人p51基因及其基因产物的制作方法

专利名称：人p51基因及其基因产物的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的人基因。更详细地说涉及作为抑制癌基因所公知的、与人p53基因及人p73基因类似的新的人基因及基因产物。
背景技术：
p53蛋白是以DNA型肿瘤病毒SV40的大型T抗原和结合核内蛋白而被发现，其基因(p53基因)被克隆着。最初，认为p53基因，通过与ras基因一起导入细胞，使来自胚胎的细胞被转化而得到的，而认为癌基因。可是，通过以后的研究，明显地看出，最初得到的p53基因的克隆是变异型，野生型倒是可以抑制变异型的转化。现在，p53基因的缺失或异常，在很多人的癌中被检测出，作为高发癌性基因病中所知道的Li Fraumeni症候群中，发现了p53基因配偶子变异等，可以认为p53基因是重要的癌抑制基因[Baker,S.J.,et al.,Science,244,217-221(1989)Nigro,J.M.,Nature,342,705-708(1989)]。
人p53基因由393个氨基酸构成，大体上分为N末端结构域(第1～101的氨基酸领域)、芯结构域(第102～292的氨基酸领域)及C末端结构域(第293～393的氨基酸领域)的三个领域。N末端结构域包括酸性氨基酸和高脯氨酸领域等的复制控制所必须的领域，可认为是复制活性化结构域。另外C末端结构域包括很多的碱性氨基酸及形成四聚体的必需领域，可以认为担负着非特异DNA结合和DNA损伤的识别及抑制转化的作用。
在人癌细胞检测出的p53基因的很多异常是误义变异，其大部分是相当从N末端到100～300氨基酸的部位的芯结构域，特别是集中在超过种被保留下的热点(Hot Spot)的领域。这样的芯结构域中的热点领域是涉及到p58蛋白和DNA结合的领域，实际上，由于该领域的变异阻碍了与DNA的特异结合。
从以上，可明显地看出，p53蛋白与其他的基因特异结合后，具有控制复制因子的作用，该控制复制因子可以调节该基因的表达。
作为用p53蛋白诱导复制的基因，可以举出p21基因[称为WAF1或CIP1、或SDI1(EI-Dairy，W.S.，et al.，Cell，75，817(1993))；MDM2(Wu.X.，et al.，Genes Dev.，7，1126(1993))；MCK(Weintraub.H.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，4570(1991)Zambetti.G.P.，et al.，Genes Dev.，6，1143(1992))]、GADD45[Kastan，M.B.，et al.，Cell，71，587(1992)]、细胞周期蛋白G[Cyclin GOkamoto，K.，EMBO J.，13，4816(1994)]、BAX[Miyashita，T.，et al.，Cell，80，293(1995)]及胰岛素类的生长因子结合蛋白[IGF-BP3Buckbinder，L.，et al.，Nature，377，646(1995)]。
编码p21基因的蛋白质是细胞周期蛋白依赖性激活酶(CDK)的阻碍蛋白质，野生型p53蛋白可以通过p21抑制地调节细胞周期[Harper，J.W.，et al.，Cell，75，805(1993)；Xiong，Y.，et al.，Nature，366，707(l993)；Gu，Y.，et al.，Nature，366，701(1993)]。另外也有报告，p21基因结合增殖细胞抗原(PCNA)可直接抑制DNA的复制[Waga，S.，et al.，Nature，369，574(1994)]。进而判明，p21基因是与诱导细胞的老化具有抑制DNA合成作用的SD11基因相同的基因[Noda，A.，et al.，Exp.Cell Res.，211，90(1994)]。
MDM2结合p53蛋白后可以将该蛋白的复制控制活性不活性化，推测可以作为负的反馈调节因子作用。
IGF-BP3是IGF是信号化的负的调节因子。因此，由于p53蛋白的IGF-BP3因子的增加，其结果暗示p53蛋白可以导致抑制IGF性依赖性细胞的成长。
另外，有报告说野生型p53蛋白可以诱导骨髓白血性细胞的编程性细胞的死亡[Yonish-Roboch，E.，et al.，Nature，352，345(1991)]。用放射线照射胸腺细胞编程细胞死亡的诱导对于p53缺损的老鼠不会产生[Lowe，S.W.，Nature，362，847(1993)；Clarke，A.R.，et al.，Nature，362，849(1993)]、另外p53蛋白，可以诱导在水晶体、网膜、脑中失去正常网膜胚种基因(RB基因)活性的细胞的编程细胞的死[Pan，H.，andGriep，A.E.，Genes Dev.，8，1285(1994)；Morgenbesser，S.D.，et al.，Nature，371，72(1994)；Howes，K.A.，Genes Dev.，8，1300(1994)；Symonds，H.，et al.，Cell，78，703(1994)]。何瓦特氏提出，p53蛋白对于RB基因变异的研究是有用的、可以诱导含在RB基因变异的细胞的编程性细胞死亡[White，E.，Nature，371，21(1994)]。
另外，对于只是表达具有温度感受性的p53基因的白鼠的红血球性细胞系，在温度下降时变异的p53基因返回野生型、诱导编程性细胞死亡，从其取出的p53基因在p53缺损的线纤维胚细胞系的软琼脂的培养基中可付与增殖的能力(anchorage-independency)[Xu et al.，Jpn.J.Cancer Res.86284-291(1995)；Kato et al.，Int.J.Oncol.9269-277]。
BAX可以结合作为编程性细胞死亡的抑制因子的bc1-2上，促进编程性细胞死亡[Oltvai，Z.M.，et al.，Cell，74，609(1993)]。由于p53蛋白的BAX基因的增加和bc1-2的减少是与白鼠的白血病细胞株M1的编程性细胞死亡有关系，[Miysashita，T.，et al.，Oncogene，9，1799(1994)]。另外，有报告说对于编程性细胞死亡的信号转导物之一的Fas，在其非小细胞肺癌和白血病中是增加的[Owen-Schaub，L.B.，et al.，Mol.Cell Bioll.，15，3032(1995)]。
从以上的很多研究。可以看出p53蛋白不限于p21基因，可以促进或抑制各种基因的复制。即使在复制调节机能缺损的变异型p53蛋白中，也显示了与细胞内的其他蛋白质的相互作用后传递信号能力和DNA的损伤修复功能。
迄今所知道的p53的蛋白功能，可以举出，复制调节功能、与其他的蛋白质结合的信号传递功能、涉及DNA复制的蛋白质复合体的要素、DNA结合功能、外切核酸酶活性等，这些功能的复合作用的结果，可以引起细胞的细胞周期停止、诱导细胞编程性死亡、DNA的修复、DNA的复制调节及分化诱导。
进而，p53蛋白的功能不仅是基因产生损伤时发生作用，例如在病毒感染、细胞因子刺激、低氧状态、核甘酸库的变化、药物引起的代谢异常等的各种的应激涉及到生体组织时，该刺激作为触发器会引起p53蛋白质的量及质的变化。接受量及质的调节的p53蛋白，通过与其他蛋白质的相互作用表达信号传递和控制其他基因复制的功能，接受生体紧张的生体的组织的细胞的DNA被进行复制调节，使细胞周期停止后修复细胞、通过编程性细胞死亡排除细胞或者促进细胞分化使生体从应激的状态得到缓解[Ganman，C.E.，et al.，Genes Dev.，9，600-611(1995)；Graeber，T.G.，et al.，Nature，379，88-91(1996)；Linke，S.P.，et al.，Genes Dev.，10，934-937(1996)；Xiang，H.，et al.，J.Neurosci.，16，6753-6765(1996)]。
人的肿瘤一半是存在p53基因的变异，所以近年来对于肿瘤的诊断和治疗，都在研究p53基因及其蛋白的临床的应用。使用可特异认识p53基因的变异部位的引物，进行PCR，检测淋巴细胞和体液中浸润的肿瘤细胞的方法，是可以预测肿瘤的浸润范围或者再发等的有效的诊断方法[Hayashi，H.，et al.，Lancet，345，l257-1259(1995)]。
进而，p53蛋白，由于具有编程性细胞死亡诱导功能，所以使用病毒.载体，向肿瘤细胞内导入野生型p53基因的治疗方法已在美国进行着[Roth，J.A.，et al.，Nature Med.，2，985-991(1996)]。最近在日本，有几个地方也开始该基因的治疗。
另一方面，又指出，人肿瘤半数以上不具有p53基因的变异，依此可以判断存在有其他蛋白，该蛋白具有类似p53蛋白抑制肿瘤生成的功能。
本发明者首先发现p53的基因变异不是霍奇金型的恶性淋巴肿瘤(NHL)的前兆指标。
近年，确认了与上述的p53基因高度相同的、被命名为p73的新基因[Kaghad，M.，et al.，Cell，90，809-819(1997)]。根据本发明者的见解，p73蛋白在复制活性化结构域内(1～45的氨基酸领域)与人p53显示29％的相同性，在有6个变异热点的相辅的保存领域的DNA结合结构域(第113～290的氨基酸领域)的相同性是63％，在低聚化领域(第319～363的氨基酸领域)的相同性是38％。可是，对C末端结构域，在p73蛋白和p53蛋白间看不到有明显的相同性。
有报告说，通过p73蛋白过剩表达，可以抑制神经胚细胞株和SAOS2细胞(骨肉肿瘤细胞株)的生长，另外，通过p73的暂时的表达，可以促进微型·同源肾细胞的编程性细胞死亡[Bruce Clurman and MarkGroudine，Nature，389，122-123(1997)；Christine，A.，et al.，Nature，389，191-194(1997)]。
可是p73蛋白，在正常的组织中只是低量的发现，这一点上是与p53蛋白有着小小的区别。进而，神经胚细胞株中的p73蛋白的表达，在用紫外线照射和用低量的放线菌素D不能诱导的点上也是与p53蛋白不同。
这样的p73蛋白不是具有与p53完全相同的功能，今后还需要进一步研究。迄今的观察，报告了此p73作为神经胚肿瘤上推测的肿瘤抑制因子的位置。
本发明的目的是提供人肿瘤的形态形成关连的新基因及基因产物的信息。更详细地说，本发明的目的在于提供如上述的作为癌抑制基因的、与公知的p53基因类似性的新基因及其基因产物。
进而，本发明的目的在于提供培养含有由该基因的部分DNA构成的引物和探针、该基因的载体、导入该载体的形质转化体及培养该形态转化体得到上述基因产物的制造方法。
图的简单说明

图1是与p53蛋白及p73β蛋白一起表示p51A蛋白的构造的结构域特征的图。图中，“TA”是复制活性领域、“DNA binding”是DNA的结合领域及“origo”是低聚领域。
图2是表示用人51A基因编码的氨基酸序列与p53蛋白及p73β蛋白的各氨基酸序列进行比较，观察三者相同性的图，三者相同的部分用四方框围起来。
图3是表示用人51B基因编码的氨基酸序列与p73β蛋白的各氨基酸序列进行比较，观察三者相同性的图，三者相同的部分用四方框围起来。
图4是模式地比较p53蛋白的alternative splicing variant(p51A、p51B)的结构与p73蛋白的alternative splicing variant(p73α、p73β)的结构的比较图。
图5是用照片代替Northen印迹(克隆社的过滤器)的电泳图，表示各种人组织中的p51mRNA表达情况。各泳道，1心脏、2脑、3胎盘、4肺、5肝脏、6骨骼肌、7脾脏、8胰脏。
图6是用照片代替诺占布洛(克隆社的用于RNA过滤器)的电泳图，表示各种人组织中的p51mRNA表达情况。各泳道，1乳腺、2前列腺、3唾液腺、4胃、5胸腺、6甲状腺、7气管、8子宫。
图7是用照片表示形成p51A基因的菌落抑制能图。具体的是表示用p51A表达质粒(p51A)、p53A表达质粒(p53)、带有HA标记的p51A表达质粒(HAp51A)及只用载体(RcCMV)形质转化的各细胞的菌落形成能比较图的照片图。
图8是模式表示用于报道基因构建体的图。图中WAF-1 promoterIuc是分别表示残留二个的p53调节因子的野生型p21WAFⅠ启动子构建体、del 1表示除去一个上流因子的构建体及del 2表示除去二个上流因子的构建体。
图9是表示图8中所示的具有各种报道基因构建体的各p51A表达质粒(p51A)、p53A表达质粒(p53A)或将控制载体(Rc/CWV)导入SAO2细胞时的反式激活的图(参照实验例2)。
图10实验地表示p53应答性的PGC报道基因构建体的各p51A表达质粒(p51A)、HA标识的p51A表达质粒(HAp51A)、p53A表达质粒(p53)或将控制载体(Rc/CWV)导入SAO2细胞时的反式激活的图(参照实验例2)。
图11是表示实验例4中对于含有人p51A基因ICI细胞及4BI细胞、及不含有p51A基因1-2-3细胞，调查在32℃及37℃的不同温度下培养时的DNA片段化结果的照相图(琼脂糖电泳的溴化乙锭染色像)。
图中“1-2-3细胞”是只导入载体，不含有p-51A基因的对照细胞，“ICI细胞”或“4BI细胞”是导入用含有p-51A基因表达载体(pRcCMV/p51A)转化的p51A的1-2-3细胞。另外，λ/Hind Ⅲ是用噬菌体DNA限制酶的分解物、DNA的大小标记(New England Biolabs.Ind.制)。另外，100bp ladder是由具有100bp整数倍大小DNA片段构成的大小标记(GIBCO-BRL制)。
图12～图14是人p51B基因的编码领域的碱基序列(下段)和白鼠同种性(白鼠p51B基因)的该序列(上段)的比较图。此外二者间是相同的碱基时在图中标记*。
图15是表示用图12～图14人p51B基因及白鼠p51B基因分别编码人p51B蛋白及白鼠p51B蛋白的氨基酸序列的比较图。此外二者间是相同的氨基酸时在图中标记*。
发明的公开如上所述，人肿瘤组织的半数以上都不具有作为抑制癌基因的p53基因的变异体，从以前，就已经暗示了在p53蛋白以外也存在起着抑制肿瘤形成功能的基因产物(蛋白)。
为此本发明者们，对于相关抑制肿瘤形成的新基因及基因产物进行了不断的研究，发现了编码具有与上述p53蛋白相同活性的蛋白的、来自人体的新基因，该基因或其基因产物是与编程细胞性死亡有着明显的关系。本发明在这样的见解上完成的。
即本发明是关于下述1～8的人p51基因及与其相关的基因。
1，编码以下的(a)或(b)蛋白质的基因(a)具有序列号1表示的氨基酸序列的蛋白质，(b)在序列号1表示的氨基酸序列中，具有缺失、替换或插入1个或多个氨基酸的氨基酸序列，而且具有p51活性的蛋白质。
2，具有以下的(a)或(b)DNA的基因(a)序列号2表示的碱基序中，由碱基号145～1488所示的碱基序列构成的DNA，(b)在严谨的条件下与序列号2表示的碱基序中，由碱基号145～1488所示的碱基序列构成的DNA杂交，而且编码具有p51活性蛋白质的DNA。
3，具有序列号2所示的碱基序列的上述2的基因。
4，具有以下的(a)或(b)cDNA的基因(a)序列号2表示的碱基序列中，由碱基号145～1488所示的碱基序列构成的DNA，(b)在严谨的条件下与序列号2表示的碱基序列中，由碱基号145～1488所示的碱基序列构成的DNA杂交，而且编码具有p51活性蛋白质的DNA。
5，DNA，其特征是在严谨的条件下与序列号2表示的碱基序列杂交。
6，DNA，其特征是在严谨的条件下与序列号2的碱基号145～1488表示的碱基序列杂交。
7，上述5所述的DNA，其可作为引物使用。
8，上述5所述的DNA，其可作为探针使用。
进而，本发明是下述9～14涉及的人p51蛋白及与其关联的蛋白质或多肽。
9，以下的(a)或(b)蛋白质(a)具有序列号1表示的氨基酸序列的蛋白质，(b)在序列号1表示的氨基酸序列中，具有缺失、替换或插入1个或多个氨基酸的氨基酸序列，而且具有p51活性的蛋白质。
10，上述9所述的蛋白质，在序列号1中，至少有氨基酸号1～59、氨基酸号142～321及氨基酸号359～397表示的氨基酸序列。
11，多肽，其在序列号1中，至少具有从复制活性功能、DNA结合性及低聚化功能中选择出一种功能的氨基酸序列。
12，具有以下的(a)或(b)的多肽(a)在序列号1中具有用氨基酸号1～59表示的氨基酸序列多肽，(b)在(a)表示的氨基酸序列中，具有缺失、替换或插入1个或多个氨基酸的氨基酸序列，而且具有复制活性化功能的多肽。
13，具有以下的(a)或(b)所示的多肽(a)在序列号1中具有用氨基酸号142～321表示的氨基酸序列多肽，
(b)在(a)表示的氨基酸序列中，具有缺失、替换或插入1个或多个氨基酸的氨基酸序列，而且具有DNA结合性的多肽。
14，具有以下(a)或(b)所示的多肽(a)在序列号1中具有用氨基酸号359～397表示的氨基酸序列多肽，(b)在(a)表示的氨基酸序列中，具有缺失、替换或插入1个或多个氨基酸的氨基酸序列，而且具有低聚化功能的多肽。
进而，本发明是p51蛋白的制造方法，其特征是含有上述p51基因的载体、用该载体转化的宿主细胞及在培养基中培养该宿主细胞，从得到的培养物中回收蛋白质。
此外，本发明中的“p51”的称号，只是为了在说明书中使用方便的命名，对于本发明的基因及基因产物(蛋白质)等没有任何的限定。
本发明中的基因(DNA)，不仅是二根链的DNA，也包括有义链及反义链的各一根的DNA，另外对其长度没有任何限制。因此，本发明的基因(DNA)只要没有特殊的说明，是指含有人基因组DNA的二根链DNA、及含有cDNA一根链DNA(有义链)及与该有义链相辅配列的一根链DNA(反义链)及这些片段的任何一种。
本说明书中的氨基酸、肽、碱基序列、核酸等的略号的表示是按照IUPAC、IUB的规定，“含有碱基序列或氨基酸序列说明书的编写方针”(日本、美国及欧洲的三极特许厅)及该领域中惯用的符号来定义的。
(1)p51基因及其等效物本发明涉及编码具有p53蛋白的作用或与其功能同样或者同等作用或功能蛋白质的来自人的新基因。
本发明的基因是对现有的p53基因及p57基因的序列进行研究探索，利用选择出的特定领域进行创意的基础上，利用重新创造的引物，通过进行PCR而得到的。具体的是，使用后述实施例所述的创造的引物，通过进行PCR，虽然不能得到相同的p53基因及p57基因。但是可以得到类似二者的基因片段。作为探针使用此DNA片段，可以从人骨骼筋cDNA文库任意选择出的cDNA克隆中，成功地分离出编码具有与p53蛋白的氨基酸序列高相同性的新蛋白的cDNA克隆。
从得到的cDNA归纳的氨基酸序列的计算分子量是50，894Da，所以本发明者为了方便起见将该cDNA(DNA)命名为“人p51A基因(或简单地为p51基因)”，进而，将用该基因编码出的具有氨基酸序列的蛋白质称为“p51A蛋白质(或简单地为p51蛋白。)”。
通过以后的研究，发现p51cDNA克隆编码的基因中选择地有剪接变异体。另外调查各种人组织中该基因复制产物的发生表达状况的结果，在该产物(蛋白质)主要存在短型和长型的剪接形态。
从这些与剪接变异体相关的p51cDNA归纳的氨基酸信息，短型的剪接变异体是编码具有上述448氨基酸(分子量约50，9KDA)的蛋白质(p51A蛋白)的基因(p51A基因)，另外长型的剪接变异体是编码具有上述641氨基酸(分子量约71，9KDa)的蛋白质的基因。本发明者为了方便起见将后者的基因命名为“人p51B基因(或简单地为p51B基因)”进而，将用该基因编码出的具有氨基酸序列的蛋白质称为“p51B蛋白质(或简单地为p51B蛋白。)”。
本发明中，将上述的p51A基因及p51B基因统称为“p51基因”，p51A蛋白及p51B蛋白统称为“p51蛋白”。
此外，确认了在p51基因的剪接变异体中存在缺损T领域一部分等、复数的存在着。
调查这些p51基因的表达产物时，本发明的p51基因产物(p51蛋白)显示了与p53蛋白类似的复制活性化作用、细胞的成长抑制性、及细胞编程性死亡诱导活性。另外，p51基因的人组织中的表达比p53基因的表达是组织限定的，尽管，与同样组织限定地表达p73基因的组织分布重复，但是比组织分布是更广泛的范围。进而，在人的肿瘤组织或肿瘤细胞株中确认了p51基因的变异。
从这些的见解，更强烈地暗示了本发明的人p51基因是p53抑制肿瘤基因家族的新成员。
本发明的p51基因具体例可以举出后述的实施例1表示的克隆(p51A、p51B)所具有的DNA序列。
作为p51A克隆具有的基因，可以举出后述序列表中，编码由序列号1所表示的448氨基酸残基构成的蛋白质基因(1344核苷酸)。具体的是在序列号2中，相当开环读框的145～1488位表示的碱基序列的基因。
此外，该p51A cDNA克隆的全长碱基序列是如序列号2所示的2816核苷酸。本发明的p51基因中含有用该序列号2表示的碱基序列的基因。序列号2所表示的碱基序列中，开始的密码子(ATG)是位于碱基号第145-147的位置，多腺苷酸化信号(AATAA)是位于2786-2791的位置。
具有用p51A基因编码的448个的氨基酸的p51A蛋白的氨基酸序列表示在序列号1中，但是该蛋白具有用氨基酸号1～59位所表示的复制活性化领域、用氨基酸号142～321位所表示的DNA结合领域、用氨基酸号353～397位所表示的低聚化域。
对于该p51A蛋白的各领域的氨基酸序列中，公知蛋白质p53及p73对于各个相当领域的相同性使用GCG软件(维斯克信·序列分析计·遗传·计算机·社制)的FASTA程序调查的结果，得到表1的结果)参照图1、图2)，(Person，W.R.and Lipman，D.J.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85，1435-1441(1988))。为了参考，将用同样测定方法得到的蛋白质和p73β的蛋白质的相同性一起并记。
表1 另一方面，作为p51B克隆具有的基因可以举出后述序列表中，编码序列号4所表示的641氨基酸残基构成的蛋白质的基因(1923核苷酸)。具体的是序列号5中具有相当于开放读框145～2067位所示的碱基序列的基因。
该p51B cDNA克隆的全长碱基序列是序列号5所示的2270核苷酸。本发明的p51B基因包括含有用该序列号5表示的碱基序列的基因。
具有用p51B基因编码的641个的氨基酸的p51蛋白的氨基酸序列表示在序列号4上，但是该蛋白具有氨基酸号1～59位所表示的复制活性化领域、氨基酸号142～321位所表示的DNA结合领域、氨基酸号353～397位所表示的低聚化域，进而，氨基酸号不能特定的，在C末端侧的领域具有插入的序列(SAM结构域)，这里，是将含有SAM结构域的氨基酸号353～641位的领域作为广义的低聚化域。
对于该p51B蛋白的各领域的氨基酸序列，与p51A蛋白相同地，对于公知蛋白质p73α各个相当领域的相同性使用GCG软件的FASTA程序调查的结果，得到图3的结果。在图3中，四方框围起的部分是p51B蛋白和p73α共同的氨基酸序列，从这里可以明显地看出，本发明的p51B蛋白的氨基酸序列在广范围内是与p73β的蛋白序列有相同性。
这样，本发明的p51基因，包括了具有编码由序列号1表示的氨基酸序列构成的蛋白质的碱基序列的人p51A基因及具有编码由序列号4表示的氨基酸序列构成的蛋白质的碱基序列的人p51B基因。但是本发明的p51基因不受这些限制，也包括该人p51基因的相同物。
这里所说的“人p51基因的相同物”是指具有与上述p51A基因或p51B基因序列相同性、上述结构的特征及基因表达图形上的共同性及上述所述的或用其基因产物(蛋白质)的生物学的功能类似性可认识一个基因家族的一系列的关联基因，当然也包括人p51基因的剪接变异体和等位体(对立基因)。
作为这样的相同物，可以举出用序列号1表示的特定氨基酸序列中，具有1至数个改变的蛋白质，而且，编码具有与该序列p51A蛋白同样作用或功能的蛋白质的基因。该基因可以举出编码保持与用序列号1表示的氨基酸序列有一定相同性的氨基酸序列的物质。
上述氨基酸序列的相同性在用上述的GCG软件的FAST程序测定中，通常，氨基酸序列的全体大约是45％以上，优选的是50％以上。更优选的是在复制活性领域、DNA结合领域或低聚化域的至少一个领域有一定的相同性，例如复制领域的相同性，大约是35％以上、优选的是45％以上、DNA结合领域的相同性是88％以上、优选的是90％以上，低聚化域的相同性大约是70％以上、优选的是80以上。
即本发明的基因，只要满足上述的性质，也包括编码在序列号1所示的氨基酸序列中缺失、替换、插入1个或数个氨基酸序列构成的蛋白质的碱基序列的基因。
“氨基酸的缺失、替换或插入”的程度及这些位置，只要是改变了的蛋白质与用序列号1或4所表示的氨基酸序列构成的蛋白质(p51A蛋白或p51B蛋白)具有相同功能的同效物，就没有特别的限制。即本发明的“p51活性”是指p51A蛋白或p51B蛋白代表的p51蛋白所有的活性及功能，具体的是肿瘤细胞成长抑制活性、编程细胞性死亡诱导活性、细胞中复制调节功能等。
可认为本发明的p51蛋白是与作为细胞增殖抑制因子所公知的p53蛋白具有相同的作用。因此在本发明的说明书中，作为p51蛋白的作用或功能所表示的“p51活性”可用公知的p53蛋白的各种作用或功能来定义。
p53蛋白的作用或功能，可以举出细胞内的复制功能、通过结合其他细胞内蛋白质的信号传递功能、作为DNA复制的蛋白质复合体构成要素作用的DNA结合能及外切核酸酶活性等、或这些功能复合作用发挥的细胞的细胞周期的停止功能、编程细胞性死亡作用、DNA修复功能，DNA复制调节或分化诱导作用等，但是这仅是考虑本发明的p51蛋白所具有的一部分或者全部的功能。
氨基酸序列等的变异，可以在天然中，例如通过天然变异和翻译后的修饰而产生，也可以基于来自天然的基因人为地改变。
本发明，无论这些改变、变异的原因及手段如何，包括了编码本发明的p51蛋白涉及的具有上述特性的蛋白的所有的变异基因。上述人为的变异手段可以举出细胞机理〔Method in Enzymology，154，350.367-382(11987)；同100，468(1983)；nucleic acids Ress.，12，9441(1984)；续生化学实验讲座Ⅰ“基因研究法Ⅱ”日本生化学会编，p105(1986)〕等的基因工学试验的手法、磷酸三酯法和磷酸磷酸酰化法等的化学合成手段〔J.Am.Chen.Soc.89.4801(1967)；同91，3350(1969)Science.150，178(1968)；Tetrahedron Lett.，22，1859(1981)；同24，245(1983)〕及这些的组合方法等。更具体的是，DNA的合成是用核质体法或三酯法的化学合成法，通过市售的自动低聚核苷酸合成装置进行。二个链片段，可合成相辅链，在适当的条件下该链一起退火，或与适当的引物序列一起，使用DNA聚合酶附加相辅链，从化学合成的一根链生成物得到。
本发明的基因的具体形态，可以举出，在序列号2的碱基序列中具有序列号145～1488所示的碱基序列的基因、另外在序列号5的碱基序列中具有序列号145～2067所示的碱基序列的基因。这些碱基序列，是编码组合上述的序列号1或4所示的氨基酸序列的各氨基酸残基密码的组合例子。为此本发明的基因，不限制于这些具有特定的碱基序列，对于各氨基酸残基可组合任意的密码子，具有选择的碱基序列是可能的。密码子的选择可按照常法选择，例如可以考虑利用缩主的密码子的使用频度[Neleic Acids Res.，9，43(1981)]。
本发明的基因如上所示也包括与由序列号2所示的碱基序列中碱基序列号145～1488(以下简称盐基序列(145-1488))所示的碱基序列构成的碱基序列具有相同性的碱基序列。
作为这些基因可以举出，在含有0.1％SDS的0.2×SSC中50℃或含有0.1％SDS的0.1×SSC中60℃下严谨条件下与碱基序列(145～1488)构成的DNA杂交所具有的基因。
本发明的基因，对于本发明具体所说的序列号2的序列信息，可以用基因工学的手段容易地制造和得到[参照Molecular Cloning 2d Ed，Cold Spring Harbor Lab.Press(1989)]；续生化学实验讲座“基因研究法Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ”、日本生化学会编(1986)等]。
具体的，根据发现本发明的p51基因的适当的起源，按常规方法调制cDNA文库，从该文库，用本发明的p51基因中特有的适当的探针和抗体，选择所希望的克隆，以此来实施。[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，78，6613(1981)；Science，222，778(1983)等]。
在上述中，cDNA的起源，可以列举出发现本发明的基因的各种细胞、组织和由这些得来的培养细胞等。另外，来自这些的全RNA的分离、mRNA的分离和精制、cDNA的取得及其克隆等，都是可以按常规方法实施。再有，cDNA文库已有市售，本发明中，cDNA文库可以使用例如从克隆技术公司(Clontech.Lab.Inc.)等购得的各种cDNA文库等。
从cDNA文库克隆本发明的基因的方法，没有特别的限制，可以按通常的方法实施。
具体的，可以举出例如对由cDNA所产生的蛋白质，通过使用该蛋白质特异抗体的免疫的筛选，选择对应cDNA克隆的方法、有选择地结合目的DNA序列使用探针的噬菌斑杂交、菌落杂交等及其组合等。
这里所使用的探针，一般可以列举出以与本发明的基因的碱序列有关的信息为基础，化学合成的DNA等，已经取得的本发明基因本身及其片段可以很好地利用。另外，可以使用基于本发明的p51基因的碱基序列信息所设定的有义引物、反义引物作为筛选用探针。
在取得本发明的基因之际，可以使用PCR方法[Science，230，1350(1985)]或优选使用该法的变型方法的DNA或RNA放大法。特别是，从文库取得全长cDNA较难的场合，优选采用RACE法[Rapid amplification ofcDNA ends；实验医学、12(6)，35(1994)、特别是5′-RACE法(M.A.Frohman，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，8，8998(1988)]。
在采用所说的PCR法之际，基于所使用的引物根据本发明被明确的p51基因的序列信息可以适当设定，可以按常规方法合成。还有，放大的DNA或RNA片段的单离精制可以按上述的常规方法，例如可以根据凝胶电泳法、杂交法等实施。
另外，由上述的方法所得的p51基因或p51的各种DNA片段，按常规方法，例如，二脱氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，74，5463(1977)]，或马库隆戈耳巴特法[Methods in Enzymology，65，499(1980)]或更简便使用市售的序列盒决定其碱基序列。
若用本发明的p51基因，例如，通过使用该基因的一部分或全部的碱基序列，可以检测人的个体或各种组织中的本发明的p51基因的有无表达。
所说的检测可以按常规方法进行，例如，可以列举出利用RT-PCR[Reverse transcribed-Polymerase chain reaction；E.S.Kawasaki，etal.，Amplification of RNA.In PCR Protocol，A Guide to methods andapplications，Academic Press，Inc.，San Diego，21-27(1991)]的RNA扩增或Northern印迹解析[Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Lab.(1989)]和原位的RT-PCR法[Nucl.Acids Res.，21，3159-3166(1993)]和原位杂交等的细胞中的测定、NASBA法[Nucleic acid sequence-basedamplification，Nature，350，91-92(1991)]以及其它各种方法。优选可以列举出，使用RT-PCR-SSCPD的检测法。
还有，作为此处PCR法所使用的引物，只要是可以特异地扩增本发明p51基因(含部分DNA)的该基因特有的引物，没有特别的限制，基于本发明的p51基因的序列消息，可以适当设定。作为通常的引物可以列举出具有10～35程度，优选的是15～30核苷酸长度的、具有本发明的p51基因的部分序列的引物。
这样，在本发明的基因中也包括为检出本发明的人p51基因的、作为特异引物和/或特异探针而使用的DNA片段或者包含这些的。
该DNA片段可以规定作为在由碱基序列(145-1488)所构成的DNA或在严谨的条件下进行杂交为特征的DNA。这里作为严谨的条件，可以列举出作为引物或探针使用的通常条件，没有特别的限制，例如，可以列举出如前所述的含0.1％SDS的0.2×SSC中50℃的条件或含0.1％SDS的1×SSC中60℃的条件。
若用本发明的人p51基因通过使用通常的基因工程的手法，可以容易地大量地稳定地制造含有该基因产物(p51蛋白)的蛋白质。
(2)p51蛋白此外，本发明提供根据本发明的基因编码的p51蛋白。
本发明的蛋白质的具体的形态，虽然可以列举出被称为具有序列号1所示的氨基酸序列p51A蛋白及具有序列号4所示的氨基酸p51B的蛋白的蛋白质，但本发明的蛋白质不限定所说的特定的p51A蛋白和p51B蛋白，其等同物也可。作为等同物，可以列举出在上述各蛋白质的氨基酸序列中，1或数个乃至多个氨基酸有缺失、替换或插入的氨基酸序列，并且，具有上述的p51活性的蛋白质的等同物。具体的，可以列举出上述的p51基因的相同物(含接枝变异体及等位体的p51相关基因)的基因产物。
本发明的蛋白质，可基于本发明所提供的人p51基因的序列信息，按通常方法的基因重组技术[参照Science，224，1431(1984)；Biochem.Biophys.Res.Comm.，130，692(1995)；Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，80，5990(1993)等]进行调制。
(3)含p51蛋白的功能的领域的多肽本发明还涉及上述p51蛋白的一部分领域的多肽。
所说的多肽最好是具有构成p51蛋白的各种功能的领域的某一种氨基酸序列的多肽，具体的，是具有从具有p51蛋白的复制活性化领域、DNA结合领域以及低聚作用领域中所选择至少一种的领域的氨基酸序列的多肽。
如上所述，p51蛋白的复制活性化领域、DNA结合领域以及低聚作用领域分别位于以序列号1所示的p51A蛋白的氨基酸序列中的氨基酸号1～59位、氨基酸号142～321位以及氨基酸号359～397位。
从而，本发明的多肽含有以下各物(ⅰ)具有由序列号1的氨基酸号1～59所示的氨基酸序列(以下简称氨基酸序列1(1～59))的多肽及其同效物。
这样，所说的同效物，可以列举出在氨基酸序列1(1～59)中具有缺失、替换或插入1或多个氨基酸的氨基酸序列，且具有复制活性化功能的多肽。关于氨基酸序列的改变程度，只要具有复制活性化功能，就没有特别的限制，但希望与氨基酸序列1(1～59)的相同性保持在35％以上，最好保持在45％以上。
(ⅱ)具有以序列号1的氨基酸号142～321所示的氨基酸序列(以下，简称氨基酸序列(142～321))的多肽及其同效物。
再有，所说的同效物，可以列举出具有缺失、替换或插入1或多个氨基酸的氨基酸序列，且具有DNA结合性的多肽。关于氨基酸序列的改变程度，只要具有DNA的结合性，就没有特别的限制，但希望与氨基酸序列1(142～321)的相同性保持在88％以上，最好保持在90％以上。
(ⅲ)以序列号1的氨基酸号353～397所示的氨基酸序列(以下，简称氨基酸序列(353～397))的多肽及其同效物。
再有，所说的同效物，可以列举出具有缺失、替换或插入1或多个氨基酸的氨基酸序列，且具有低聚作用功能的多肽，例如，包含p51B蛋白的广义的低聚作用领域(序列号4的氨基酸号353～641)。关于氨基酸序列的改变程度，只要具有低聚作用功能，就没有特别的限制，但希望与氨基酸序列1(353～397)的相同性保持在70％以上，最好保持在80％以上。
另外，本发明，可以是把上述氨基酸序列1(1～59)或同效物、氨基酸序列1(142～321)或同效物、氨基酸序列1(353～397)或同效物中的某一种的氨基酸序列包含在一领域中的多肽，也可以是把所示的任意二个以上的氨基酸序列作为连续的或不连续的领域多肽。
本发明还包含具有编码多肽的碱基序列的基因(DNA)。具体的，可以列举出作为把上述的氨基酸序列1(1～59)编码的碱基序列，在序列号2中，以碱基号145～321所示的碱基序列、作为把氨基酸序列1(142～321)编码的碱基序列，在序列号2中，以碱基号568～1107所示的碱基序列、作为把氨基酸序列1(353～397)编码的碱基序列，在序列号2中，以碱基号1201～1335所示的碱基序列。
(4)p51蛋白的制造方法及用于制造中的使用物。
另外，本发明还提供该p51蛋白的制造方法、及使用该制造方法的使用物，例如含有上述基因的载体，根据该载体所进行的形质转化的宿主细胞。
该蛋白质的制造更详细的说把所希望的蛋白进行编码的基因在宿主细胞中可以表达地进行重组DNA(表达载体)，把它导入宿主细胞中进行形质转化，对该形质转化体进行培养，然后从所得到的培养物中收回所希望的蛋白质。
这里所说的宿主细胞可以使用真核生物及原核生物中的一种。
在真核生物细胞中包含脊椎动物、酵母等真核微生物的细胞。作为脊椎动物细胞，通常使用例如作为猿猴的细胞的COS细胞(Cell，23，175(1981))，中国田鼠的卵巢细胞以及这些二氢叶酸原还酶欠损株(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，77，4216(1980))等，但不限于这些。再有，作为真核微生物，一般使用酵母，其中，使用酵母菌属酵母较为有利。
作为原核生物的宿主，一般使用大肠菌和枯草菌。大肠菌中更为使用大肠杆菌K12株等。
表达载体，只要含有本发明的基因且可以表达该基因的载体，就没有特别限制，一般根据同宿主细胞的关系进行适当选择。
作为宿主细胞，在使用脊椎动物细胞的场合，作为表达载体，可以使用象通常发现那样，位于本发明的基因的上游的启动子、RNA的剪接部位、聚腺苷化部位以及保持复制完了序列的载体。进而这些根据需要也可有复制起点。作为该表达载体，例如，可以列举出具有SV40的初期启动子的pSV2 dhfr[Mol.Cell，Biol.，1，854(1981)]等。
作为宿主细胞，在使用酵母等真核微生物的细胞的场合，作为表达载体，例如可以使用对酸性磷酸酶基因具有启动子作用的pAM 82[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，80，1(1983)]等，本发明的载体，可以在该启动子的上游区域增加本发明的基因的办法进行调制。最好，可以列举出与原核生物基因融合的融合载体，作为该载体的具体例例如可以列举出具有分子量为26000的GST结构域(由S.Japonicum得来)的pGEX-2TK和pGEX-4T-2等。
作为宿主细胞，在使用原核生物的细胞的场合，作为表达载体，可以举出例如可以是在该宿主细胞中可以复制的质粒载体，为在该载体中表达所希望的基因，是在该基因的上流中付与启动子及SD(Shine-Dalgarno)碱基序列、蛋白合成开始所需要的开始密码子(ATG)的表达质粒。特别是，把大肠菌(例如大肠杆菌K12株等)作为宿主细胞使用的场合，作为表达载体，一般使用pBR322及其改良的载体。但是，不限于这些，公知的各种菌株及其载体都可以使用。另外，作为上述的启动子，例如可以使用trp启动子、lpp启动子、lac启动子、PL/PR启动子等。
把本发明的载体导入宿主细胞的方法和以此的形质转化方法，没有特别限制，可以采用一般的各种方法。
所得的形质转化体可以按常法培养，根据该培养，在形质转换体的细胞内、细胞外或细胞膜上，发现、产生(蓄积、分泌)由按所希望那样设计的基因编码的本发明的目的蛋白。
作为在该培养中所使用的培养基，可以根据所采用的宿主细胞适当选择惯用的各种培养基。
对所得到的本发明的重组蛋白，根据希望，通过利用其物理性质、化学性质等的各种分离操作[参照“生化学数据手册Ⅱ”、1175～1259页、第1版第1次印刷、1980年6月23日株式会社东京化学同人发行；Biochemistry，25(25)，8274(1986)；Eur.J.Biochem.，163，313(1987)等]，进行分离精制。
作为该方法，具体的，可以列举出通常的再构成处理、通过蛋白沉淀的处理、(盐析法)、离心分离、渗透压冲击法、超声波破碎、超过滤、分子筛色谱法、(凝胶过滤)、吸着色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、高速液体色谱法、(HPLC)等各种液体色谱法、透析法、这些的组合，作为优选的方法可以列举出利用结合了对本发明的蛋白质特异抗体的柱的亲和色谱法。
再有，把本发明的蛋白质编码设计所希望的基因之际，可以很好地利用在序列号2中以碱基序列(145～1488)所示的人p51A基因的碱基序列，或在序列号5中以碱基序列(145～2067)所示的人p51B基因的碱基序列。也可以利用该基因，根据希望，适当选择变更表示各氨基酸的密码子。
另外，在以p51A基因或p51B基因编码的氨基酸序列中，在其一部分氨基酸残基乃至氨基酸序列通过替换、缺失、插入等改变的场合，可以按例如细胞特定诱变等上述的各种方法进行。
本发明的蛋白质还可以按由序列号1所表示的氨基酸序列或序列号4所表示的氨基酸序列，通过一般的化学合成法制造。该方法包含根据通常的液相法及固相法的肽合成法。
所说的肽合成法更详细地说包含基于氨基酸序列信息，把各氨基酸一个一个地逐次结合链延长的所谓的步进宽幅延长法，和预先合成由数个氨基酸构成的片段，然后把各片段进行偶合反应的片段缩合法，本发明的肽的合成可以采用其中之一法。
上述肽合成法所采用的缩合法可以按常规方法进行，例如可以列举出叠氮法、混合酸酐法、DCC法、活性酯法、氧化还原法、DPPA(二苯基磷酰叠氮)法、DCC+添加物(1-羟基苯并三唑、N-羟基琥珀酰胺、N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二羧酰亚胺)法、伍德沃德法等。这些方法所利用的溶剂，也可以从此种肽缩合反应所使用的公知的一般的溶剂中适当选择。作为此例，例如可以列举出二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、六磷酰胺、二祐烷、四氢呋喃(THF)、醋酸乙酯等及其混合溶剂等。
另外，在上述肽合成反应之际，对于与反应无关的氨基酸乃至肽中的羧基。一般可通过酯化，可以作成例如甲基酯、乙基酯、叔丁基酯等低级烷基酯、例如苄基酯、对甲氧基苄基酯、对硝基苄基酯等芳烷基酯等进行保护。
再有，具有侧链中的官能团的氨基酸，例如酪氨酸残基的羟基可以用乙酰基、苄基、苄氧羰基、叔丁基等进行保护，但也非进行这种保护不可。进而，对于精氨酸残基的胍基残基，可用硝基、三甲苯基、对甲氧基苯磺酰基、亚甲基-2-磺酰基、苄氧羰基、异冰片基氧羰基、金刚烷基氧羰基等适当的保护基进行保护。
具有上述的保护基的氨基酸，肽及最终所得的本发明的蛋白质上的这些保护基的脱保护反应可用惯用方法进行，例如接触还原法和液体氨/钠、氟化氢、溴化氢、氯化氢、三氟醋酸、醋酸、甲酸、甲磺酸等方法。
这样所得的本发明的蛋白质，可以按上述的各种方法，例如按离子交换树脂、分配色谱法、凝胶色谱法、对流分配法等肽化学领域中广泛使用的方法，进行适当精制。
本发明的蛋白质也可以作为用于作成p51蛋白质的特异抗体的免疫抗原加以利用，通过利用这些抗原，可以取得所希望的抗血清(多克隆抗体)及单克隆抗体。
该抗体的制造方法本身，技术人员应理解，在本发明中也可以按这些常用的方法[参照续生化学实验讲座“免疫生化学研究法”、日本生化学学会编(1986)等]。这样所得的抗体，可以有利地用于例如p51蛋白的精制及其借助于免疫学的手法的测定乃至识别等。
另外，本发明的蛋白质作为以其为有效成分的医药品，在医药领域中是有用的。
(5)含有p51蛋白的医药组成物因此，本发明涉及包含上述的本发明的蛋白质的医药。
该蛋白质也包括医药中所允许的盐。所说的盐包含以本领域周知的方法所调制的、例如钠、钾、锂、钙、镁、钡、铵等无毒性碱金属盐、碱土金属盐以及铵盐等。上述的盐也可包括借助于本发明的肽和适当的有机酸乃至无机酸的反应的无毒性酸加成盐。作为代表的无毒性酸添加盐，可以列举出例如盐酸盐、氢氯酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、重硫酸盐、醋酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、对甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、磺酸盐、羟基乙酸酯、马来酸盐、抗坏血酸盐、苯磺酸盐、以及石脑酸盐(ナブシレ一ト)等。
本发明中，包括以上述的本发明的蛋白质作为活性成分，含有它的药学有效量、适当的无毒性医药载体乃至稀释剂的医药组成物或医药制剂。
作为上述医药组成物(医药制剂)中所利用的医药载体，可以列举出根据制剂的使用形态通常使用的有填充剂、增量剂、结合剂、付湿剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、等稀释剂或赋形剂等，可根据由此所得的制剂的给药单位形态加以适当选择利用。
特别是，优选的本发明的医药制剂可适当使用在通常的蛋白制剂等中能使用的各种成分，例如稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗化剂、螯合剂、pH调整剂、表面活性剂等进行调制。
作为上述稳定剂，可以列举出例如人血清白蛋白和通常的L-氨基酸、糖类、纤维素衍生物等，这些可以单独或与表面活性剂组合使用。特别是，若按该组合，有时还进一步提高有效成分的稳定性。
作为上述的L-氨基酸，没有特别的限制，例如甘氨酸、半胱氨酸、谷氨酸等中的任意一种酸均可。
作为上述的糖，没有特别的限制，可以使用例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等单糖类、甘露糖醇、肌醇、木糖醇等糖醇、蔗糖、麦芽糖、乳糖等二糖类、葡聚糖、羟丙基淀粉、硫酸软骨素、透明质酸等多糖类以及它们的衍生物。
作为表面活性剂，没有特别的限制，可以使用离子性或非离子性的表面活性剂中的某一种，例如可以使用聚氯氧乙烯二醇山梨糖醇酐烷基酯系列、聚氧乙烯烷基醚系列、山梨糖醇酐单酰酯系列、脂肪酸甘油酯系列等。
作为纤维素衍生物，没有特别的限制，可以使用甲基纤维素、乙基纤维素、羟基乙基纤维素、羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、羧基甲基纤维素钠等。
上述糖类的添加量，每有效成分1μg约0.0001mg以上，优选约0.01-10mg左右的范围是适当的。表面活性剂的添加量，每有效成分1μg约0.00001mg以上，优选约0.0001-0.01mg左右的范围是适当的。人血清白蛋白的添加量，每有效成分1μg约0.0001mg以上，优选约0.001-0.1mg左右的范围是适当的。氨基酸，每有效成分1μg约0.001～10mg左右。另外，纤维素的添加量，每有效成分1μg约0.001mg左右，优选约0.001-0.1mg左右，的范围是适当的。含在本发明医药制剂中的有效成分量，可在广范围内选择，通常是0.00001～70重量％，优选的是0.0001～5重量％左右。
在本发明医药制剂中，可以添加各种添加剂，例如缓冲剂、等渗化剂、螯合剂等。此处，作为缓冲剂可以列举出硼酸、磷酸、醋酸、柠檬酸、ε-氨基己二酸、谷氨酸和/或它们的盐(例如它们的钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、等碱金属盐和碱土金属盐)等。
作为等渗化剂，可以列举出例如氯化钠、氯化钾、糖类、甘油等。作为螯合剂，可以列举出例如依他酸纳、柠檬酸等。
本发明的医药制剂，除可作溶液制剂使用外，还能把它冻结干燥化作成保存的状态后，用时，可以用含水、生理盐水等缓冲剂等溶解，调制到适当浓度后使用。
作为本发明的医药制剂的给药单位形态，根据治疗目的可以选择各种形态，作为其代表含有片剂、丸剂、散剂、粉末剂、颗粒剂、胶囊剂等固体给药形态、及溶液、悬浮剂、乳剂、糖浆剂、酏剂等液剂给药形态，还可根据给药路径分成经口剂、非经口剂、经鼻剂、经腔剂、坐剂、舌下剂、软膏剂等，按各自同常的方法来进行调合、成形乃至调制。
例如，在形成片剂的形态之际，作为上述制剂载体可以使用例如乳糖、白糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、碳酸钙、高岭土、结晶纤维素、硅酸、磷酸钾等赋形剂；水、乙醇、丙醇、单糖浆、葡萄糖液、淀粉液、明胶溶液、羧基甲基纤维素、羟基丙基纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等结合剂；羧基甲基纤维素钠、羧基甲基纤维素钙、低取代度羟基丙基纤维素、干燥淀粉、藻酸钠、琼脂粉末、昆布多糖末、碳酸氢钠、碳酸钙等崩解剂；聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯类、月桂基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯等表面活性剂；白糖、硬脂精、可可脂黄油、添加氢油等崩解抑制剂、季铵碱、月桂基硫酸钠等吸附促进剂；甘油、淀粉等保湿剂；淀粉、乳糖、高岭土、膨润土、胶体状硅酸等吸附剂；精制滑石、硬脂酸盐、硼酸粉末、聚乙二醇等润滑剂等。
片剂，根据需要，可以作成实施通常的剂皮的片剂、例如，糖衣片、明胶包衣片、肠溶包衣片、涂层片，也可以作成双层片或多层片。
在形成丸剂的形态之际，作为制剂载体，例如可以使用葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、硬化植物油、高岭土、滑石等赋形剂；阿拉伯胶粉末、黄蓍胶粉末、乙醇等结合剂；昆布多糖、乙醇等崩解剂等。
胶囊剂，按通常方法将本发明的有效成分按上述的示例的各种制剂载体混合，填充硬质明胶胶囊、软质胶囊等加以调制。
经口给药用液体给药形态，可以包含含有水的医药容许的溶液、乳化液、悬浮液、糖浆、酏剂等，还可以包含润滑剂、乳剂、悬浮剂等助剂，按常法对此进行调制。
非经口给药用液体投与形态，例如在灭菌水性乃至非水性溶液、乳化剂、悬浮液等调制之际，作为稀释剂可以使用水、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、乙氧化异硬脂醇、聚氧化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯以及橄榄油等植物油，另外，可以配合可以注入的有机酯类、例如油酸乙酯等。在这些当中还可以添加通常的溶解辅助剂、缓冲剂、润滑剂、乳化剂、悬浮剂、分散剂等。
灭菌，通过保留细菌过滤器的过滤操作，杀菌剂的配合、照射处理以及加热处理等实施。另外，在使用之前，可将其溶解于灭菌水和可以适当灭菌的溶剂中，调制成灭菌固体组成物。
在成形坐剂和腔给药用制剂的形态之际，作为制剂载体，例如可以使用聚乙二醇、可可脂、高级醇、高级醇的酯类、明胶以及半合成甘油酯等。
在成形浆、膏、凝胶等软膏剂的形态的成形之际，作为稀释剂，例如可以使用白色凡士林、石腊、甘油、纤维素衍生物、丙二醇、聚乙二醇、硅胶、膨润土以及橄榄油等植物油。
经鼻或舌下给药用组合物用周知的标准赋形剂，按常法进行调制。
还有，在本发明的医药制剂中，根据需要可以含有着色剂、保存剂、香料、风味剂、甜味剂等其它医药品等。
上述医药制剂的给药方法，没有特别的限制，可根据各种制剂形态、患者的年龄、性别、及其它条件、疾病的程度而决定。例如，片剂、丸剂、液剂、悬浮剂、乳剂、颗粒剂以及胶囊剂经口给药，注射剂，可以单独或与葡萄糖和氨基酸等通常的补液混合进行静脉给药，根据需要，可以单独作筋肉内、皮内、皮或腹腔内给药，坐剂为直肠内给药，舌下剂作口腔内给药，软膏剂作经皮的局部给药。
上述医药制剂中应含有的本发明的蛋白质的量及其给药量，没有特别的限制，根据所希望的医疗效果、投与法、治疗期间患者的年龄、性别及其它条件虽可在广范围内作适当地选择，但一般地，该投与量，通常，每日每体重1kg投与约0.01μg-10mg左右，优选约0.1μg-1mg左右为好，该制剂1日中可分数次给药。
(6)基因治疗本发明提供利用本发明的人p51基因的基因治疗法。该治疗法，采取在有变异p51基因的细胞处，供给野生型p51功能的方法。把野生型p51基因或其基因产物本来有的正常功能提供给细胞时，可以抑制受容细胞/标的细胞中的新生物的增殖。上述野生型p51基因，要使用将该基因维持在染色体外的载体或质粒，导入目的细胞。在此场合，该基因从染色体外表达。
在把野生型p51基因导入具有这样的变异p51基因的细胞中，表达正常p51蛋白的场合，p51基因没有必要是全长，只要保持与该基因的所希望机能实质上相同的机能，也可以是其改变体，也可以使用由还保持特定机能的一部分序列构成的基因。作为后者的例子，可以列举出将细胞的非肿瘤的增殖(细胞增殖抑制)所需要的p51蛋白的一部分编码的基因。
野生型p51基因或其一部分，最好导入突然变异细胞，以便与细胞内存在的内因突然变异p51基因之间引起重组。这样的重组中，需要发生修正p51基因突然变异的双重重组。
用于导入所说的重组及维持染色体外的为导入双方所希望的基因载体，在该领域中，是已知的，在本发明中，所说的已知载体的任一种均可使用。
可举出例如，含有与表达控制元件连接的p51基因的拷贝，而且在目的细胞内，表达该基因产物的病毒载体或质粒载体。作为所说的载体虽可利用通常上述的表达用载体，但作为起源载体，最好使用美国专利第5 252 479好说明书及PCT国际公开WO 93/07282号说明书中所公开的载体(pWP-7A、pwP-19、pWU-1、pWP-8A、Pwp-21和/或pRSVL等)或pRC/CMV(Invitrogen公司制)等，进行调制的载体。最好是后述的各种病毒载体。
另外，作为导入基因治疗中，用于载体的启动子优选利用构成治疗各种疾病对象的患处组织中固有的启动子。
做为其具体的例子，例如对于肝脏，可以例举出白蛋白、α-甲脂蛋白、α1-抗胰蛋白酶、铁传递蛋白、甲状腺运载蛋白等。对于结肠，可以例举出羧酸脱水酶Ⅰ、抗癌胚抗原等。对于子宫及胎盘，可以例举出雌激素、阿洛吗他赛得色素、胆甾醇侧链切断、17α羟基酶等。
对于前列腺，可以列举出前列腺抗原、gp91-聚焦基因、前列腺特移的激肽释放酶等。对于乳房可以列举出erb-B2、erb-B3、β-酪蛋白、β-乳球蛋白、乳浆蛋白质。对于肺可以列举出活性剂蛋白质C尿球蛋白等。对于皮肤可以列举出K-14-角蛋白、人角蛋白1或6、白细胞素等。
对于脑可以列举出神经胶纤维质酸性蛋白质、成熟星形细胞特异蛋白质、髓磷酶、酪氨酸羟基酶胰脏蛋白质、高血糖素、胰岛淀粉状蛋白多肽等。对于甲状腺可以列举出甲状球蛋白、降钙素等。对于骨可以列举出α1-胶原、骨钙素、骨唾酸糖蛋白等。对于肾脏可以列举出凝乳酶、肝脏/骨/肾脏碱性磷酸酶、细胞生成素等对于胰脏可以举出淀粉酶、PAP1等。
在基因导入用载体的制造中，基于本发明的p51基因的碱基序列信息，如前所述，通过一般的基因工程手法可以容易地制造、或取得导入的基因(全部或一部分)。
所说的导入基因用载体向细胞的导入例如以电穿孔法、磷酸钙共沉法、病毒形质导入法为主的、在细胞中，导入DNA的该领域中，按已知的各种方法进行。另外，以野生型p51基因所进行型质转化的细胞，以自体分离状态作为癌的抑制乃至癌转移抑制的医药和治疗研究的模型加以利用。
在基因治疗中，上述的基因导入用载体，通过注射投与患者的肿瘤部位局部或全身的办法可以导入患者的肿瘤细胞内。此时若作全身的给药也能达到能转移到其他部位的肿瘤细胞内。在形质导入的基因不能永久性地进入各标的肿瘤细胞的染色体内时，可以通过定期地反复给药达到。
本发明的基因治疗方法包含，把前述的基因导入用的材料(基因导入用载体)直接投与体内的体内、从患者体内取出一度作为标的的细胞，在体外导入基因，然后再把基团反回到体内的体外法这两种方法。
另外，把人p51基因直接导入细胞内，可以用作为切断RNA链的活性分子的硫辛酸酰胺、进行基因治疗。
含有本发明的人p51基因或其片段的基因导入用载体及由该载体导入人p51基因的细胞作为有效成分的本发明基因治疗剂。虽然是以癌为利用对象，但上述的基因治疗(处置)也可以进行癌以外的基因性疾病、如AIDS那样的病毒疾病的治疗，也可进行以基因标识做为目的。
再有导入基因的标的细胞、根据基因治疗(处理)的对象可以适当地选择。例如，作为标的细胞除癌细胞和肿瘤组织以外，还可以列举出淋巴细胞、纤维胚细胞、肝细胞、造血干细胞等细胞。
在上述基因治疗中的基因导入方法中，包含病毒的导入方法及非病毒的导入方法。
作为病毒的输入方法，如鉴于人p51基因是在正常细胞里表达的外来基因、所以作为载体可举出使用逆转录病毒载体方法。作为其他的病毒载体还可以举出腺病毒载体、HIV(human immunodeficiencyvirns)载体、腺伴随病毒载体(AAV，adeno-associated viras)疱疹病毒载体、单纯疱疹病毒(HSV)载体及埃布斯坦一巴病毒(EBV，Epstein-Barrvirus)载体。
作为非病毒的基因导入方法、可以使用以下的方法。磷酸钙共淀法；用封入DNA的核糖体和予先以紫外线破坏基因的不活性化仙台病毒融合作成膜融合核糖体，它和细胞膜直接融合后将DNA导入到细胞内的膜融合核糖体法[Kato，K.，ct al.，J.Biol.Chem.，266，22071-22074(1991)]；将质粒DNA用金属包被，用高压放电物理性地将DNA导入到细胞内方法[Yang，N.S.et a1.，Proc.Nafl.Acad.Sci.，87，9568-9572(l990)]；将质粒DNA直接用体内法注入到脏器官和肿瘤里的裸(naked)DNA方法；[Wolff，J.A.，et al.，Science，247，1465-1467(1990)]；将包埋多重膜正电荷核糖体的基因导入到细胞里的阴离子核糖体方法[八木国夫，医学之路，Vol.175，No.9.635-637(1995)]；为了能只导入特定的细胞，不让其他的细胞进入，与可在目的细胞里表达的受体的配位体和DNA结合，进行给药的配位体DNA复合体法。[Frindeis，et al.，Trends Biotechnol.，11，202(1993)；Miller，et al.，FASEB J.，9，190(1995)]。
上述的配位体DNA复合体法还包含以下所举的方法等。例如，将肝细胞表达的脱唾液糖蛋白受体作为靶子，将脱唾液糖蛋白作配位体使用的方法和强烈表达肿瘤细胞的运铁蛋白受体作为标的，作为配位体使用的方法等。[Wagner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，87，3410(1990)]。
另外，本发明所用的基因导入法，将如上所述的各种生物学及物理学的基因导入法适当组合而形成的方法也是可以的。作为该组合而形成的方法，例如，将某种尺寸的质粒DNA和与腺病毒。六邻体蛋白质特异的聚赖氨酸抱合抗体组合的方法。根据该方法，所得到复合体和腺病毒载体相结合，用如此得到的三分子复合体去感染细胞，由此便可以进行本发明的基因导入、在这个方法中，在和腺病毒载体偶合的DNA在被损伤前可以进行效率化的结合，可能成为内在化及核内体分解。另外，前述的核糖体/DNA复合体，直接在体内可作为导入基因的媒介。
下面具体阐述本发明的基因导入用病毒载体的作成方法及向标的细胞或标的组织导入基因的方法。
逆转录病毒载体系统是由病毒载体和辅助细胞(包装细胞)构成。在这里的辅助细胞是指事先表达着逆转录病毒的结构蛋白质gag(病毒粒子内的结构蛋白质)、P01(逆转录酶)、env(外被蛋白质)等的基因，但是没有生成病毒粒子的细胞。另一方面，病毒载体虽然具有包装信号和LTR(long terwinal repeats)但是不具有“病毒复制所必须的gag、P01、env等的构造基因。包装信号在病毒粒子的装配时，成为标记序列，重组所希望的导入基因(p51基因或者他的片段)代替病毒基因被插入到被选择基因(neo，hyg)和克隆细胞内。在这里为得到高力价的病毒粒子，增加尽可能的短些，将含有包装信号的gag基因的一部分尽量多的取得，不留下gag基因的ATG等是非常重要的。
通过将含有所希望的p51基因载体的DNA移入到辅助细胞里，据此，再根据辅助细胞作成的病毒结构蛋白质，载体基因组RNA被包装，形成病毒粒子，被分泌。作为重组的病毒粒子，感染靶细胞后被病毒基因组RNA逆转录的DNA被编入到细胞核里。插入到载体内部的基因进行表达。
另外，作为提高所希望基因的导入效率的方法，也可以采用这种方法，即使用含有粘接纤连蛋白的细胞粘结构成，和与肝素结合部位接合的区段的片段的方法[Hanenberg.H.，et al.，Exp.Hemat.，23，747(1995)]。
还有在上述逆转录病毒载体系统里被使用的载体，可以举出起源于小鼠的白血病病毒的逆转录病毒例子[McLachlin，J.R.，et al.，Proc.Natl.Acad.Res.Molec.Biol.，38，91-135(1990)]。
关于利用腺病毒载体的方法，要进行详述的话，该腺病毒载体的作成可以基于巴克奈耳[Berkner，K.L.，Curr.Topics Microbiol.Immunol.，158，39-66(1992)]、濑户口康弘等[Setoguchi，Y.，et al.，Blood，84，2946-2953(1994)]、钟之江裕美等[实验医学，12，28-34(1994)]及肯纳等[Ketner，G.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，91，6186-6190(1994)]的方法进行。
例如，作成非增殖性腺病毒载体时，首先要除去腺病毒的初期基因的E1及/或E3基因领域。接着，将含有所希望的外来基因表达单位(作为目的的基因，在本发明中是由p51基因，为转录此基因的起动子、赋与被转录基因稳定性的聚A构成)及含有腺病毒基因组DNA一部分的质粒载体和含有腺病毒基因组的质粒同时转染例如293那样的细胞里。在这两者间引起相同性重组，根据基因表达单位和E1的替换，可以作成含有所希望的p51基因的本发明载体的非增殖性腺病毒载体。另外在粘粒载体里编入腺病毒基因组DNA也可以做成附加了末端蛋白质3′侧腺病毒载体。进而重组作成腺病毒载体时，也可利用YAC载体。
关于腺伴随病毒(AAV)载体的制造概括地说，AAV是作为混进腺病毒的培养系内的小型病毒被表达的。在这里确认了病毒的复制时，不需要辅助病毒，在宿主细胞内自主地增殖的小球病毒属和必须具有辅助病毒的依赖病毒属的存在。该AAV是宿主领域较宽感染各种细胞常见的病毒，病毒基因组的大小是由4680碱基的线状一根链DNA构成的，其两端的145碱基具有被称为1TR(inverted terminal repeat)那样特征的序列。这个1TR部分作为复制开始点，起到引物作用。进而，在对病毒粒子的包装和对宿主细胞染色体DNA的重组该1TR也是必须的。另外，关于病毒蛋白质、基因组左半部分是非构造蛋白质，即编码着起着复制和转录的调节蛋白质的Rep。
重组AAV的作法是利用AAV进入染色体DNA里的性质而进行的，这样一来，就可以作成所希望的基因导入用载体。这个方法要更详细的说的话，首先，留下野生型AAV的5’和3’两端的1TR作成插入其间所希望导入用的基因(人p51基因)质粒。另外，对于病毒复制和病毒粒子的形成所必须的病毒蛋白质，是从别的辅助质粒提供的。必要的是在其两者间不存在共同的碱基序列、通过基因重组的野生型病毒不再出现。然后，将两者的质粒转染到293细胞里，进行导入，进而作为辅助病毒，让其去感染腺病毒(使用293细胞时非增殖型也可以)，产生非增殖性的所希望的重组AAV。接着，因为这个重组的AAV存在于核内，将细胞冻结融解之后，回收，将混入的腺病毒加热到56℃，让其失去活性。之后，必要时，使用氯化钙，用超离心法分离浓缩重组的AAV。向上述那样就可以得到将希望的基因导入用的重组AAV。
HIV载体的作成，可以基于岛田等的方法进行[Shimada，T.，et al.，J.Clin.Invest.，88，1043-1047(1991)]。
HIV病毒，将CD4作成受体特异地感染辅助T细胞，所以按其利用，就可以作成，作为在人CD4阳性细胞里特异地导入基因可能组织的特异基因导入载体的HIV载体。该HIV载体最适于AIDS的基因治疗。
重组HIV载体的作成，首先，通过巨细胞病毒(CMV)的启动子和人球蛋白基因的聚A信号(polyA)表达gag.Pol.env的结构基因和这些表达必要的调节基因(tat.rev等)，而作成包装质粒的CGPE。接着在HIV的两个LTR间插入带有作为标识基因的胸苷激酶(TK)的起动子的新霉素耐性基因(neok)，进而，在作为基本的质粒载体里增加SV40的复制机能，由此在COS细胞内可以高效率增殖地构建载体-质粒HXN。将这些包装质粒的CGPE和载体质粒HXV同时转染到COS细胞里，由此，形成由大量的neok基因进入的所希望的重组病毒，在培养地中可以让其释放。
EBV载体的制造，可以基于清水等的方法进行[清水则夫、细胞工学，14(3)，280-287(1995)]。
关于本发明基因导入用EBV载体的制造简略听说EB病毒(Epstein-Barr virusEBV)是1964年，由Epstein氏从Burkitt淋巴肿瘤的培养细胞中分离出来的，属于疱疹科的病毒[Kieff，E.and Liebowit z，D.Virology，2nd ed.Raven Press，New York，1990，pp.1889-1920]。该EBV里因为有可以转化细胞的活性，为了使其能作为基因导入用载体，就必须调制出没有这种活性转换的病毒，这个是如下那样实施的。
也就是说，首先，将所编入有希望的外来基因靶DNA近旁的EBV基因组进行克隆。在那里加入外来基因的DNA片段和药剂耐性基因，作为重组病毒制作用载体。接着，将由适当的限制性内切酶产生的重组病毒制作用载体转染到EBV阳性Akata细胞里。由相同重组产生的重组病毒由于表面免疫球蛋白处理产生病毒刺激，可与野生型AkataEBV同时回收。将此感染在EBV阴性Akata细胞内，在药剂存在下，通过选择耐性株，就可以得到野生型EBV不共存的所希望的重组病毒感染的Aktata细胞。进而将病毒活性引进到重组病毒感染的Akata细胞里，就可以产生出大量的重组病毒载体。
不用重组病毒载体而将所希望的基因导入到靶细胞里的、非病毒载体制造方法，如可以用基于膜融合核糖体的基因导入法就可以进行。这是因为使膜核糖体(由脂质二重膜构成的小胞)有进入细胞膜的融合活性，是将核糖体的内容物直接导入到细胞内的方法。
上述膜融合核糖体基因的导入，用中西等的方法，就可以进行。[Nakanishi，M.，et al.，Exp.Cell Res.，1 59，399-499(1985)；Nakanishi，M.，etal..Geneintroductioninto animaltissues.In Trends and Future Perspectives inPeptide and Protein Drug Delivery(ed.By Lee，V.H.et al.).，HarwoodAcademic Publishers Gmbh.Amsterdam，1995 pp.337-349]。
下面关于用该膜融合核糖体进行基因导入法概略如下。用紫外线将基因不活性化的仙台病毒和封入所希望的基因及蛋白质等的高分子物质的核糖体在37℃下使其融合。这个膜融合核糖体，内侧有因为核糖体而产生的空洞，外侧有和包膜病毒相同突起那样被称模拟病毒那样的构造。然后，用蔗糖密度斜度离远心法精制后，对于作为靶的培养细胞或者组织细胞，在4℃吸附膜融合核糖体。接着，当到37℃时核糖体的内容物导入细胞。所希望的基因就可以导入到靶细胞里。在这里作为核糖体使用的脂质是具有50％(摩尔比)胆甾醇和卵磷脂及阴电荷的合成磷脂质，希望能作成直径为300nm的一块膜核糖体后使用。
另外，作为使用其他的核糖体将基因导入到靶细胞里，可以举出用阳离子核糖体进行基因导入的方法。该方法是基于八木等的方法而实施的[yagi，K.，et al.，B.B.R.C，196，1042-1048(1993)]。这个方法是，质粒也好细胞也好都给予负电荷，核糖体膜内外两面给予正电荷，用静电使质粒的进入增加，使和细胞的相互作用增加。在这里所使用的核糖体为具有正电荷的多层膜的大的模核糖体(multilamellar largevesiclesMLV)，但是使用1枚大的核糖体(large unilamellar vesiclesLUV)和1枚小的膜核糖体(small unilamellar vesiclesSUV)与质粒作成复合体，也可以导入所希望的基因。
关于质粒包埋阳离子的调制方法，概括的说，如下首先将脂质TMAG(N-(a-trimethy lammonioacetyl)-didodecyl-D-glutamate chloride)、DLPC(dilauroy phosphatidylcholine)及DOPE(dioleoyl phosphatidylethanol-amine)按摩尔比1∶2∶2的比例调制成含有氯仿的溶液(作为脂质浓度为1mM)。接着将总量为1μmol的脂质注入到尖嘴型试验管里，用辊式蒸发器将氯仿减压、除去、调制成脂质薄膜。再次减压直到将氯仿完全除去，使其干燥。之后将含有20μg的基因导入用质粒的0.5ml的Dulbecco的磷酸缓冲生理食盐液-Mg，Ca添加进去，用氮置换后，用涡流混合器搅拌20分钟，就可以得到包埋含有所需基因质粒阳离子悬浮液。
把上述所得到的包有质粒的阳离子MLV作为治疗剂使用，可以作为一例，例如，将含有表达目的基因的cDNA的表达质粒上包埋在上述的阳离子性MLV中，使得DNA的量为0.6μg，核糖体脂质量30nmol，使其在2μl的磷酸缓冲生理食盐液里悬浮，对从患者处抽出的靶细胞或者患者组织隔日投入的这样方法。
可是，所称的基因治疗根据日本厚生省的指导方针的定义为以治疗疾病为目的，将基因或者导入基因的细胞注入到人体内。但是本发明的基因治疗，不仅是在该指导方针的基础上，在前述的靶细胞里导入作为人p51基因等的癌抑制基因，由此导入的基因不仅治疗以癌为首的各种疾病，而且还包括可以将成为标识的基因或者导入标识基因的细胞导入到人的体内。
本发明的基因治疗中，在所希望的基因向靶细胞或者靶组织导入的方法，有2个代表的方法。
其中的第1个方法为，从作为治疗对象的患者那里采取靶细胞后，将该细胞在体外，例如在白细胞介素-2(IL-2)等的添加下培养，导入被逆转录病毒载体包含的p51基因之后，将得到的细胞再移植的方法(ex vivo法)。该方法适合用于治疗以欠缺ADA为首的，因欠缺基因而发生的基因病和癌症、AIDS病等的治疗。
第2个方法，是将目的基因(人p51基因)直接注入患者的体内或肿瘤组织等的靶部位的基因直接输入法(直接法)。
上述基因治疗的第1种方法，现详细的说向如下那样实施。即，将从患者处采取的单核细胞用血液分离装置从单核细胞中分出，将取出的细胞在1L-2的存在下AIM-V培养地等的适当培养地里，培养72小时左右，加入含有应导入基因(人p51基因)的载体。为了加速基因的导入效率，在鱼精蛋白存在的情况下，32℃1小时，2500转离心分离后，在37℃ 10％二氧化碳气条件下培养24小时也可以。将这种操作反复进行数次后，进而在1L-2存在下，AIM-Vt培养地里培养48小时，把细胞用生理盐水里洗净，算出生细胞数，基因导入效率，在上述的in situ PCR中例如，所希望的对象是酵素活性的话，根据测定他的活性程度来确认目的基因导入效果。
另外，对培养细胞中的细菌、真菌培养，枝原体感染的有无，内毒素检索等的安全度进行检查，确认安全性后，将导入予测效果用基因(人p51基因)的培养细胞点滴静脉注射到患者身体里。此方法从数周到数月的间隔反复进行，以此来实施基因治疗方法。
在这里病毒载体的投入量，根据导入靶细胞进行适当选择。通常，作为病毒价，例如对于靶细胞1×108细胞希望采用1×103cfu到1×108cfu范围的投入量为好。
作为上述方法的另一种方法，将含有目的基因(人p51基因)的逆转录病毒载体的病毒产生细胞和患者的细胞共同培养，向目标细胞里导入基因的方法。
当实施基因治疗的第2种方法(直接法)的时，特别是根据在体外进行预备实验，根据基因导入法，实际上，目的基因(人p51基因)是否被导入，要根据予先载体基因cDNA的PCR法的检索和根据in situPCR法进行确认，或者基于目的基因(人p51基因)的导入所希望的治疗效果的特异活性的上升或靶细胞的增殖增加或增殖抑制，来进行确认。另外，使用病毒载体时，是否用PCR法进行了增殖性逆转录病毒等的检索、是否测定逆转录酶活性或根据用PCR法对膜蛋白(env)基因进行监控，由此来确认基因治疗对基因输入的安全性。这种重要性自不待言。
本发明的基因治疗法中特别是以癌和肿瘤为对象时，从患者身上采取癌细胞后，进行酶处理等后，树立培养细胞后，如用逆转录病毒，将所希望的基因导入到靶的癌细胞里，用G418细胞筛选之后，测定1L-12等的表达量，接着进行放射线处理，在患者肿瘤内或者肿瘤旁接种的癌治疗法。
疱疹单体病毒胸苷激酶(HSV-Tk)基因是，特别是将是核苷酸类似物的鸟嘌呤(GCV)转换为毒性中间体、引起分裂性细胞死亡，将该基因针对于肿瘤进行基因治疗是公知的[美国专利等5631236号说明书；特表平9-504784号公报]。该方法注入编入被称为自杀基因的前述HSV-TK基因的逆转录病毒载体产生细胞，一周后，投入作为抗病毒剂被人所知GCV时，在基因导入细胞内GCV接受磷酸化后，被活性化，导致基因导入细胞自杀，同时，通过间隙连接的细胞，使周围的非导入细胞也被杀死了。就是这样利用这些的基因治疗方法。本发明的基因导入载体或者是含有该载体的细胞，也以用于上述的基因治疗法。
作为别的基因治疗法可以举出，制作免疫核糖体，该核糖体含有结合了在靶细胞表面的抗体的基因，将包埋cDNA选择地有效地导入到靶细胞里的方法。另外，将含有细胞因子基因病毒载体和含有自杀基因腺病毒同时投入的结合基因疗法也是可能的。这些方法是在该领域的从业者应具有的水平。
(7)基因治疗用医药组合物本发明另外还提供导入了本发明的基因用载体或者目的基因(人p52基因等)的细胞作为活性成分，把这些和医学的有效量适当的无毒性医药载体或者稀释剂共同作为医药组合物或者医药制剂(基因治疗剂)。
本发明的医药组合物(医药制剂)作为能利用的医药载体，根据制剂的使用形态使用通常的填充剂、增量剂、结合剂、付湿剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂等的稀释剂及赋形剂等。根据这些制剂的投入单位形态，可以进行适当的选择。
作为本发明药制剂的投入单位形态同样可以举出，如与前所述p51蛋白制剂相同的例子，根据治疗目的，可以从各种形态进行适当地选择。
例如，含有本发明的基因导入用载体医药制剂，可以调制成该载体被核糖体包埋在核糖体的形态或者调制成用含有所希望的基因的逆转录病毒载体的病毒感染的培养细胞的形态。
还可以调制成，磷酸缓冲生理食盐液(PH7.4)，林格氏液，细胞内组成液用注射剂里配合的形态。另外还可以调制成和精蛋白等基因导入率很高的物质共同投入的形态。
上述医药制剂的给药方法，没有特别的限制，根据各种制剂形态，患者的年龄，性别及其他条件，患病的程度等而定。
上述医药制剂中，应含有的本发明的有效成分的量及给药量无特别规定，根据所希望达到的治疗效果，投入法，治疗期间，患者的年龄，性别及其他条件，适当选择适用的幅度。
一般来说，作为医药制剂所希望的基因含有逆转录病毒载体的投入量，每日体重1kg，例如作为逆转录病毒效价大约从1x103pfu到1x105pfu程度为好。
另外，导入有所希望的导入用基因的细胞时，从1x104细胞/body到1x105细胞/body的范围中选择的话为好。
该制剂也可以分1日1至数次给药，也可以从1周及到数周的间隔来进行给药。
另外，优选的是，也可以和鱼精蛋白等提高基因导入效率高的物质及含有这些物质的制剂同时投入使用。
将本发明的基因治疗适用于癌症治疗时，前边已讲述的各种基因治疗方法可以适当地组合进行，前述的基因治疗也可以和目前的癌症化学疗法，放射线疗法，免疫疗法等组合进行。进而本发明的基因治疗包括它们的安全性，可以参考NIH的基准进行实施[RecombinantDNA Advisory Committee，Human Gene Therapy，4，365-389(1993)]。
(8)在肿瘤诊断方面的应用根据本发明，为了能够检验出促使人的细胞的肿瘤形成的p51变异基因的存在。通过调制血液或血清的生物学类的试样，萃取所希望的核酸，来分析p51敏感性变异基因是否存在。另外，根据本发明，为了能检测出在细胞或者组织里的新生物，向恶性前驱的发展，或者予后指标的存在，可以调制有障碍的生物学的试样，来分析p51新生物变异基因存在与否。使用这种方法就可以检测出在细胞或者组织里新生物，恶性前驱障碍的进行，或者作为予后指标是否存在。这些诊断，如癌的诊断及癌治疗效果的判定及予后的预测等都可以进行了。
该检验的方法例如予先从患有肿瘤患者那里取样，得到关于p51变异基因的情况并以此为基础，如根据p51基因的变异部位及它的变异序列情报，作成该变异DNA片段，设计成可以进行变异基因的筛选和/或可用于扩增那样的形式。具体地讲，作成可在噬斑杂交、菌落杂交、Northene印迹法、RNA印迹法等使用的探针、用PCR可以扩增变异DNA片段的探针。为此，首先要作成具有和变异相同序列的引物，作为筛选用探针使用，让其和生物学的试样(核酸试样)相反应，可以确认含有该p51基因的变异序列的基因是否存在。该核酸试样，为了能容易地检测出靶序列，可以用变性、限制消化、电泳或者斑点印迹法等的种种方法进行调制。
作为前述的筛选方法，特别是用PCR法，灵敏度方面更好一些，该方法是只要p51变异片段作为引物使用，就没有别的特别限制，以前为众所周知的方法(science，230，1350-1354(1985))和新的被开发及将来要使用的PCR变法(木神、佳之等编，羊土社、实验医学，增刊，8(a)(1990)；蛋白质、核酸、酶、临时增刊，共立出版(株)，35(17)(1990)]中的任何一种都可以利用。
作为引物使用的DNA片段，是化学合成的低聚DNA，这些低聚DNA合成是由自动DNA合成装置如使用DNA合成装置(PharmaciaLKB Gene Assembler Plus富马西亚社制)而合成的。合成的引物(有义引物或反义引物)的长度约10～30核苷酸程度。上述作为筛选用的探针通常使用带有标识的探针，没有标识的也可以，用直接或间接的与标识的配位体的特异结合也可进行检测。适当的标识以及标识探针及配位体方法等在本发明的技术领域里为人所公知，如用切口平移、随机引物或激活酶处理的方法，编入的放射性标识、维生素H、荧光性基、酶、抗体等都被包含在这个技术里。
作为检测用PCR法，如可以举出PT-PCR法，可以适用于该领域的各种各样的变法。
使用PCR法，可以测定野生型p51基因和/或变异p51基因的存在以及定量这些基因的DNA。该方法是如MSSA法的竞争定量法[Kiaoshita，M.et al.CCA，228，83-90(1994)]或者是作为伴随着一根链DNA的高次构造变化的移动度，利用此变化而作成的突然变异检验法的PCR-SSCP法(Ohta，M.et al.Genomics，5，874-879(1989))。
在上述的分析法中，调制含有p51的变异(例如基于从癌症患者那里得到的部位变异情报而制成的变异序列)1个及数个引物，与从生物学试样得到的DNA杂交后、对PCR扩增片段和p51野生株DNA片段，用标准的SSCP解析法，测定得到的移动度及峰领域，与用前述的引物扩增的扩增产物的被检试样的移动度以及和峰领域的进行对比，由此可以同时进行特定领域变异和该变异产物的定量。
在前述中含有作为测定对象变异p51基因的被检试样，只要含有该基因的话就没有特定限定，可以使用，例如可以举出，血液、血清、尿、切除组织等的生体生物材料。变异p51基因从这些被检测试样中，可以按照通常作法萃取、精制及调制。
所以，关于作为本发明上述标准的DNA片段将予先测定的移动度与使用p51变异引物对的被检试样中的p51 DNA的PCR扩增工序里作为扩增产物的被检试样的移动度相比较，可以较简单，良好地进行p51 DNA特定领域的变异的检测。
进而，使用设定既知阶段量的标准时，将其峰领域与以上述的方法的使用p51变异引物对的被检测试样中的p51 DNA的PCR扩增工序里，作为扩增产物的被检试样的峰领域，进行对比，可以同时进行被检试样中的p51变异的定量。在该方法中使用的引物对、标准、PCR-SSCP解析及其检验手段等的改变，这些对于在此领域里的从业者来说，是很容易得到的，只要使用野生p51基因及变异p51基因的序列，本发明理所当然的包括了这些改变。
关于本发明的测定方法，更详细的举例如下首先从患者血清里用碱、酸处理等通常的作法抽出DNA，在得到的DNA溶液里，将序列号为1的碱基序列(145-1488)的一部分的特定长度构成的负链部分序列，和将含有荧光标识的该碱基序列(145-1488)的一部分序列的特定长度构成的正链部分序列的引物对，让其和具有耐热性DNA聚合酶相作用来扩增标识了的DNA片段。另一方面，基于从患者处得到的p51部位变异情报，含有化学合成的变异序列1或由多数的DNA片段分别加入质粒载体上，对大肠杆菌形成转换大量培养后，使用精制重组的质粒，制成如103拷贝、104拷贝、105拷贝、106拷贝、107拷贝及108拷贝的标准。在这里将含有上述的碱基序列(145-1488)的一部分的特定序列的负链部分序列、及含有荧光标识的碱基序列(145-1488)的一部分的特定序列的正链部分序列，将此二个序列的引物对，让其和耐热性DNA聚合酶作用来扩增被标识的DNA片段。把在前述中被扩增的DNA溶液在95℃，5分钟左右的情况下加热，直接在冰中冷却，根据ALF自动序列仪(弗尔马西亚社制)进行自动序列的SSCP分析，由此可以测出荧光峰。另外，该SSCP解析的泳动最好在大约30℃±10℃的情况下进行。
将从患者血清里得到的峰(移动度)和标准的峰(移动度)相比较，其泳动时间来确认和标准一致的峰，由此就可以判定出患者的p51的变异的类型(种类)。另外，算出标准的峰领域，由此作成标准曲线，从患者DNA中峰领域的计算值，可以进行该p51 DNA的定量。
(9)p51基因的变异检验法及各种测试法本发明提供了一种将被检测试样中的p51 DNA的特定领域的变异检验和其定量法能同时进行的简单的检测方法。
另外，本发明的测试方法，利用试剂盒，能简单地测试出试样中的野生型p51基因及变异p51基因。
故本发明还提供了能测试出含有上述野生型p51DNA片段及变异p51DNA片段为特征的野生型p51及变异p51的检测用试剂盒。
该试剂盒，至少含有下列必须具备的构成成分序列号2所表示的碱基序列(145-1488)或者它的辅助的碱基序列的一部分或者全部的杂交的DNA片段、或碱基序列(145-1488)的变异序列或者它的变异序列相辅的碱基序列的一部或者全部杂交的DNA片段。其他的成分包括标识剂、PCR法所必需的试剂(例如，Tag DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸、引物等)。另外序列号5所标示的碱基序列(145-2067)可以代替上述序所标示的碱基序列(145-1488)。
作为标识剂，可以举出放射性同位元素或者萤光物质等的化学修饰物质等。同时，DNA部分自身也可预先用该标识剂偶联。还有该试剂盒为了能够顺利进行，也可含有反应稀释液，标准抗体、缓冲液、洗净液、反应停止液等。
另外，本发明还提供了用前述测试方法进行癌的诊断方法，及用用该方法的诊断剂及诊断用试剂盒。
另外，根据前述的方法，直接或间接地决定从被检试样得到的p51变异序列；由此可以发现和野生型p51相同性高的相同物新的p51基因，及与其相关连的基因。
因此，本发明也提供了一种由根据所测定和被检试样中的变异p51DNA的序列所决定，筛选被检试样中的人p51基因相关连的关连基因的方法。
另外，本发明通过序列号1所示的用人p51A基因编码的蛋白质，或者在序列号1里的1个或数个乃至多数个氨基酸缺失，替换或者插入氨基酸序列，或者从这些片段合成蛋白、或者合成对该蛋白的抗体，来进行对野生型p51及/或者变异型p51的测试。另外也可以用序列号4所表示的人p51基因所编码的蛋白质来代替上述人p51A基因所编码的蛋白质。
因此，本发明提供了野生型p51及/或者变异型p51的抗体测试法、抗原测试法。根据该测试方法，可以基于野生型p51蛋白的变化来测试出新生物状态的障碍程序或者恶性肿瘤的程度。所发生的变化，在本领域中，依照前述的惯用技术根据p51序列分析可以决定，但是更好的方法是用抗体(多克隆或单克隆抗体)来检测出p51蛋白的差异及p51蛋白的有无。另外，本发明测定法的具体例，p51抗体是从人的血液·血清采取的生体材料，试样含有液，从其中免疫沉降p51蛋白质，而且在聚丙烯酰胺凝胶的蛋白质，印迹或免疫印迹上可与p51蛋白质反应。p51抗体可以用免疫组织化学的技术检测出石腊或者冻结组织切片中的p51蛋白。抗体产生技术及精制技术在该领域为人所公知。这些技术也可以进行适当地选择。
关于作为检验野生型p51或者其突然变异体的方法，更优选的具体例子包括使用单克隆抗体和/或多克隆抗体的层状法的免疫吸附剂分析(ELISA)、放射线免疫检测法(RIA)、免疫放射线检定法(IRMA)及免疫法(IEMA)。
本发明可以提供相对p51蛋白具有p51结合活性的细胞膜成分或者存在在细胞表面上的p51受体。该p51受体的取得，是在含有细胞膜成分的生体材料试料中，使标识p51蛋白共轭，提出·单离、精制p51结合反应物、通过特定的单离物的氨基酸序列可以达到，该p51受体蛋白的取得及序列决定是本领域的生产者容易作到的。
(10)药剂筛选的应用本发明是将p51受体多肽或其结合片段应用于各种药剂的筛选技术中，可以利用筛选化合物(p51受体反应物化合物一般指低分子化合物、高分子化合物、蛋白质、蛋白质部分片段、抗原、或者抗体)。最好是利用p51受体。在相关筛选试验中使用p51受体多肽或其片段，可在固体支撑体上附着该片段，或者运送在细胞表面的溶液中的游离物。作为药剂筛选的一例，例如可利用表达多肽或其片段的重组多肽稳定地形质转化为原核生物或真核生物宿主细胞，优选的在竞争结合试验中可以利用。使游离或者固定形态的相关细胞应用在标准结合化验中。更具体地说，测定p51受体多肽或其片段和试验的物质间复合体的形成，根据p51受体多肽或其片段和p51多肽或其片段之间形成的复合体经过试验的物质检测阻害的程度，可以筛选化合物。
根据本发明的技术领域应知的方法，可以提供相关物质和p51受体多肽或其片段接触，接着测定该物质和p51受体多肽或该片段之间的复合体存在，或者p51受体多肽或其片段和配位间的复合体的存在为特征的药剂的筛选方法。首先，测定p51受体活性后，相关的物质能够阻害p51受体、判断上述被定义的p51的活性，例如能否调节细胞周期？或者可否诱导编程性细胞死亡。在相关的竞争结合试验中，更具体的，是标识p51受体多肽或其片段。从蛋白质分离，该蛋白质是以蛋白质复合体存在的物质，游离(复合体术形成)标识的量成为对于各个试验因子的p51受体的结合或者p51受体p51多肽结合的阻害的尺度。分析p51多肽的小的肽(肽模拟体)，可以测定具有p51受体阻害活性的物质。
在本发明中，药剂筛选的其它方法是对于p51受体多肽具有适当结合亲和性的化合物的筛选法，简略地说，可以举出在塑料针或者其它的物质的表面如同固体支撑体上合成多数的不同肽试验化合物，接着肽试验化合物与p51受体多肽反应，洗净。然后用现有的方法检测反应结合p51受体多肽的方法(PCT特开号WO84-03564号)。被精制的p51受体直接被复在使用上述的药剂筛选技术的板上。对于多肽使用非-中和抗体、补足抗体，可以在固相上固定p51受体多肽。本发明是以竞争药剂筛选试验的使用作为目的，关于p51受体多肽或其片段的结合性，使可与p51受体多肽特异地结合的中和抗体与试验化合物竞争。根据该抗体的得到的该竞争，p51受体多肽的1或具有该以上的抗原决定部位的任何肽的存在都可以检测。
关于药剂筛选，可举出作为该种方法选择含有非机能性p51基因的宿主真核细胞系或者细胞的使用。在药剂化合物的存在下让宿主细胞系或者细胞在一定期间增殖后，测定该宿主细胞的增殖速度，确认可否调节该化合物例如编程性细胞死亡和细胞周期。作为测定增殖速度1个手段也可以测定p51受体的生物活性。
本发明为了开发出更活性或者稳定形态的p51多肽诱导体，或者例如在活体内提高p51多肽的机能或者妨害药剂，在它们相互作用为目的的生物学中，可以制作出活性的多肽或模拟构造，例如p51激动剂、p51拮抗药、p51阻化剂等。上述构造模拟体，例如通过X线结晶学、计算机模拟试验和这些组合方法可以决定p51和其它的蛋白复合体的三次元构造。再者，关于模拟构造的构造情报，可以根据相同蛋白质的构造为基准的蛋白质的模拟试验得出。
作为由上述得到活性或稳定的形态的p51多肽诱导体的方法，例如，可以根据丙氨酸扫瞄分析。该方法用Ala置换氨基酸残基，测定对于肽的活性的影响的方法，分析肽的各氨基酸残基，决定该肽在活性和稳定性方面的重要领域的方法。该方法可以设计更活性的或者稳定的p51诱导体。
根据机能性化验，分离选择的靶一特异的抗体，接着可以解析该结晶构造。作为原则，根据此研究方法得到构成继续设计药剂的基本药核芯(药物母核)。通过生成在机能性药理学中，对于活性抗体的独特型抗体，从化学或者生物学生成的肽库就可以鉴定或分离肽。故被选择的肽也予测可作为药核芯作用。
可以设计、开发具有被改善的p51活性或者稳定性或者p51活性的抑制剂、激动剂、拮抗药等作用的药剂。
根据克隆化p51序列，取得大量的p51多肽后，可以进行X线结晶学那样的分析研究。进而本发明通过提供由序列号1的氨基酸序列构成的p51蛋白，不仅可用X线结晶学，而且还可以适应计算机模型技术。
本发明通过制成含有人类p51基因的缺痕小鼠(变异小鼠)，可以确认人p51基因序列在身体内哪个部位可否给予多样的p51活性影响，即p51基因产物，并且改变p51基因产物在身体内具有的哪些机能。
该方法是利用基因的相同重组，有意地修饰生物基因情报的技术，可以例举出使用小鼠的胚性干细胞(ES细胞)的方法(Capeccchi，M.r..，Science，244，1288-1292(1989))。
上述变异小鼠的制作方法，作为本领域的技术人员是通常的技术，该改变的技术(野出哲生编、试验医学，增刊，14(20)、(1996)、羊土社)，适应本发明的人野性型p51基因及变异p51基因，容易制作得到变异小鼠。即根据上述技术的应用，可以设计、开发具有作为被改善的p51活性、或者稳定性或者p51活性的抑制剂、激动剂、拮抗药等作用的药剂。
本发明含有以下的方法1.移动p51基因到在肿瘤细胞中，形成抑制肿瘤的方法。
2.移动p51蛋白到在肿瘤细胞中，形成抑制肿瘤的方法、3.含有p51基因或者同效物以及药学中许可的载体的医药组合物。
4.含有p51蛋白或者同效物以及药学中许可的载体的医药组合物。
5.具有有效成分的p51基因或者同效物的基因治疗剂。
6.含有p51基因或者同效物的癌诊断剂。
7.含有p51蛋白或者同效物的癌诊断剂。
8.使用p51基因或者同效物的p51或者p53相关连的基因的筛选方法。
9.使用p51基因或者同效物筛选抑制细胞肿瘤形成的抑制作用物的方法。
10.使用p51基因或者同效物筛选p51基因的诱导以及/或者阻害物质的方法。
11.用上述筛选方法得到的p51基因的诱导以及/或者阻害物质对于p51基因表达异常引起的疾病治疗的利用。
实施本发明的最佳形态以下详细说明本发明的实施例及实验例。但是本发明不受这些实施例以及实验例的限制。实施例1 人p51基因的单离1.人p51基因的克隆以及DNA序列a.本发明者们使用P73-F1有义引物以及P73-R1反义引物进行PCR扩增，接着使用P73-F2有义引物以及P73-R2反义引物进行Nest增幅。
P73-F15′ -TA(CGT)GCA(CGT)AAA(G)ACA(CGT)TGC(T)CC-3′P73-R13′ -TGC(T)GCA(CGT)TGC(T)CCA(CGT)GGA(CGT)A(C)G-5′P73-F25′ -TA(CGT)ATA(CT)A(C)GA(CGT)GTA(CGT)GAA(G)GG-3′P73-R23′ -ATGAAC(T)A(C)GA(CGT)A(C)GA(CGT)CCA(CGT)AT-5′
具体地说，由人骨骼筋聚A+RNA(克隆社制)，使用随机引物以及低聚dT引物合成cDNA，以λZipLox(基布克社制)作为载体构建的约107噬斑组成cDNA文库被扩增，提取DNA。以cDNA0.2μg作为模板，使用上述引物-P73-F1及P73-R1，按照Tag聚合酶(基布克BRL社制)的说明书，在25周期94℃ 30秒、45℃ 30秒，72℃ 30秒地进行扩增，接着该100分之1作为模板，使用上述引物P73-F2及P73-R2，按照同样地反应扩增。
从p53基因的结构得到推测的172bp的带，制作该带的限制性内切酶地图时，判明存在p53基因以外的基因。在PGEM7里(Promega社制)亚克隆该带域、使用ABI377自动序列仪(ABI社制)，按照常法决定碱序列时，尽管类似p53基因的基因，但是来自具有不同的新规碱序列的新规基因的DNA片段。
其它的途径，由其它的脏器(脑等)来的cDNA文库进行同样的解析时，来自类似个别的p53基因的新规基因的DNA片段被检测出来，这是由p73基因产生的。
切出被亚克隆的DNA片段，使用BcaBest labeling kit(宝酒制造)制成标识探针。只是使用低聚dt引物，除此之外与上述cDNA文库同样构建的未扩增的文库2.4×106的噬斑，通过噬斑杂交筛选的结果，得到8个阳性克隆。λZipLox使用Cre-LoxP系、可以容易地变换成质粒，使用LICOR社的自动序列仪和AB1377自动序列仪(ABI社)，按照常法决定变换质粒的碱序列。
对于得到的基因的碱序列和p53基因以及p73基因的碱配列相同性，使用GCG软件(维斯可辛·序列分析包装遗传·计算机·组制)用的FASTA程序(Person，W.R.and Lipman，D.J.，Proc.Natl，Acad，Sci，U.SA.，85，1435-1441(1988))，进行探索。
关于相同性检索的结果发现用上述的方法选择，决定碱基序列的克隆中的2个发现具有p53基因及p73基因的高相同性。用这些具有二个克隆基因的序列编码的氨基酸推定分子量时，分别为50，894Da及约71，900Da。本发明者分别以p51A及p51B命名这些克隆。
上述得到的p51A克隆具有基因(p51A的基因)的整个碱基序列表示在序列号2、p51B克隆具有基因(p51B的基因)的整个碱基序列表示在序列号5。
p51A纯系具有序列号2所示那样的，编码序列号1所示的氨基酸序列(448氨基酸)的碱基序列(1344核苷酸)、作为开放读框具有145-1488位的基因。通过由克隆具有的基因的碱序列，而编码的推定氨基酸序列中，复制活性化领域是1～59位、DNA结合领域是142～321位及低聚化域是359-397位。
p51B克隆如序列号5所示，编码序列号4所示的氨基酸序列(641氨基酸)的碱基序列(1923核苷酸)、作为开放读框具有145-2067位的基因。通过克隆基因具有的碱基序列编码推定氨基酸序列中，复制活性化领域是1～59位、DNA结合领域是142～321位及低聚化域是359-397位，这些是在C末端侧的领域中具有付加的序列(SAM结构域)，把含有该付加的序列353-641位的领域，可以作为广义的低聚化域。
用本发明的p51A基因被脊髓(编码)的氨基酸序列与p53蛋白以及p73β蛋白的氨基酸序列比较，调查了三者件的相同性(图2)。在图中三者间同一的氨基酸，用方框围起来。
在图1中图解地表示p51A蛋白的构造的结构域特征，和p53蛋白以及p73β蛋白。在图中[TA]表示复制活性化领域、DNA binding表示DNA结合领域、oligo表示低聚化域。此外p51蛋白和p73β蛋白的构造特征可从p53蛋白的构造特征推测出。
这些的结果，在全序列、复制活性化领域、DNA结合领域以及低聚化域中，各p51A蛋白、p53蛋白以及p73β蛋白的推定氨基酸序列的相同性，在p51A蛋白及p53蛋白间分别为36％、22％、60％、37％；在p51A蛋白及p73蛋白间蛋白间分别为42％、30％、87％、65％；在p53蛋白及p73蛋白间分别为28％、27％、63％、83％(参阅表1)。
p51A蛋白的448氨基酸残基比p73α蛋白的636氨基酸残基短、但p51A蛋白的全构造的p73的羧基末端部位的割裂部分类似。
从这些结果中，判断p51A蛋白的推定氨基酸序列与p53蛋白及p73β蛋白的任何一种都类似，但是比起p53蛋白的氨基酸序列与p73β蛋白的氨基酸序列相同性高，另外p51A蛋白和p73β蛋白的相同性在低聚化域以外的领域，要比p53蛋白和p73β蛋白的相同性高。进而在p51A蛋白和p73β蛋白间或p53蛋白和p73β蛋白间或p53蛋白和p51A蛋白间即使没有相同性领域，也可看到相同性。从以上所述，可以说p51A蛋白在氨基酸配列水准中，比起p53蛋白p73β蛋白近似。
同样用本发明的p51B基因编码的氨基酸序列与p73α蛋白的氨基酸序列比较，调查了二者间的相同性(图3)。如图所示，二者间相同的氨基酸用方框围起来。
在图4中，表示了用p51(A及B)基因编码的剪接变异体的构造的结构域特征和p73蛋白(α及β)。
p51A蛋白和p51B蛋白的分支点在内含子10开始，而p73α蛋白和p73β蛋白的分支点在内含子13开始。实施例2在正常人组织里p51 mRNA表达的确认(1)Northen印迹分析在正常人组织里p51mRNA的表达根据随机低聚核苷酸剪接法标识的人cDNA克隆作为探针的Northen印迹法评价的。
Northen印迹分析，按照产品使用法，使用人MTN印迹(HumanMultiple No-them blot；克隆社制、帕罗阿尔特、加里弗尼亚、美国)进行实施。
即在实施例1中得到的DNA克隆的PCR扩增产物的EcoRI片段(与600bpcDNA的5’端相当)，用[32p]-dCTP(随机引物DNA标识盒、贝材卡-汉姆社)标识后，作为探针。
另外，印迹是使用ExpressHyb Hybridization Solution(克隆社制)，按照使用说明书中记载的条件进行，使用BAS2000(FUJI)检测出的。
结果如图5及图6所示。
图5是由克隆社购入的过滤器进行Northen杂交，图6是由克隆社购入RNA自己制作过滤器进行Northen杂交的结果。图5各泳道2μg聚A+RNA、图6各泳道附加0.5μg的聚A+RNA后泳动的结果。
图5分别表示各泳道、心脏1、脑2、胎盘3、肺4、肝脏5、骨骼筋6、脾脏7、胰脏8的结果。图6的各泳道表示乳腺1、前列腺2、唾液腺3、胃4、胸腺5、甲状腺6、气管7、子宫8的结果。
该结果，被命名人p51基因的本发明的基因mRNA(4.4kb)的表达，与各处发现的p53mRNA的表达图形对照，莫如是一种限定，在骨骼筋里最高表达，接着是胎盘、气管、乳腺、前列腺、唾液腺、胸腺、子宫、胃、肺、脑以及心脏顺次表达着。在其他组织(例如肾腺、小肠、脊髓、脾)中，没有检出p51 mRNA的表达。
P73基因的表达也是组织限定。虽然p51基因的表达与p73基因的表达是重复的基因(在相同组织被表达)，我们还是知道p51基因比p73基因在更广泛范围被表达。
这样的人p51基因、p53基因及p73基因在组织分布上有差异，尽管这些基因有类似生物活性，但是在生体内按相应的组织也可能有不同的功能。
根据进一步的研究了解到各种人组织中p51mRNA上存在着与p73蛋白相同的、编码p51蛋白短型和编码p51蛋白长型的、选择剪接的形态(可变剪接变异)。编码后者p51B长型的，是与舌的谷氨基酸受体的检索上突然发现的被称为ket具有相同性。骨骼筋中的主要复制物的3kbRNA是调查全组织内观察最多的mRNA。可能短型的cDNA克隆是来自此复制物。有趣的是用正常组织观察的mRNA，相对照地，在很多的肿瘤细胞系中此短型的p51mRNA表达着。
p51蛋白和p73蛋白的可剪接变异体的结构比较表示在图4中，其p51B的mRNA是编码与p73α类似分布量的蛋白质。
对于p51A及p51B两者间功能的区别，目前尚不明。实施例3 p51基因的染色体作图使用放射混合盘(Gene Bridge 4R Radiation Hybrid Panel；ResenrchGenetics社)将p51基因布列在人染色体上。其结果p51基因，存在于标记AFBM327 YD9和WI-1189间(距前者标记，5.66CR)、3q 28-ter。实施例4各种人癌细胞株和人肿瘤中的p51变异对于p51基因最有兴趣的是该p53基因所具有的特征，p51基因是否有、或者该基因的变异和人肿瘤的形成关系。
因此，使用各种肿瘤细胞株，检索p51基因是否有变异。另外，检索的方法，使用以前本发明者决定p51变异时使用的酶母的独立列阵体的功能分析法(FASAY)(1Shioka et al.，Nat.Genet.5，124-129(1933))。
涉及编码人51A基因的全系列的相辅DNA片段，用以前使用的PCR扩增，取得覆盖编码p51A基因全序列的扩增片段的碱基序列，通过直接序列确定法决定此碱基序列，检测有无变异。
肿瘤细胞在5％二氧化碳的条件下，添加10％牛胎儿血清的Dulbecco修饰培养基(Dulbecco’s Modified Essential Media)中培养。p51A cDNA的所有的可以扩增p53cDNA，所以，可以保证细胞株的cDNA质量。
从102的细胞株分析的67株可能是p51ADNA的片段的扩增。其中的35株，可直接用序列确定法确定碱基序列。
可以确认头颈部的癌细胞株的ho-1-u-1(JCRB 0828)和颈部癌细胞株的SKG-Ⅲa(JCRB 0611)二个细胞株中看到变异。
前者是从ser145来的leu的变异，后者是从GIn165来的leu的变异。关于p53蛋白前者是变异型，后者是通过人乳突瘤病毒的感染而失去p53蛋白的正常功能的。另外，来自肿瘤细胞的mRNA存在着各种的剪接变异体。
关于人的原发肿瘤，对用SSCP法及RT-PCR法得到的DNA扩增产物的碱基序列，按照直接碱基序列确定法决定，检索p51A基因变异。在neuroblastoma 8例、colon cancer 8例、breast cancer 8例、lungcancer 8例、brain tumor 8例、esophageal cancer 8例、hepatocellular cancer8例、pancreas cancer 6例、renal cancer 4例的66例的人肿瘤中从肺癌1例检测出从Ala 148向Pro的变异。
这些3例的解析都是cDNAd的解析，从单一的染色对座发现的。实验例1抑制用p51转化的菌落形成
p53蛋白具有嵌入GI期内细胞的、或诱导编程性细胞死亡能力。
本发明的p51蛋白，为了调查抑制菌落的形成能力，在SAOS2的骨肉肿瘤细胞(寄存号ATCC HTB85)中，与嘌呤霉素抗性的表达质粒一起(pBABEpuroMorgenstern J.Nuc.Acids Ru，18，3587，1990)转化p51A表达构建、p51A的HA标识的构建(HA标识-ATGTATCCATA-TGATGTTCCAGATTATGCT酸序列MYPYDVPDYA)、p53表达构建及载体，调查菌落形成能。
表达的载体可以通过克隆以下片段构建即p51A DNA的编码领域片段(2816碱基、序列号2中碱基号1～2810、上述p51A cDNA付与标记的片段及p53 cDNA的编码领域片段(1698碱基、盐基号62～1760)。接着将骨肉肿瘤细胞株的SAOS2细胞在5％二氧化碳的条件下在添加牛胎血清的Dulbecco’s修饰的培养基中培养，将上述SAOS2散布在6cm皿上(1×106细胞/皿)。24小时后用含有p51 cDNA链的野生型p51表达载体(pRC MV/p51A)进行转化。同样地在p51AcDNA上，仅转化成带有HA标记的HA p51A及野生型p53基因以及作为对照物的pRC CWVD表达载体。
使用Mammalian transfection kit(stratagene社)将1μg的pBABEpuro导入细胞。将得到的细胞固定，用结晶生物红进行染色。对于染色的细胞菌落进行照相。各转化分别进行二次，分析这样得到的菌落。
其结果菌落明显地减少，在用p53基因及p51基因转化的细胞培养皿内观察到，与其对称的只是载体构建的细胞培养皿内可以培育很多的菌落，对于这样的p51基因，可以确认其控制形成菌落的能力，但是比p53基因的能力要差。另一方面，附有HA标记的p51基因具有与p53基因相同的菌落控制能力(图7)。实验例2 p51蛋白的复制活性化功能试验对于GI期内细胞的阻止或编程性细胞死亡的诱导的p53蛋白的能力是依存p53蛋白的复制活性化功能，所以对于p51蛋白试验其是否发挥活性。
通过p53复制活性化功能，可调节的WafⅠ启动字和RGC(ribosomalgene cluster)序列下游，按照实施例5的方法与鲁西酶·报导·质粒一起将p51A基因的表达构建体导入，具体的是将SAOS2细胞与上述的鲁西报导质粒和p51A表达载体、p53表达载体或控制载体任何一种一起共转化，对从转化体得到的裂解物测定虫荧光素酶。使用双向虫荧光素酶报导测定系统(普罗木家公司制)算出转换效率。
图8中表示用于实验的报导构建物。在该图中，在各种的p21WAF1起动子的下流调节的3个荧光反射酶基因构建物被表示出来。图中[WAF-1 promoter1uc]、表示残留两个p53调节元件的野生型p21WAF1起动子构建物，[delⅠ]表示一个上流的元件被去除的构建物，及[del 2]表示除去两个元件的构建物，其结果分别表示在图9及图10中。纵轴的Relative activity是使用双向的虫荧光素酶报导测定系统，考虑转化效率换算成的虫荧光素酶活性。
图9、表示图8所示的具有各种的报导构建体的各p51表达质粒(p51A)、p53表达质粒(p53)或载体(Rc/CMV)分别导入到SAOS2细胞中的转化活性。其结果，在p51蛋白中表示了具有与p53蛋白相同的可诱导依存反应性序列数的表达活性。
图10中，使用p53反应性实验地所示的PGC报导构建体，表示用报导该构建体所具有的p51A表达质粒(p51A)、p51A中HA标记的表达质粒(HA p51A)、p53表达质粒(p53)或载体(RcCMV)进行同样的实验结果。其结果如图9所示结果相同，p51A及HA p51A都是具有p53相同的诱导p53反应性序列的数依存的表达活性。使用p51A反应质粒时活性弱，可以推定因为在加有leader sequence下组入表达载体内，其表达量是少的。
而后的实验中，在缺少leader sequence时，p51A蛋白是具有比p53蛋白更强的诱导功能，从上述的菌落形成的抑制能的点上看也具有强烈的活性。
上述的结果教导我们，p51蛋白，通过其复制调节领域可以保存诱导复制的能力。通过该元件中的变异诱导，复制活性消失，所以p51蛋白也利用了与p53蛋白相同的认识序列。
以下这种复制关系可以说是在体内进行的吗？加以确认。将具有HA付加抗原表位的p51A基因的发达构建体，短期导入到SAOS2细胞中。细胞吸取了p51基因后p51存在该核内，这些细胞所有都可以使p21 Waf1的含量上升，这件事教导我们可以诱导由p51蛋白或者p53蛋白所控制的公知的p21 Waf1。实施例3初生肿瘤的p51基因的变异p51的基因变异是以66名患者的初生癌细胞(8名神经芽肿、8名大肠癌、8名乳腺癌、8名肺癌、8名脑肿瘤、8名食道癌、8名肝细胞癌、8名胰腺癌及4名的肾癌)为对象，使用逆转录-PCR一根链结构的多态法(RT-PCR-SSCP)及DNA序列决定法进行调查。
(1)RNA的配制用外科方法摘除新鲜的肿瘤样品后立即冻结，在使用之前保持-80℃。RNA按照中川等的文献记载(Nakagawa，A.，et al.，N.Engl.J.Med.，328，847-854(1993))进行提取。
(2)RT-PCR-SSCP及DNA序列的决定使用Superscript Ⅱ逆转录酶(BRL社制)和随机的引物，将全RNA的5μg复制到cDNA上。为了PCR扩增，使用cDNA的第20个的一个cDNA。PCR-SSCP按增山等方法(Mashiyama S.et al.，Oncogene，6，1313-1318(1991))进行实施。更具体的是对于p51A cDNA用三个引物扩增PCR。
以下表示用于PCR的引物碱基序列p51-F1 5’-AAAGAAAGTTATTACCGATG-3’p51-R1 5’-CGCGTGGTCTGTGTTATAGG-3’p51-F2 5’-CATGGACCAGCAGATTCAGA-3’p51-R2 5’-CATCACCTTGATCTGGATG-3’p51-F3 5’-CCACCTGGACGTATTCCACT-3’p51-R3 5’-TGGCTCATAAGGTACCAG-3’p51-F4 5’-CATGAGCTGAGCCGTGAAT-3’p51-R4 5’-TATCTTCATCCGCCTTCCTG-3’p51-F5 5’-ATGAACCGCCGTCCAATT-3’p51-R5 5’-GTGCTGAGGAAGGTACTGCA-3’p51-F6 5’-TGAAGATCAAAGAGTCCCTG-3’p51-R6 5’-CTAGTGGCTTTGTGCCTTTG-3’接着，用加样缓冲液将32PdCTP中稀释到1∶10。进而在98℃下变性5分钟，在室温下，用200伏，用5％丙三醇和5％的聚丙烯酸凝胶分离12小时到14小时，电泳后胶体干燥，X线膜曝光一晚直到可以具体地看到移动带。为了确定变异的存在和不存在，将PCR产物在pGEM-T(容易型载体)(普罗麦加)中亚客隆使用ABI377DNA用序列器决定序列。
其结果，在高度分化的扁平上皮细胞癌系统的肺癌的组织中，可以看到p51A的推定DNA结合领域是在氨基酸替换点变异(148位的Ala替换Pro)，其肿瘤表示上述气管的淋巴转移和胸膜的浸润。任意的选择5个克隆都是具有相同的变异，这种肿瘤细胞所具有的p51基因教导我们可能属于单一对立性基因或者单一对立基因表达的产物。实施例4 p51 cDNA导入编程细胞死亡的诱导作用p51蛋白与p53蛋白相同地进行诱导细胞的编程性细胞死亡的情况进行检索。
p51蛋白的编程性细胞死亡的试验，与上述本发明的方法相同，也就是在32℃培养细胞株时，按照使用转化小鼠红血病细胞株(1-2-3细胞株)的方法进行(Kato，M.V.，al.，Int.J.Oncol.，9，269(1996))。
此外，小鼠红白血病细胞株(1-2-3细胞株)中、只是发现了[Friendspleen focus forming virus gp55遗传----[Xu et al.，Jpn.J.Cancer Res.86284-29l(1995)；Karo et al.，Int.J.Oncol.9269-277]温度感受性，变异p53蛋白的(Alal 353 Val点变异)的细胞株。该ts-变异p53蛋白用通常的培养温度，即37度保留在细胞质内，p53分子核内是否发挥了所有控制机能，可是在32℃，移到核内诱导p53的活性[Levine，A.J.etal.，Nature 351453-456(1991)]。此细胞株，在32℃时可缓慢地诱导编程性细胞死亡。
在5％CO2条件下，10％添加小牛胎血清RPMI的1640培养基中培养1-2-3细胞。接着以PRC/CMV作为表达载体将p51A基因导入该细胞，在选择培养基下培养根据新霉素耐性选择(Neo)，选择G418耐性细胞，对表达p51A细胞的编程性细胞死亡进行探讨。
即导入用含有p51A基因的表达载体(pRCCMV/p51A)转化的两个p51A导入1-2的细胞(以下称ICI细胞及4BI细胞)，及作为对照的载体，将不含有p51A基因的1-2-3细胞以1×105/ml浓度种植在10cm的直径板上，在37度和32度两个条件下，培养24小时后回收细胞。用ProteinaseK及R NaseA处理该细胞作为DNA样品，将得到的DNA样品，进行琼脂电泳。其溴化乙锭染色像表示在图11中。
从图中可以看出，在37℃培养下，是不能检测1-2-3细胞的DNA片段(泳道Ⅰ)，可是对于导入了p51基因的ICI细胞及4B1细胞，是可以检测出180bp低聚物的DNA片段(泳道2及3)。
在32℃培养下，可以检测出1-2-3的DNA片段的同时(泳道4)，可以促进用ICI细胞及4B1细胞的DNA片段化(泳道5及6)。其结果是与如以下所述的编程性细胞死亡的观察结果及p51导入的细胞繁殖抑制的结果是相一致的。
细胞的编程细胞死亡形态的变化是否存在，通过各将细胞固定在玻璃滑片上用吉姆隆进行染色后用显微镜观察细胞形态及染色程度。此外，细胞的生存数可用锥虫蓝进行染色后，求出细胞生存的计数。
其结果，32℃培养的细胞，在细胞的表面上有突起物，呈现收缩、形变或腰细的形态。另外，吉姆隆染色细胞标本中该核膜的周围或细胞内的某处有染色质凝缩。
另一方面，对于37℃培养的细胞没有观察这种变化。
32℃培养24小时后，由于编程性细胞死亡的细胞和细胞周期继续繁殖的细胞混合在一起，p51表达细胞的24小时后的细胞数是105/ml，1-2-3细胞的细胞数是1.7×105/ml。
从以上可以看出温度32℃处理下的含有p51基因的细胞，在p53共同可以引起急剧的编程性细胞死亡。这种事情也说明p51蛋白与p53蛋白相同具有明显地诱导编程细胞死亡。实施例5作成人p51B蛋白的C末端领域(氨基酸序列的570～641位的领域)的特异抗体，进行人细胞的免疫染色。
即将人p51B DNA的该编码领域(碱基序列1851-206位领域)连接在GST融合蛋白表达载体PGEX-1λT(弗马西亚社)用大肠菌合成融合蛋白。使用融合蛋白按照常规方法，使用BALB/C小鼠配置抗血清(多克隆抗体)，用GST蛋白吸收得到p51B蛋白的C末端领域的特异抗体。
将上述的抗体与人皮肤组织冻结切片进行第一次反应，接着将荧光标记山羊抗小鼠IgG抗体进行第二次反应。
其结果该抗体对人皮肤的棘细胞层到基底层的细胞核特异地进行染色。这种特异性通过上述融合蛋白进行处理，使反应消失，而用GST蛋白处理这种反应是不能消失的。产业上的可利用性本发明的基因是相当于作为肿瘤抑制基因所公知的p53基因相关的基因。用这些基因，可以解析各细胞的表达水平和功能，或通过表达物的解析等，能够解明、诊断、治疗与这些有关的疾病(例如恶性肿瘤等)。
本发明基因与神经系发现的p73对比，可以表达腺组织(前列腺、乳腺)、肌肉组织及胸腺等的免疫系，可能涉及到这些的异常，对于这些控制物质的开发是有贡献的。
按照本发明，提供了作为细胞增殖抑制基因，有用的新p51基因。本发明的新基因具有与编码p53蛋白或p73蛋白基因的类似性。为此，可以利用于解析这些相关基因的功能和这些疾病相关疾病的研究，可以用于对各种疾病的基因诊断及该基因的医药用途的应用研究。另外，通过利用本发明的基因，可以调查各种人组织的该基因表达情况，可以解析人体内的该功能。
另外，通过该基因，可以用遗传工学大量地制造编码该基因的人p51蛋白。即，通过提供本发明的基因将基因及基因片段组入载体，制造重组体人p51蛋白，可以探查p51蛋白活性和p51蛋白的结合活性等的结合功能。
另外，p51蛋白可利用于p51基因及其产物相关联的疾病(例如，细胞的复制活性相关的和细胞编程性死亡的各种疾病，特别是癌)的病态解析、治疗等。
p51蛋白与p53具有同样的生理学作用或功能，例如产生病毒的感染、细胞因子的刺激、低氧状态、核苷酸库的变化、药物异常代谢的各种应激所涉及的组织和、与其他的蛋白质的相互作用的信号传递和其他基因的转录控制等的功能，调节接受生体应激生体组织细胞的DNA的复制，使细胞的周期停止，修复细胞，排除由于编程性细胞死亡的细胞或促进细胞分化，可以防御生体从应激状态下缓解。
按照本发明，可以提供含有人p51基因或其等位体的基因治疗有用的导入基因载体，该p51基因或导入其等位体的细胞及以载体或细胞作为有效成分的基因治疗剂及利用他的治疗方法。
按照本发明可以提供有各种癌细胞的成长抑制作用，使用在由于该作用的各种癌的疾病及病态的处置的以p51蛋白作为有效成分的医药。
人p51基因和小鼠的该基因的功能领域显示了在TA领域的3个氨基酸以外的所有相同，高度的保存性，其重要性(两者的碱基的序列的对比表示在图12～14及图15)。
序列表<110>Ikawa,YojiOtsuka Pharmaceutical Co.Ltd.<120>人p51基因及其基因产物<130>P99-16<140><141><150>JP P1998-100467<151>1998-03-27<160>23<170>patentln Ver. 2.0<210>1<211>448<212>PRT<213>人类<220><221>域<222>(1)..(59)<223>反式激活域<220><221>DNA结合<222>(142)..(321)<223>DNA结合域<220><221>域<222>(353)..(397)<223>低聚化域<400>1Met Ser Gln Ser Thr Gln Thr Asn Glu Phe Leu Ser Pro Glu Val Phe1 5 10 15Gln His Ile Trp Asp Phe Leu Glu Gln Pro Ile Cys Ser Val Gln Pro20 25 30Ile Asp Leu Asn Phe Vat Asp Glu Pro Ser Glu Asp Gly Ala Thr Asn35 40 45Lys Ile Glu Ile Ser Met Asp Cys Ile Arg Met Gln Asp Ser Asp Leu50 55 60Ser Asp Pro Met Trp Pro Gln Tyr Thr Asn Leu Gly Leu Leu Asn Ser65 70 75 80Met Asp Gln Gln Ile Gln Asn Gly Ser Ser Ser Thr Ser Pro Tyr Asn85 90 95Thr Asp His Ala Gln Asn Ser Val Thr Ala Pro Ser Pro Tyr Ala Gln100 105 110Pro Ser Ser Thr Phe Asp Ala Leu Ser Pro Ser Pro Ala Ile Pro Ser115 120 125Asn Thr Asp Tyr Pro Gly Pro His Ser Phe Asp Val Ser Phe Gln Gln130 135 140Ser Ser Thr Ala Lys Ser Ala Thr Trp Thr Tyr Ser 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权利要求
1．编码以下(a)或(b)的蛋白质的基因，(a)具有序列号1所示的氨基酸序列的蛋白质，(b)具有序列号1的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、替换或插入的氨基酸序列，而且具有p51活性的蛋白质，
2．具有以下(a)或(b)的DNA的基因，(a)序列号2表示的碱基序列中，由碱基号145～1488所示的碱基序列构成的DNA，(b)序列号2表示的碱基序列中，由碱基号145～1488的碱基序列构成的DNA，而且能与编码p51活性蛋白质的DNA在严谨条件下杂交。
3．权利要求2所述的基因，其具有序列号2所表示的碱基序列。
4．具有以下(a)或(b)的DNA的cDNA，(a)序列号2表示的碱基序列中，由碱基号145～1488所示的碱基序列构成的DNA，(b)序列号2表示的碱基序列中，由碱基号145～1488的碱基序列构成的DNA杂交，而且能与编码p51活性蛋白质的DNA在严谨条件下杂交。
5．一种DNA，其特征是在严谨的条件下能与具有序列号2表示的碱基序列杂交。
6．一种DNA，其特征是在严谨的条件下能与具有碱基号145～1488所示的碱基序列进行杂交。
7．权利要求5所述的DNA，其特征是作为引物被使用。
8．权利要求5所述的DNA，其特征是作为探针被使用。
9．(a)或(b)表示的蛋白质，(a)具有序列号1表示的氨基酸序列的蛋白质，(b)具有序列号1表示的氨基酸中缺失、替换或插入1个或多个氨基酸的氨基酸序列，而且具有p51活性的蛋白质。
10．权利要求9所述的蛋白质，其所具有的氨基酸序列至少是以氨基酸号1～59、氨基酸号142～321及氨基酸号359～397表示的。
11．具有序列号1所示氨基酸序列的多肽，该多肽至少具有一种从复制活性功能、DNA结合功能及低聚化功能选择出的功能。
12．具有以下(a)或(b)的多肽(a)在序列号1中，具有从氨基酸号1～59表示的氨基酸序列的多肽，(b)具有在(a)中表示的氨基酸序列中缺失、替换或插入1个或多个氨基酸的氨基酸序列，而且具有复制功能的多肽。
13．具有以下(a)或(b)的多肽(a)在序列号1中，具有以氨基酸号142～321表示的氨基酸序列的多肽，(b)具有在(a)中表示的氨基酸序列中缺失、替换或插入1个或多个氨基酸的氨基酸序列，而且具有复制功能的多肽。
14．具有以下(a)或(b)的多肽(a)在序列号1中，具有以氨基酸号359～397表示的氨基酸序列的多肽，(b)具有在(a)中表示的氨基酸中具有缺失、替换或插入1个或多个氨基酸的氨基酸序列，而且具有低聚化功能的多肽。
15．一种基因，其编码权利要求12～13任何一项所述的多肽。
16．一种载体，其含有权利要求1的基因。
17．一种宿主细胞，其是用权利要求16所述的载体转化的。
18．权利要求10所述的蛋白质的制造方法，其特征是在培养基中培养权利要求17所述的宿主细胞，再从得到的培养物中回收蛋白质。
全文摘要
本发明的目的是提供包含有作为细胞繁殖基因所公知的p53基因所关联的家族基因、新的人基因及其基因产物。本发明是以编码序列号1所示的氨基酸序列为特征的人p51基因,在序列号2中具有表示碱基序列号145—1488的人p51基因、具有该基因的载体,用该载体转化的宿主细胞、培养该宿主细胞,从得到的培养物回收具有序列号1所示的氨基酸序列p51蛋白的制造方法及序列号1所示的氨基酸序列p51蛋白。
文档编号A61K48/00GK1295615SQ99804565
公开日2001年5月16日 申请日期1999年3月24日 优先权日1998年3月27日
发明者井川洋二, 井川俊太郎, 带刀益夫 申请人:大塚制药株式会社, 井川洋二