的组合物结合用药或一起给药的药剂包括例如DDB(二苯基二甲基二碳酸酯)，蒜油等。
通过下面的实施例和试验对本发明进行更详细的说明。但是，可以理解的是，这些实施例不以任何方式限制本发明。实施例1制备混合水萃取物将干燥的黄柏皮和干燥的败酱以1∶1的重量比混合，用磨机磨碎，取100g磨碎的混合物粉末，向其中加入3000ml水。然后在蒸汽压(121℃，15磅/a2)下沸腾40-60分钟，在除去水不溶解的残余物之后得到萃取溶液。将萃取溶液离心和除去沉淀，加热浓缩上清液，使滤液的总体积减少到1500ml，过滤。在蒸汽压(121℃,15磅/a2)下15分钟使其再次饱和，离心除去得到的沉淀，沉淀包括凝聚的蛋白质，然后过滤。将滤液转移至分液漏斗，向其中加入400ml氯仿以萃取树脂和纤维，然后分离和除去氯仿层。把同样的步骤重复二次。然后在水层中加入200ml正己烷以萃取残余的蛋白质、树脂、纤维和正己烷可溶解的物质。分离出水层，加热至60-80℃，与500g滑石一起搅拌，减压过滤除去滑石。缓慢地再次过滤滤液。冷冻干燥。按照此方法，从黄柏皮和败酱的混合物可得到大约15g所需的混合水萃取物(产率以干重为基计大约为15％)。实施例2制备混合醇萃取物将干燥的黄柏皮和干燥的败酱以1∶1的重量比混合，用磨机磨碎，取100g磨碎的混合物粉末，向其中加入1500ml 70％的乙醇。将混合物放置48-72小时，并不时地进行搅拌，减压过滤以回收醇萃取物，除去残余物。由得到的醇萃取物中蒸发除去醇，将得到的醇萃取物与1000ml蒸馏水混合并沸腾5分钟。向其中加入500g滑石进行第一次纯化，搅拌和减压过滤。将纯化的滤液转移至分液漏斗中，向其中加入400ml氯仿以萃取树脂和纤维，然后分离和除去氯仿层。把同样的步骤重复二次。然后在水层中加入200ml正己烷以萃取残余的蛋白质、树脂、纤维和正己烷可溶解的物质。分离出水层，加热至60-80℃，与500g滑石一起搅拌，减压过滤除去滑石。缓慢地再次过滤滤液。冷冻喷雾干燥滤液。按照此方法，从黄柏皮和败酱的混合物可得到大约10g所需的混合萃取物(产率以干重为基计大约为10％)。
在下面的实施例中测定了植物萃取物的特性，所有的萃取物都是按照与实施例1相同的方法得到的。实施例3本发明的水混合萃取物的UV和HPLC特性本发明的萃取物，即败酱和黄柏皮以及混合植物的萃取物用UV扫描仪(Shimazu,Japan)和HPLC(Waters)分析。图1显示了败酱萃取物的UV扫描图。图2显示了黄柏皮萃取物的UV扫描图。图3显示了本发明混合的水萃取物的UV扫描图。
关于HPLC分析，将各个植物的萃取物和本发明的萃取物溶于50％甲醇，浓度为1mg/ml。将10μl溶液注入HPLC(Waters 510)，使用Inersil ODS 3V反相柱(4.6mmi.d.×250mm L)，流动相为50％MeOH无梯度洗脱，流速为1.2ml/min。用紫外检测器于254nm测定各峰。在HPLC图谱上可观察到各种植物萃取物的特征峰。图4显示了败酱萃取物的HPLC图，败酱萃取物的特征峰在保留时间18分钟处。。图5显示了黄柏皮萃取物的HPLC图，黄柏皮萃取物的特征峰在保留时间25分钟处。图6显示了本发明萃取物的HPLC图，在和各个植物相同的色谱条件下，其特征峰在19分钟和25分钟处。经过鉴定，19分钟的特征峰为败酱萃取物，25分钟的特征峰为黄柏皮萃取物。在19和25分钟两个特征峰是可重复的，因此被认为是各个植物的标准物质。19分钟的峰的积分为144.3±15.5(平均值±S.E.标准偏差)，峰高为49.98±0.39。25分钟的峰的积分为233.6±14.6，峰高为97.80±0.79。
由UV扫描仪和HPLC分析结果，确定了本发明萃取物质量控制的标准方法。实施例4本发明混合的水萃取物的元素分析用Elemental Analyzer(Carlo Erba/E.A.1108)分析本发明混合的水萃取物的各种元素。表1说明了本发明混合的水萃取物含有的碳、氢、氮和硫。
表1本发明萃取物的元素分析结果

实施例5本发明混合的水萃取物中粗蛋白质、脂肪和灰分的分析(1)粗蛋白质和含氮化合物的分析用Kjeldahl Nitrogen Analysis Method测定含氮化合物的含量。该方法主要描述如下含氮有机化合物在沸腾的硫酸中降解为作为产物的铵离子，用酸滴定定量分析所得到的铵离子的量，可计算出含氮量。
用Kjeldahl方法，本发明萃取物中粗蛋白质的量大约为59.98％。
(2)粗脂肪的分析本发明萃取物中的粗脂肪用乙醚萃取，乙醚液在旋转蒸发器中蒸发，测定干燥萃取物，即粗脂肪。
用醚萃取方法，粗脂肪的含量大约为2.29％。
(3)粗灰分的分析将本发明萃取物的样品在500-500℃燃烧，表示粗无机组分的灰分因其不挥发而留下来。粗灰分的含量大约是9.68％。实施例6本发明混合的水萃取物中的无机离子的分析用ICP/AES(SHIMAZU ICPS-1000Ⅲ)和ICP/MASS(FisonsPQ3 STEI)研究无机离子组分。结果列于下表2。
ICP/AES(SHIMAZU ICPS-1000Ⅲ)的操作条件正向电/W 1200冷气流速/min 14辅助气流速/min 0.4雾气(Neb)流速/min 0.8样品吸入速度/min 0.6喷雾室玻璃，冷水， 0℃喷雾器Meinhard concentric主要元素(超过100ppm的元素)ICP/MASS(Fisons PQ3 STEI)的操作条件正向电/W 1200冷气流速/min 14辅助气流速/min 0.4雾气(Neb)流速/min0.8样品吸入速度/min 0.6喷雾室玻璃，冷水，0℃喷雾器Meinhard concentric峰跃变获得的参数每个峰的点3滞留时间/min: 10.24检测器模式 PC痕量元素(小于100ppm的元素)
表2本发明萃取物和每种植物的萃取物中无机离子的含量

如表2所示，本发明萃取物中的重金属含量很低，因此证明本发明萃取物对试验动物和人是无害的。实施例7本发明混合的水萃取物中的游离糖的分析本发明混合的水萃取物中的游离糖可用HPLC(Waters 510)进行分析。将标准物(Sigma)和本发明的萃取物溶于水，浓度为10mg/ml，用注射过滤器(0.45μm)过滤，向HPLC中注射每种样品20μl。
HPLC的条件柱带有Micro-guard Carbo-P的Aminex HPX(300×7.8mm)(Bio-Rad Laboratories)检测器R401 Waters(Attenuation 32)炉温80℃流动相水流速0.6ml/min图7和8表示标准糖，即蔗糖、乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、麦芽糖和半乳糖的HPLC谱图。图9表示在本发明萃取物的HPLC谱图。经计算，本发明混合的水萃取物中糖的含量以mg/g萃取物表示(表3)。
表3本发明混合水萃取物中糖的含量

实施例8本发明混合的水萃取物中的氨基酸分析用HPLC(Pharmacia)分析本发明的萃取物和各种植物(败酱和黄柏皮)的萃取物中的氨基酸组分。采用Pico-tag方法，将100μl各种样品用6N盐酸水解，游离的氨基酸用PITC(异硫氰酸苯基酯)标记。将样品注射至HPLC，使用反相ODS柱，色谱峰用UV检测器于254nm进行测定。
图10说明败酱萃取物中氨基酸分析色谱图，图11说明黄柏皮萃取物中氨基酸分析色谱图，图12说明本发明混合水萃取物的氨基酸分析色谱图。
如表4所示，在本发明萃取物中含有酸性和碱性氨基酸的极性氨基酸的含量高。
表4败酱或黄柏皮萃取物和本发明萃取物中的氨基酸含量

实施例9本发明混合的水萃取物中生物碱和有机酸的分析按照本发明，败酱和黄柏皮以及其混合物各自的萃取物可按照下述流程所述的方法，通过用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水进行溶剂萃取来进行分级。

在上述方法中，所使用的各种溶剂的量应足以进行萃取，而下一种溶剂的使用取决于TLC分析。
再用柱色谱分离各个馏分。分离二氯甲烷相时，使用硅胶柱。硅胶柱(3cm×130cm)的流动相是二氯甲烷和甲醇的梯度洗脱系统(流速1.5ml/min)。对乙酸乙酯和丁醇相，可使用Sephadex LH20柱(3cm×130cm)，作为流动相使用的是水和甲醇的梯度洗脱系统(流速1.5ml/min)。
由柱色谱中分离出来的大批量的各种馏分再用制备HPLC进行制备。关于制备HPLC，可使用反相色谱柱，并使用甲醇和水的混合物作为流动相，流速4.0ml/min。用UV检测器，于254nm测定各峰。由制备HPLC分离出来的单个化合物的结构由1H NMR(1H核磁共振仪AQMS-500/Bruker)和MASS(HP5988A Quadropole质谱仪)鉴定。将1H NMR谱图与标准物的谱图(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO,USA)进行比较。
本发明萃取物的组成如表5所示。
表5本发明混合水萃取物的组成

制剂形式对本发明的抗HIV剂的用药形式没有特别的限制，可根据需要进行适当的选择。制剂形式的实施例包括口服形式如片剂、胶囊、颗粒剂、粉剂和液体制剂。
下文中，特别说明了含有本发明黄柏皮和败酱混合水萃取物的制剂形式的实例。另外，可以理解的是，混合醇萃取物也可以按照相同的方式制剂。制剂形式实施例1片剂为了得到的250mg的片剂，将250mg实施例1得到的黄柏皮和败酱混合水萃取物冷冻干燥的粉末和260mg作为稀释剂的乳糖，以及35mg作为赋形剂的微晶纤维素、15mg作为崩解剂的葡糖酸淀粉钠和80mg作为黏合剂的L-HPC(低羟丙基纤维素)混合，将混合的物料放入一U-形混合器，然后混合大约20分钟。混合完成后，向其中再加入10mg作为润滑剂的硬脂酸镁，再混合大约3分钟。按照本领域的常规方法将混合物压成片剂，然后包膜制成含有250mg混合水萃取物的片剂。制剂形式实施例2糖浆将一定量的白糖溶于一定量的水，向其中加入作为防腐剂的80mg对氧甲基苯甲酸盐和16mg对氧丙基苯甲酸盐。向其中加入实施例1得到的本发明的混合水萃取物冷冻干燥的粉末(4.5g)，并于60℃完全溶解。冷却得到的溶液，向其中加入蒸馏水把体积总量调解至150ml。按照此方法制备出每ml含有30mg混合水萃取物的糖浆。制剂形式实施例3胶囊将300mg实施例1得到的黄柏皮和败酱混合水萃取物冷冻干燥的粉末和200mg作为载体的乳糖混合，将混合物填充到硬明胶胶囊中制成含有300mg混合水萃取物的胶囊。制剂形式实施例4饮料组合物将500mg实施例1得到的黄柏皮和败酱混合水萃取物冷冻干燥的粉末溶于适量的水，然后加入作为辅剂的维生素C和柠檬酸。向其中加入柠檬酸钠和高果糖作为校正味道的试剂。然后加入适量作为防腐剂的苯甲酸钠，加水，把总量调解至100ml。按照此方法制备所需要的饮料组合物。试验例1人体试验中混合水萃取物消除丙型肝炎病毒的效果按下述方法进行临床试验给六名感染了丙型肝炎的患者施用黄柏皮和败酱的混合水萃取物。
结果用抗体效价值表示，该值通过用RIA(放射免疫试验)测定病例1至病例3的抗HCV抗体，以及通过用RT-PCR测定病例4至病例6的HCV的RNA拷贝数目而获得。病例1(图13A)，被诊断为患有慢性丙肝的病人，经测定，每天以2000mg给患者施用本发明的混合水萃取物5个月以后，患者的抗体效价降低至接近0。病例2，一76岁慢性丙型肝炎患者，治疗前抗体效价高达7，每天以2000mg的量给患者施用本发明的混合水萃取物24个月以后，患者的抗体效价降低至接近0。病例3是一名患有慢性乙型肝炎和丙型肝炎的患者，见图13C，每天以2000mg的量给患者施用本发明的混合水萃取物5个月以后，就HCV而言，患者的抗体效价降低至接近0。病例4(图13D)，患有慢性丙肝的病人，用RT-PVR方法测定病人每毫升血浆中RNA拷贝数目，治疗前为1×107，每天以2000mg给患者施用本发明的混合水萃取物5个月以后降低至1×106，治疗6个月后检测不出来，因为已经降低至截断值1×103以下。病例5和6，每天以2000mg给患者施用本发明的混合水萃取物，用RT-PVR方法测定HCV。病例5(图13E)，具有HCV已15年的慢性丙肝病人，治疗8个月后，病人每毫升血浆中的病毒数由1×108降低至1×105。病例6(图13F)，具有HCV已20年的慢性丙肝病人，施用本发明的混合水萃取物治疗7个月后，病人每毫升血浆中HCV RNA拷贝的数目由1×109降低至1×104。
上述临床试验结果看出，本发明的混合水萃取物用于治疗丙型肝炎是非常有效的。试验例2混合水萃取物对体内T-辅助细胞抗体形成反应的影响将体重17-20mg的Balb/c(n=65)小鼠分成13个组，每组5只小鼠。给每组试验动物在腹膜内植入2.4×108SRBC[羊的红细胞(SheepRed Blood Cells)]。从植入的第一天起，以每天3,10,30,100mg的剂量通过口服给小鼠施用实施例1得到的本发明混合水萃取物，以及由每种药用植物(黄柏皮和败酱)得到的水萃取物，共口服3天(0,1,2天)。对照组只口服生理盐水。4天后将每只试验动物处死，在无菌操作下取出脾脏粉碎、过筛，分离出脾细胞，在含有3ml EBSS(Earle’s Balanced Salt Solution)的培养皿中通过柱塞式注射器进行分离。将得到的细胞悬浮液转移至15ml锥形管，静置5分钟。然后，取2ml上清液，于1200rpm离心10分钟，弃去上清液，将残余物再悬浮于2ml EBSS之中，并用EBSS稀释30倍。得到的脾细胞稀释液可用于空斑形成细胞分析，每次的用量为100μl。将上文得到的100μl稀释液与SRBC(25μl，靶细胞)混合，用EBSS、EBSS稀释2倍的豚鼠补体(25μl)和琼脂糖(0.85％EBSS溶液，350μ1)洗涤，在培养皿中固化，然后置于CO2培养箱中于37℃培养大约1小时。然后按照改进的Jeme Plaques Assay方法对空斑和细胞计数[参见Hwan M.Kim等人，J.Toxicological Sciences,21:41-45,1996]，结果用每1×106细胞中形成抗体的细胞数表示。结果的平均值见下表6和图14。
表6本发明每一种植物或混合植物的水萃取物对体内T-辅助细胞抗体形成反应的影响

注1)PA黄柏皮2)PS败酱3)混合水萃取物黄柏皮和败酱混合物的水萃取物，由实施例1获得由上述结果可以看出，本发明混合水萃取物对应于萃取物用量按比例地提高了抗体形成细胞，和对照组相比，100mg/kg剂量组的抗体形成细胞的数目提高到307％，此外，甚至和施用100mg/kg剂量的单一植物萃取物的用药组相比，以10mg/kg剂量施用两种植物的混合水萃取物的用药组，其抗体形成细胞的数目的增加要远远超过，该剂量仅仅是单一植物萃取物的用药量的十分之一。由此结果可以看出，本发明的混合水萃取物显示出协同作用，其作用优于的单一植物萃取物的作用。因此，可以断定黄柏皮和败酱的混合水萃取物对免疫系统显示出优异的协同增强作用。
另外，将本发明实施例1制备的混合水萃取物对免疫系统的增强作用与实施例2制备的混合醇萃取物进行比较。特别是按照与上述相同的方法，用各种混合水萃取物和各种混合醇萃取物，以100mg/kg的剂量进行试验，来测定抗体形成细胞的数目。所得到的结果列于下表7和图15。
表7本发明的混合植物的水萃取物和混合醇萃取物对体内T-辅助细胞抗体形成反应的影响

由上述表7和图15的结果看出，本发明的混合水萃取物和混合醇萃取物都提高了抗体形成细胞的数目，特别是，混合醇萃取物对提高抗体形成细胞的数目更为有效，和混合水萃取物相比提高了51％。试验例3混合水萃取物对T-辅助细胞活性的影响本发明黄柏皮和败酱的混合水萃取物对T-辅助细胞活性的影响用混合免疫细胞反应方法测定。
无菌取出具有不同MHC(主要是组织相容的复合物)抗原，即B6C3F1(H-2k)和BDF1(H-2k)的两种小鼠的脾脏，切碎和过筛，分离出脾细胞。将分离出的脾细胞调节至2.5×106细胞/ml介质(EBSS)。将B6C3F1(H-2d)和BDF1(H-2k)各自的脾细胞加入96穴平板，剂量为每穴100μl，每穴的最后体积为200μl EBSS。
以0.01至100μg/ml的浓度的本发明实施例1制备得到的混合水萃取物处理脾细胞，于37℃，在CO2孵化器中孵化3天。在每穴中加入μCi[3H]胸苷，再孵化18小时。用自动制备收集器收集细胞，然后用β-计数器(Beckman LSC)测定[3H]胸苷的吸收，以确定免疫细胞的增生。得到的结果列于下表8和图16。
表8本发明每一种植物或混合植物的水萃取物对体内T-细胞增生的影响

由上述表8和图16的结果看出，本发明的混合水萃取物可使T-细胞的增生随其使用浓度的增加而按比例增加。试验例4混合水萃取物对免疫细胞增生的影响通过颈脱位将小鼠处死，取出脾脏，用缓冲溶液(EBSS)洗涤。柱塞式注射器分离出脾细胞。将如此得到的含有脾细胞的悬浮液转移至试管中，使之静置大约5-10分钟。收集上清液离心(1200rpm,10分钟)。弃去上清液，将沉淀物再悬浮于RPMI 1640培养介质[10％FCS(牛胎血清)，2-巯基乙醇(2-ME)]，以测定细胞数和测定细胞的存活比。将分离的脾细胞调节至106细胞/ml介质。以每穴200μl的剂量分布于96穴平板，用本发明实施例1制备得到的混合水萃取物进行处理，浓度为每穴0.01-100μg/ml，在孵化器中，于5psi混合气体(7％O2,10％CO2,83％N2)中，和在摆动的板上孵化3天。孵化完成后，将[3H]胸苷以5μCi/ml的浓度加在平板上，然后，然后用β-计数器测定吸收，以确定脾细胞的增生程度。得到的结果列于下表9和图17。
表9本发明的混合水萃取物对脾细胞增生的影响

由上述表9和图17的结果看出，其结果是本发明的混合水萃取物可使免疫细胞的增生随其使用浓度的增加而按比例增加。试验例5本发明的混合水萃取物与凝集素植物凝集索(phytoaglutinine)结合使用时对T-辅助细胞增生的影响为了更清楚地考察本发明的混合水萃取物对T-辅助细胞增生的影响，将本发明的混合水萃取物与植物凝集素(PHA)结合使用，所述的植物凝集素是一种刺激CD4 T-细胞增生的标准的有丝分裂原。具体地，是按照与试验2相同的方法，由小鼠无菌分离出脾细胞，调节浓度至0.5×107细胞/ml，然后以每穴200μl的量分布于96穴平板上。每穴中加入4μl PHA，浓度为250μg/ml，使最后浓度为5μg/ml。将该平板用本发明实施例1制备得到的混合水萃取物进行处理，浓度为每穴0.01-100μg/ml，然后在孵化器中，于37℃，在CO2孵化器中孵化3天。按照与试验3相同的方法，测定T-辅助细胞对[3H]胸苷的吸收以评价T-细胞的增生。对照组不用本发明的混合水萃取物进行处理。得到的结果列于下表10和图18。
表10本发明的水萃取物与凝集素结合使用时对免疫细胞增生的影响

由上述表10和图18的结果看出，本发明的混合水萃取物与PHA结合时，随其使用浓度的增加而按比例的使免疫细胞的增生显著提高。试验例6体内用混合水萃取物处理时免疫细胞在脾脏、胸腺和骨髓中分布比例的变化以100和300mg/kg的浓度通过口服给小鼠施用本发明实施例1制备得到的黄柏皮和败酱的混合水萃取物，共施用3天，然后处死小鼠并取出脾脏、胸腺和骨髓。按照试验2所述相同的方法由这些器官中分离出免疫细胞，而后离心。弃去上清液，每种器官沉淀出的细胞用1ml红细胞溶解缓冲溶液(ACK缓冲溶液，0.15M NH4Cl,0.01MKHCO3,0.1mM Na2EDTA,pH7.2)进行处理。免疫细胞用介质洗涤，调节其浓度至107细胞/ml，以每管100μl的量悬浮于试管中。为了测定小鼠的B细胞，使用了与藻红蛋白结合的小鼠B细胞的大鼠单克隆抗体B220；为了测定T-细胞，使用了Thy-1-PE(CaltagLaboratories)；为了测定CD4 T-细胞，使用了CD4-FITC(CaltagLaboratories)；为了测定CD8 T-细胞，使用了Ly2-FITC(CaltagLaboratories)。把这些抗体加入各个管中，然后在冰冷却下反应40分钟。反应完成后，各管用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，然后用FACScan(Becton Dickenson,San Jose,CA)测定各种免疫细胞的构成比例。得到的结果列于下表11。
表11用本发明混合水萃取物处理时免疫细胞构成比例的变化(单位％)<

>注MAE=本发明黄柏皮和败酱的混合水萃取物由上述表11所述按照测定10,000细胞所得到的结果，脾脏中的B细胞，T-细胞和CD4 T-细胞增加了；胸腺中T-细胞的构成比例提高了，而CD4 T-细胞的分布比例也提高了。在骨髓中，B细胞的构成比例提高了。由此结果看出，本发明黄柏皮和败酱的混合水萃取物能够增强免疫系统，特别是对能够提高丙型肝炎病毒抗性的T-辅助细胞。试验例7本发明混合水萃取物的抗氧化活性已知具有抗氧化活性的物质也具有抗病毒活性，包括抗丙型肝炎病毒活性。本发明混合水萃取物的抗氧化活性可用化学发光试验测定。使用ABEI微过氧化酶-H2O2系统进行本发明萃取物的抗氧化活性试验。微过氧化酶，氨基丁基乙基异鲁米诺(ABEI)和H2O2可由SigmaChemical Company,St.Louis,MO,USA购得。
ABEI可以0.18μM的浓度使用。试验用的萃取物以最大浓度10mg/ml，并以10倍稀释的系列使用。将200μl ABEI和200ml萃取物放入适用于Berthold 9502发光计的聚苯乙烯的试管，把过氧化氢(0.35％)和微过氧化酶(0.01mg/ml)自动注射到试管中以开始氧化反应。用Berthold 9502发光计测定2秒钟内的化学发光。用蒸馏水作为对照。
一般来说，抗氧化剂可防止氧化反应，在此试验体系中降低光密度。因此就用光密度降低的程度评价抗氧化活性。按图20，本发明的萃取物显示出优良的抗氧化活性。这些结果表明本发明的萃取物含有有效的抗氧化剂。与单一植物的萃取物相比，本发明的萃取物显示出更高的抗氧化活性，因此可确认本发明的混合水萃取物具有各种植物萃取物的协同抗氧化活性。试验例8毒性试验为了评价本发明黄柏皮和败酱的混合水萃取物的安全性，按照下述方法测定混合萃取物的LD50值，该数值是衡量急性毒性的标准指标。
30只正常的ICR小鼠(♀,19±1g)用于动物试验，分成5组，每组6只小鼠。将本发明实施例1制得的黄柏皮和败酱的混合水萃取物口服给药，A组剂量为3g并逐渐增加；B组的剂量为6g；C组的剂量为9g；D组的剂量为12g以及E组的剂量为15g。口服混合水萃取物第7天用Behrens-Karber方法测定通过口服施用的混合水萃取物的LD50值。结果如表12所述。
表12通过口服施用的混合水萃取物的致死剂量(LD50)

注*Z两个相邻剂量死亡动物数的半数值(1/2)**d两个相邻剂量之间的差由表12的结果看出，即使是以高达15g/kg体重的剂量施用黄柏皮和败酱的混合水萃取物时，也没有动物死亡，因此可以断定口服混合水萃取物的口服LD50值大于15g/kg，因此，本发明的混合水萃取物是很安全的。换句话说，显然本发明黄柏皮和败酱的混合水萃取物可安全使用而没有任何毒性。
测定LD50值所用试验动物的尸体解剖和病理学(pathohistological assay)试验可按下述方法进行。口服给药一周后将所有的动物用乙醚麻醉，由静脉收集血液。然后取出所需的器官，肉眼观察任一非正常的器官。为了进行病理学试验，将所有解剖的器官在10％中性福尔马林溶液定形10天或更长，然后干燥，用石蜡包埋器(Fisher,Histomatic Tissue Processor,166A,Shadon,UK)包埋，用AO旋转切片机(LEICA，德国)切片为5μm，然后用苏木精和伊红染色。，肉眼观察染色后的器官。
用显微镜进行所有试验动物的解剖器官病理学观察，结果见图19。具体地说，在施用本发明黄柏皮和败酱的混合水萃取物之后没有观察到不正常的肝组织，即使是以15g/kg体重的剂量口服给药的小鼠也是如此(图19A)。此外，给药后的肾也没有显示出任何不正常(图19B)，心肌细胞也没有显示出任何不正常(图19C)。其它主要的器官，包括胃肠道、胰脏、脾脏、肾上腺、脑、睾丸、卵巢、骨髓等均没有发现任何不正常。
因此，可以确定本发明黄柏皮和败酱的混合水萃取物对所有器官没有急性毒性的副作用，即使是以15g/kg体重的剂量(可以给小鼠用药的最高剂量)给药也是如此，它既没有毒性，也没有器官损伤，因此是安全的。
权利要求
1．用于治疗丙型肝炎的药物组合物，该组合物含有黄柏皮和败酱的混合萃取物作为活性成分。
2．按照权利要求1用于治疗丙型肝炎的药物组合物，该组合物含有由黄柏皮和败酱混合物得到的混合萃取物，两者的重量比为1∶0.1至1∶5。
3．按照权利要求2用于治疗丙型肝炎的药物组合物，该组合物含有由黄柏皮和败酱混合物得到的混合萃取物，两者的重量比为1∶1至1∶2。
4．按照权利要求3用于治疗丙型肝炎的药物组合物，该组合物含有由黄柏皮和败酱混合物得到的混合萃取物，两者的重量比为1∶1。
5．按照权利要求1用于治疗丙型肝炎的药物组合物，其中黄柏皮和败酱的混合萃取物是用水或醇萃取得到的。
6．按照权利要求5用于治疗丙型肝炎的药物组合物，其中黄柏皮和败酱的混合萃取物是用具有1-4个碳原子的醇萃取得到的。
7．按照权利要求1用于治疗丙型肝炎的药物组合物，该组合物是用药用载体被进一步制成为药用制剂形式。
8．按照权利要求7用于治疗丙型肝炎的药物组合物，其中的药用制剂形式包括片剂、胶囊、溶液、粉剂、悬浮剂、糖浆或饮料。
全文摘要
本发明涉及用于治疗丙型肝炎的药物组合物,该组合物含有黄柏皮和败酱的混合萃取物,特别是混合水萃取物或混合醇萃取物作为活性成分。本发明的混合萃取物显示出可治疗丙型肝炎的抗病毒活性,有助于防止由丙型肝炎的引起的肝硬化,通过增强免疫功能治疗肝炎和肝硬化,以抑制丙型肝炎病毒的增生,与此同时,可刺激T－辅助细胞的增生,因而可增强宿主的免疫系统。另外,本发明的混合萃取物是天然植物的混合萃取物,其特征是既没有任何副作用,也没有抗药性,即使长期使用可保持其活性。
文档编号A61K31/00GK1236319SQ98801129
公开日1999年11月24日 申请日期1998年7月15日 优先权日1997年8月7日
发明者韩荣福, 洪恩卿, 郑英信, 柳保任, 金相建, 李京荣 申请人:金英姬, 韩荣福