arpe and Dohme)以 疏基化学方法，用纯化的奈瑟氏脑膜炎B群菌株（Neisseria meningitidis groups B)细菌 表面蛋白复合物（outer membrane protein complex，0MP)作为蛋白载体，合成出流行性嗜 血杆菌b型多糖-细菌表面蛋白复合物（PRP-OMP)结合疫苗。运用这些合成技术，先后开 发出了三种现已广泛用于临床接种的流行性嗜血杆菌b型结合疫苗，即PRP-TT、PRP-HbOC 和PRP-OMP。Hib结合疫苗的成功为开发其它细菌结合疫苗提供了理论和技术基础，随后的 开发进入了技术更为复杂的多价结合疫苗阶段，其原因是某些传染病，如肺炎球菌导致的 肺炎、流行性脑膜炎球菌所致的脑膜炎等，可由多种不同的血清型或菌株感染所致，并且各 血清型或菌株间由于细菌表面多糖的化学结构的不同，其抗体没有交叉免疫反应，因此，接 种单一的血清型或菌株结合疫苗，无法保护被接种人体免于其它血清型或菌株的感染。由 于这个原因，合成和配制多价结合疫苗来扩大疫苗的保护覆盖率成为开发的主要目标。 [0015] 通过多年的努力，用结合技术开发出了多种覆盖率广的多价结合疫苗。细菌荚膜 多糖-蛋白结合疫苗最早出现在20世纪30年代，Goebel和Avery将3型肺炎球菌多糖连 接到马血清球蛋白上，产生的偶联物能在动物身上产生多糖专一的抗体，同时提供相应的 免疫保护。1987年，世界上第一个多糖蛋白结合疫苗，B型流感嗜血杆菌（HiB)多糖-破伤 风类毒素（TT)结合疫苗被美国FDA批准进入市场。默克公司、辉瑞公司和诺华公司相继开 发了 HiB多糖-破伤风类毒素结合疫苗和流行性脑膜炎多糖-破伤风类毒素结合疫苗，并 成功上市。2000年，美国惠氏（Wyeth)公司成功开发并上市了 7价肺炎球菌多糖-CRM197 结合疫苗，是由7个不同的肺炎球菌血清型多糖分别共价键连接到CRM197蛋白载体上，混 合配制而成的一种多价疫苗，用以预防小儿肺炎，所述7个血清型肺炎球菌涵盖了北美和 欧洲90%以上流行的肺炎球菌不同血清型菌株。2006年，Sanofi Pasteur开发出了 4价 脑膜炎球菌多糖-破伤风类毒素结合疫苗，用于预防4种流行性脑膜炎球菌群，即A，C，Y， W135,所致的脑膜炎。2009年，GlaxoSmithKline(GSK)也开发出了一种10价肺炎球菌多 糖-蛋白质结合疫苗，用以预防10种肺炎球菌血清型所导致的肺炎。所述疫苗运用了三种 蛋白质作为蛋白载体，其中最主要的载体是蛋白-D(Protein D，H))，有8个血清型多糖是 用这个蛋白作为载体。蛋白-D是用非可分型的流行性嗜血杆菌的基因重组方法表达出来 的无酯化表面蛋白，能够刺激机体产生保护性抗体，有潜在的预防非可分型的流行性嗜血 杆菌感染所致的急性中耳炎，其他还有破伤风类毒素和白喉内毒素作为作为载体，被分别 用作血清型18C和19F的结合疫苗的蛋白载体。从以上结合疫苗产品的设计，可以看出，结 合疫苗的开发从单价疫苗过渡到技术上更为复杂的多价疫苗，提高了细菌疫苗的覆盖率。
[0016] 多糖蛋白缀合疫苗（结合疫苗）是目前最先进的疫苗技术，在特异抗原上加上蛋 白质载体，可增加其免疫原性。蛋白质载体具有T细胞依赖特性，多糖蛋白缀合疫苗可将非 T细胞依赖性质的多糖抗原转变为T细胞依赖性质的抗原，激发机体的T辅助细胞产生一 系列的免疫增强效应。荚膜多糖结合疫苗，在多糖上加蛋白载体，由非T细胞依赖性抗原变 为T细胞依赖性抗原，增加其免疫原性。结合疫苗接种后产生的抗体在质量和数量上是一 代疫苗的400-1000倍，产生免疫保护更广更强，保护时间更长久，达到高效保护。2000年， 美国辉瑞公司第一个7价肺炎球菌结合疫苗上市；美国辉瑞公司开发婴幼儿更有针对性的 7(4、68、听、14、18(：、19?和23?)价肺炎球菌蛋白疫苗，对5岁以下儿童也有效。荚膜多糖蛋 白结合疫苗，在多糖上加蛋白载体，由非T细胞依赖性抗原变为T细胞依赖性抗原，可增加 其免疫原性，可用于6周龄以上的儿童。目前辉瑞公司正在中国注册13价结合疫苗，增加 了 6个血清型（1，3,5,7F，6A，19A)。但是我国的资料显示肺炎球菌感染菌株血清型依次为： 5、6、1、19、23、14、2、4,辉瑞7价肺炎球菌结合疫苗对我国常见致病菌型覆盖率只有50%左 右，而13价结合疫苗的覆盖率也仅有70%。惠氏7价肺炎球菌结合疫苗需要接种4针剂， 每针860元，价格昂贵，不利于推广。13价疫苗估计其价格将更为昂贵。因此美国辉瑞公司 的7和13价结合疫苗不太适合我国大范围的儿童肺炎预防。
[0017] 尽管13价肺炎球菌结合疫苗已经上市，但是其中有几个血清型的免疫效果相对 其他血清型较低，如3型。且随着不同血清型的增加和同种载体蛋白的重复使用，使得载体 蛋白用量增多，其免疫原性反而降低。GlaxoSmithKline在开发10价肺炎球菌多糖结合疫 苗的设计中，选择了蛋白-D为载体，其原因是基于二个方面的考虑。其一，是为了避免重复 使用已经作为百白破疫苗组分的破伤风类毒素和白喉类毒素作为载体。临床试验表明，当 多价肺炎结合疫苗与其他含有与蛋白载体相同组分的单价疫苗或多联疫苗同时接种时，比 如Hib-TT、百白破-Hib多糖结合疫苗-IPV(灭活脊髓灰质炎疫苗）-乙肝疫苗（简称6联 疫苗），多价肺炎球菌结合疫苗中的大部分血清型多糖的免疫原性会受到抑制，特别是对用 破伤风类毒素作为载体的血清型多糖免疫原性影响尤其明显。原因是多价肺炎球菌结合疫 苗中作为载体的破伤风类毒素和白喉类毒素总浓度过高，在同时接种含有百白破组分的联 合疫苗时，如6联疫苗，会造成所谓载体受体竞争性抑制效应，降低了结合疫苗多糖部分的 免疫原性。Sanof iPasteur的11价肺炎球菌多糖-TT和DT混合载体蛋白结合疫苗和Merck 的7价肺炎球菌多糖-OMP结合疫苗（PCV-OMP)，都是临床试验结果不佳而导致产品开发失 败的例子，原因就在与此。其二，是赋予蛋白载体以真正的保护性免疫原性功能。临床试验 证明蛋白-D能够刺激机体产生保护性抗体，有潜在的预防非可分型流行性嗜血杆菌感染 造成的急性中耳炎。GlaxoSmithKline的10价肺炎球菌多糖结合疫苗选择蛋白-D作为载 体，使得蛋白载体产生的抗体具有临床意义的保护作用，是结合疫苗技术开发过程上的一 大进步。
[0018] 不过，非可分型的流行性嗜血杆菌实际临床意义受到所述类细菌感染率低下的限 制，其感染导致的急性中耳炎发病率较低。但这些结合疫苗有一个共同点缺点，就是蛋白 载体没有赋予免疫原性的保护功能，也就是说，尽管结合疫苗载体能够刺激机体产生抗体， 但是，疫苗的设计者并没有利用其抗体具有的保护性来预防传染病，同时，也没有确定其产 生的抗体是否达到保护性滴度水平。破伤风类毒素、白喉类毒素和白喉无毒变异株毒素等 传统蛋白被选择作为载体的主要原因，并不是因为它们的产生的抗体具有保护性，而是从 其安全性和能够增强结合物中多糖的免疫原性来考虑。显而易见，破伤风类毒素和白喉类 毒素已经是百白破三联疫苗的二个组分，被常规接种；所以，结合疫苗中的破伤风类毒素和 白喉类毒素载体是否能够刺激机体产生达到保护性抗体滴度并不重要，相反的，结合疫苗 中的多糖部分的抗体滴度才是疫苗设计者需要关注的主要问题。另外，一些正在开发中的 结合疫苗产品所用的载体，如E. coli所表达的基因缺失突变脱毒的重组铜绿假单胞菌外 毒素 A(rEPA)，E. coli所表达的基因缺失突变脱毒的重组霍乱毒素等也都是基于相同的考 量。
[0019] 新多糖结合疫苗的种类和型别在逐年增加，而可供选择的载体蛋白种类较少，不 同疫苗重复使用载体蛋白较多。接种相同载体蛋白的不同结合疫苗可能会产生免疫抑制效 应，导致不同疫苗之间免疫效果的相互影响。而且，多糖结合物的主要载体蛋白如TT等，其 本身作为疫苗已大范围接种婴幼儿，人群体内原有的针对载体蛋白的高滴度特异性抗体可 能会抑制机体对结合疫苗中多糖的特异性免疫反应。
[0020] 中国专利（ZL02159032.X)公开了一种多糖-蛋白结合疫苗的制备方法，也是目前 制备多糖结合疫苗最常使用的技术之一。在所述技术中，以己二酸二酰肼（ADH)作为连接 剂结合多糖与蛋白。这种结合方式首先需要将多糖经溴化氰活化，即在碱性条件下用溴化 氰作用于多糖分子上的羟基，形成氰酸酯，然后与ADH反应；氰酸酯中的一个碳氧键断裂， 与ADH-端的氨基发生加成反应，从而将酯酰肼（AH)基团导入多糖分子，形成多糖-AH衍 生物；多糖-AH衍生物在碳二亚胺（EDAC)的介导下与载体蛋白形成稳定的结合物。这样的 结合方式可减少多糖与载体蛋白结合的空间位阻，保留了多糖的抗原表位，同时避免了多 糖本身的溶解性，减少多糖与抗血清反应的副作用。
[0021] 然而，上述传统的多糖-蛋白结合技术存在着以下不足之处：⑴多糖-AH衍生物 会继续与溴化氰活化的多糖反应，形成多糖的自身聚合物，降低了多糖-蛋白的结合效率； (2)EDAC在介导ADH衍化多糖与载体蛋白结合的同时，容易引起多糖与载体蛋白的自身交 联，从而降低多糖-蛋白的结合效率；(3)多糖和载体蛋白均为大型生物分子，中间靠仅有 6个碳原子长度的ADH相连，多糖和蛋白质的结构势必会相互影响，使得多糖的一些重要抗 原表位易被蛋白质所屏蔽，进而降低多糖的免疫原性。因此，多糖-蛋白结合疫苗的免疫原 性和抗体持效性仍有待进一步提高，如多糖结合疫苗需要免疫三次才能产生免疫效果。这 些不足之处限制了多糖结合疫苗的进一步发展。
[0022] 四、人轮状病毒的危害及其流行病学研宄
[0023] 在世界范围内，轮状病毒（Rotavirus)是导致儿童严重性腹泻的主要病原体，在 发达国家，因急性腹泻住院的儿童中，轮状病毒的检出率占35?52%。在美国，估计每年 有3百万儿童患轮状病毒腹泻，致使82000人住院治疗，150人死亡。在发展中国家，轮状 病毒也是导致2岁以下婴幼儿严重胃肠炎最常见的病原体，估计每年有超过1. 25亿5岁以 下的儿童患轮状病毒性腹泻，其中一千八百万儿童患中度腹泻，87万死亡。在中国，儿童出 生率约一千七百万，估计每年大约有35万儿童由于患轮状病毒腹泻导致死亡，排世界第二 位。由于所述病毒的感染对2岁以下婴幼儿腹泻的发病率和致死率的增加有显著作用，开 发预防轮状病毒感染，有效且安全的疫苗是当务之急。
[0024] 轮状病毒属呼肠孤病毒科（Reoviridae genus)，是导致人类和众多动物腹泻的病 原体。全病毒直径70nm，具有特殊的三壳结构，最里层的核壳结构为核壳蛋白，包裹有病毒 基因。病毒的基因由双股RNA的11个分段式片段组成，为6个结构蛋白和5个非结构蛋白 编码。核壳蛋白是由VP1，VP2和VP3三个病毒蛋白构成；中间壳蛋白为VP6,外壳蛋白是由 VP4和VP7组成。由于轮状病毒的基因是双股的RNA，多片段结构，这种结构的基因可以进 行基因间的某种程度的重新组合，即轮状病毒基因的重配（reassortment)。当二个或者多 个病毒同时感染一个宿主细胞后，在新病毒颗粒的包装阶段，各个病毒的基因片段将在细 胞内重新组合，造成重配基因发生。轮状病毒这种重配基因的能力导致了人体对其免疫反 应的多样性，也增加了制作特异性轮状病毒疫苗的难度。
[0025] 轮状病毒根据病毒抗原性的不同可分成不同的型，亚型和血清型。现已发现有7 个血清型（A型?G型），大多数人类病原体属于A、B和C型。流行病学调查发现致使人类 和动物患病的轮状病毒中以A型最常见，是疫苗开发的主要目标。A型轮状病毒根据其VP6 抗原特性的不同，进一步分类为亚型，绝大部分病毒株属于亚型I或II中的一种。不同的 轮状病毒表面壳蛋白VP7和VP4的中和抗原簇有所不同，能够独立地诱导各自的中和性抗 体，病毒的血清型可由VP4和VP7抗原的特异性决定。A型轮状病毒根据VP7和VP4的不同 可进一步分类成G血清型和P血清型。由于轮状病毒基因是由11个片段组成，VP7和VP4 的编码基因能够独立分离组合，产生了一种二进制方式进行的基因重配。VP7是一种糖蛋白 (glycoprotein)，因其抗原特性分为15种不同的G血清型，与其特异性的核酸序列，即基因 型（genotype)相对应；也就是说，每一 G血清型都有其特异的基因型，因此，通常G血清型 和G基因型可通用。全球鉴定出的人类致病轮状病毒株中，