酸 盐缓冲液，2111代&，？!18.0)悬浮包涵体，在室温下孵育30分钟，以10,00(^离心10分钟，收 集包涵体。重复以上步骤三次除去污染的杂蛋白。
[0133] 2)将包涵体沉淀溶于溶解缓冲液（IOmMTris-HCl，IOOmM磷酸盐缓冲液，8M尿素， pH8. 0)中，在冰上搅拌孵育1小时。以16, OOOg离心30分钟，收集上清液，丢弃不溶沉淀 物。
[0134] 3)用固定金属离子亲和层析色谱法（IMAC)纯化His-tagged重组VP8蛋白。
[0135] 4)收集含有VP8的洗脱液，转入透析袋中在含有20mMi3 -巯基乙醇1和8M尿素的 TBS(pH4.0)中透析，并逐渐降低尿素的浓度（即8,6,4,2,和1Μ)，在4°C中透析过夜。然 后在含有2mMf3 -巯基乙醇的TBSpH5. 5溶液中透析两次，最后在TBS溶液中透析。根据重 组VP8蛋白来源的毒株不同，来进行最后透析。
[0136] 四、肺炎球菌表面蛋白A(rPspA)的制备
[0137] 将PspA蛋白克隆至大肠杆菌进行表达并分离纯化，具体包括：
[0138] 1.目的基因的优化和重组表达质粒的构建
[0139] 在GenBank中获取PspA基因序列（GI :193804931)并进行优化，加上His标签后 进行全基因合成，将合成的序列经Sac I和Nde I双酶切后，定向克隆至同样双酶切的表达 载体pET-30a (+)中，转化感受态大肠杆菌BL21Star (DE3)，37°C过夜培养，挑取阳性单克隆 菌落，扩增培养后提取质粒，用Nde I和Sac I双酶切鉴定，并送测序，将测序正确的重组表 达质粒命名为pET-30a-rPspA。
[0140] 2.重组蛋白的诱导表达及纯化
[0141] 复苏工程菌，以I :100的比例接种2XLB培养基，在37°C，237r/min下扩大培 养，当菌体值约为12时，加入IPTG至终浓度为lmmol/L，37°C诱导4h，取样进行SDS-PAGE 分析离心收集诱导菌体，加入生理盐水重悬洗涤2次，以l:10(g/mL)的比例加入05mol/ LNaC15mmol/L咪挫20mmol/LPB(pH7. 4)的缓冲液重悬菌体，超声波破碎菌体，8000Xg离 心40min，收集上清，于镍离子层析柱中进行纯化，按说明书操作纯化产物的及分析将载体 pET-30a(+)转化的大肠杆菌BL21Star(DE3)全菌体（对照）和将上步纯化样品经SDS-PAGE 分离后电转移至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉摇床轻微振荡封闭2h ;加入His鼠源单抗 (1 : 800稀释），4°C过夜；TBST清洗3次，加入HRP标记的羊抗鼠 IgG(l : 2000稀释），室 温孵育Ih ;洗涤3次，DAB显色。
[0142] 五、轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗的制备
[0143] 1.多糖-磁性纳米微球偶联
[0144] 0,1MTBS溶液缓冲液下，pH6. 0加入上述步骤制得的任一或多种荚膜多糖和磁性 纳米微球，本实施例中采用13价荚膜多糖（1、3、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F)， 荚膜多糖与磁性纳米微球的质量比为1: (〇. 5-1)，于室温下反应6-24小时；其中优化的质 量比为1: 1，于室温下缩醛反应16小时。反应结束后，用透析袋充分透析，除去未反应磁性 纳米微球。
[0145] 2.偶联体改性
[0146] 取步骤1多糖-磁性纳米微球偶联体30mL，搅拌条件下缓慢滴加2mL25 %戊二酸， 200r/min搅拌反应6小时；反应完毕后，用0,01MPBS洗涤三次后，定容至30mL，显微镜下观 察磁性纳米微球改性情况，使得多糖-磁性纳米微球偶联体表面未与多糖反应的-OH改性 为-CHO ;N2、4°C保存备用。
[0147] 3.与PspA载体蛋白和轮状病毒蛋白共偶联
[0148] 0,1MTBS溶液缓冲液下，4°C、pH4. 0-9. 0下，将改性后的多糖-磁性纳米微球分别 与轮状病毒蛋白和PspA蛋白共反应24小时（为保证足量的载体蛋白与磁性纳米微球，采 用过量纳米载体蛋白加入量，如质量比采用多糖：磁性纳米微球：PspA :轮状病毒蛋白=1 : 1 ：2 ：2) 〇
[0149] 4.轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗的分离纯化
[0150] 用Superdex200凝胶过滤柱（2. 6cmX60cm)进行分离纯化，洗脱液为20mM的磷酸 缓冲液（PH7. 4)，流速为3mL/min。收集对应于多糖-磁性纳米微球-双载体蛋白的洗脱峰。
[0151] 制得的轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗的组成分析
[0152] 用1H-NMR进行检测所述轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗，检测结果见图1。如图1所 示，与荚膜多糖分子相比，缀合物在〇. 4-1. 4ppm处出现了特征峰，对应于载体蛋白的脂肪 链氨基酸残基。在7. 2ppm处出现了对应于载体蛋白的芳香族氨基酸残基的特征峰。这表 明荚膜多糖分子成功地偶联了轮状病毒蛋白和PspA载体蛋白两种载体蛋白。在6. 2ppm处 出现了对应于琥珀酰亚胺的特征峰，这表明多糖结合疫苗的连接桥中含有琥珀酰亚胺。此 夕卜，5. 2、I. 6、3. 6出线了 PELA的特征峰证明磁性纳米微球PELA作为连接物。因此，荚膜多 糖在结合两种载体蛋白前后，其结构未发生明显改变。
[0153] 通过CL-4B即SEC-MALLS方法检测多糖蛋白缀合物的分子量分布情况；通过免疫 双扩的方法使用不同的抗体血清确定多糖蛋白缀合物中的蛋白和多糖种类；通过蒽酮法检 测多糖蛋白缀合物的多糖含量；Lowry法蛋白含量检测多糖蛋白缀合物的总蛋白含量，再 通过计算得到缀合物的多糖蛋白结合比（Ratio);轮状病毒蛋白、PspA蛋白浓度通过酶联 免疫法检测。结果表明：在所述轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗原液中，各物质的浓度比约 为：多糖：磁性纳米微球：PspA :轮状病毒蛋白=1 :1 :1 :1)。
[0154] 对比例1
[0155] 本对比例与实施例1的区别仅在于：制得的疫苗中无磁性纳米微粒作为连接体， 而且通过现有技术中提及的方法将双载体蛋白与多糖缀合而得。
[0156] 对比例2
[0157] 本对比例与实施例1的区别仅在于：制得的疫苗中无 PspA载体蛋白，仅采用多 糖-磁性纳米微粒-轮状病毒载体蛋白为轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗。
[0158] 实施例2
[0159] 本实施例与实施例1的区别仅在于：所述轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗的载体蛋 白为轮状病毒载体蛋白和破伤风类毒素载体蛋白。
[0160] 制得的轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗的组成分析结果与实施例1所得结果存在理 论误差范围内的一致性。
[0161] 实施例3
[0162] 本实施例与实施例1的区别仅在于：所述轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗的载体蛋 白为轮状病毒载体蛋白和嗜血流感杆菌表面蛋白HiD。
[0163] 制得的轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗的组成分析结果与实施例1所得结果存在理 论误差范围内的一致性。
[0164] 实施例4
[0165] 本实施例与实施例1的区别仅在于：连接体为PLGA磁性纳米颗粒。
[0166] 制得的轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗的组成分析结果与实施例1所得结果存在理 论误差范围内的一致性。
[0167] 实施例5
[0168] 本实施例与实施例1的区别仅在于：连接体为PEG磁性纳米颗粒。
[0169] 制得的轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗的组成分析结果与实施例1所得结果存在理 论误差范围内的一致性。
[0170] 疫苗评价
[0171] 以下采用免疫原性等疫苗常规效价的评估实验评估实施例1?7及对比例1?2 所得疫苗的免疫效果：
[0172] A.轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗免疫原性实验
[0173] 选取100只5周龄的雌性Blab/C小鼠，体重为15-22克。随机分为10组，即实施 例1?7、对比例1?2和阳性对照组（Prevnar 13)，每组10只小鼠。腹腔注射，每只每次 注射为5微克，每周注射1次，共注射3次。21天后眼眶取血。用ELISA法检测小鼠血浆中 抗荚膜多糖的IgG、IgGl和IgG2a。实验结果见表1
[0174] 表 1
[0175]
【主权项】
1. 轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于：所述轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗为 多价肺炎球菌多糖与两种或两种以上的载体蛋白经连接体而成的轮状病毒多糖-蛋白结 合疫苗，其中，连接体为磁性纳米微球，两种或两种以上载体蛋白中的其一为轮状病毒蛋 白。
2. 根据权利要求1所述的轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于：所述磁性纳米 微的磁性微粒位于纳米微球的内部为核，高分子材料包裹于磁性微粒的外部。
3. 根据权利要求2所述的轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于：高分子材料为 生物高分子材料，选自壳聚糖、聚乙二醇、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA)、聚乳酸-聚乙二 醇共聚物（PELA)中的一种或以上的混合物。
4. 根据权利要求1所述的轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于：多价肺炎球菌 多糖与两种载体蛋白的质量比为（0. 5?2) :1。
5. 根据权利要求1所述的轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于：两种或两种 以上载体蛋白中的另一载体蛋白选自白喉类毒素，破伤风类毒素，载体蛋白CRM197,嗜血 流感杆菌表面蛋白HiD，百日咳Prn表面蛋白，百日咳Fha抗原和/或肺炎球菌表面蛋白 A (rPspA)〇
6. 根据权利要求1所述的轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于：轮状病毒蛋白 为重组人轮状病毒蛋白。
7. 根据权利要求1所述的轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于：重组人轮状病 毒蛋白为P基因型轮状病毒蛋白的部分氨基酸序列或全序列。
8. 根据权利要求1所述的轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于：重组人轮状病 毒蛋白的病毒株为P基因型轮状病毒毒株P[8]、P[4]、P[6]或P[ll]中的一种。
9. 权利要求1?8任一所述轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗的制备方法，其特征在于： 将多价肺炎球菌多糖与两种或以上的载体蛋白分别与纳米微球经偶联而成。
10. 根据权利要求9所述的轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗的制备方法，其特征在于，具 体包括以下步骤： a) 分别分离提纯多种血清型肺炎球菌荚膜上的荚膜多糖； b) 分别制备并分离提纯所选用的轮状病毒载体蛋白和另一载体蛋白； c) 分别将各种荚膜多糖与纳米微球偶联成多糖-纳米微球偶联体； d) 再将多糖-纳米微球偶联体分别与轮状病毒载体蛋白和另一载体蛋白偶联结合； e) 分离纯化步骤d)所得偶联体成该轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗原液。
【专利摘要】本发明公开了轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗，其为多价肺炎球菌多糖与两种或两种以上的载体蛋白经连接体而成的缀合疫苗，其中，连接体为磁性纳米微球，载体蛋白之一为轮状病毒蛋白。该轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗的制备方法将多价肺炎球菌多糖与两种或以上的载体蛋白(其一为轮状病毒载体蛋白)分别与磁性纳米微球经偶联而成。本发明提供的轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗制备工艺简单，采用纳米微球为连接物的轮状病毒多糖-蛋白结合疫苗能够增强小鼠Th1型免疫应答，以及多糖特异性抗体的免疫持效性、特异性和亲和性，此外还可诱导小鼠产生轮状病毒抗体；具备两种疫苗的预防效果；因此具有十分广阔的应用前景。
【IPC分类】A61K39-116, A61K39-15, A61P31-04, A61K47-48, A61P31-14, A61K39-385
【公开号】CN104606674
【申请号】CN201410487401
【发明人】刘昊智, 王文灏, 程超, 吴克
【申请人】武汉博沃生物科技有限公司
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2014年9月23日