方法可可参照现有技术中Fe3O 4 磁性纳米微球的方法制备，具体可参见下述【具体实施方式】，并不作为本发明是否可实现的 关键因素。
[0078] 作为更进一步优选方案，步骤a中多糖的分离纯化工艺可根据所需的多糖及蛋白 种类根据现有技术进行操作。
[0079] 作为更进一步优选方案，步骤b中的蛋白的制备及分离纯化工艺可根据所需的多 糖及蛋白种类根据现有技术进行操作。
[0080] 作为更进一步优选方案，步骤C的具体操作为：在偶联介质反应缓冲液中，室温 下、pH4. 0-9. 0下，将步骤a所得多糖与磁性纳米微球共反应6-24小时得多糖-磁性纳米 微球偶联体，再通过25%戊二醛对其进行进一步改性，使得多糖-磁性纳米微球偶联体表 面未与多糖反应的-OH改性为-CHO ;其中偶联介质优选为PB、PBS或TBS，最佳为0,1M TBS 溶液；反应缓冲液的最佳pH为6 ;最佳反应时间为12-16小时。
[0081] 作为更进一步优选方案，步骤d的具体操作为：在偶联介质反应缓冲液中，4°C、 pH4. 0-9. 0下，将步骤c所得经化学改性的多糖-磁性纳米微球偶联体与载体蛋白共反应 12-24小时；其中偶联介质优选为PB、PBS或TBS，最佳为0,1M TBS溶液；反应缓冲液的最 佳pH为6 ;最佳反应时间为24小时。
[0082] 作为更进一步优选方案，步骤e的分离纯化是将偶联结合物和未反应的多糖和 载体蛋白分离纯化，纯化方法可用层析法或超滤法；可根据获得的缀合疫苗的分子大小进 行分离纯化，层析法优选采用Superdex200凝胶过滤柱、Sepharose CL-4B或Sepharose CL-6B进行；而超滤法是采用不同滞留分子量膜来分离结合物和未反应物。
[0083] 所述缀合疫苗制剂可采用水剂或冻干剂。为了增强其免疫原性，可加入佐剂，常用 的佐剂有铝佐剂，如氢氧化铝、磷酸铝，本发明优先选择磷酸铝。结合物的溶剂可为〇. 2氯 化钠溶液、IXPBS缓冲液或其它能够稳定多糖或者结合物的缓冲液。本发明的缀合疫苗各 制剂的制备方法采用本技术领域的常规手段制备。其中，优选在糖（例如蔗糖或乳糖）存 在下进行冻干。
[0084] 本发明提供的缀合疫苗可以以任何已有的途径进行免疫，包括真皮层或皮肤给 药、肌肉给药等形式。其中，所给予的量是本领域技术人员根据常识可以确定的。
[0085] 术语定义
[0086] 核VP8 :是轮状病毒蛋白VP8中的一段具有和细胞表面含有唾液酸（sialic acid) 粘合功能的多肽链，通常含有160氨基酸残基。
[0087] VP8多肽链片段：为任何分子量低于全长VP8的多肽链。
[0088] VP4多肽链片段：为任何分子量低于全长VP4的多肽链。
[0089] VP8特异性抗原簇链：全VP8多肽链含有多个抗原决定簇，通过基因重组的方法剪 切去不含重要的氨基酸，而保留含有特异性抗原簇的多肽链，分子量通常小于全长VP8多 肽链。
[0090] VP4特异性抗原簇链：全VP4多肽链含有多个抗原决定簇，通过基因重组的方法剪 切去不含重要的氨基酸，而保留含有特异性抗原簇的多肽链，分子量通常小于全长VP4多 肽链。
[0091] VP8融合蛋白：用基因重组方法，将VP8蛋白和其它可溶性蛋白多肽链融合表达， 以提高VP8在水溶液中的可溶性；或增强VP8的免疫原性。
[0092] NSP4蛋白：是非结构性蛋白，具有肠毒素特性，分子量为28kDa，含有175个氨基 酸。
[0093] VP8-NSP4融合蛋白：用基因重组的方法，将VP8和NSP4多肽链融合表达，以提高 VP8在水溶液中的可溶性，同时使得融合蛋白具有刺激机体产生抗NSP4的保护性抗体。
[0094] 荚膜多糖片段：通过物理（如超声波、微粒喷雾）、化学（如酸、碱、酶消化）等方法 将由细菌培养液中纯化的多糖（称全多糖或原始多糖）降解（depolymerization)所获得 的多糖片段，分子量通常低于原始多糖。荚膜寡聚糖：通过物理（如超声波、微粒喷雾）、化 学（如酸、碱、酶消化）等方法将由细菌培养液中纯化的多糖（称全多糖或原始多糖）降解 (depolymerization)所获得的多糖片段，分子结构中的单糖残基通常低于10。不过单糖残 基数量的定义有差异，有些文献将多于10个少于20个单糖残基的多糖链也成为寡聚糖。
[0095] 与现有技术相比，本发明具有以下优势：
[0096] 1.所述缀合疫苗是含两种或两种以上不同载体蛋白的免疫缀合物，与现有的肺 炎球菌结合疫苗相比，其免疫原性更强，诱发的多糖抗体水平高于单载体结合物，可以在更 广阔的人群中引起免疫应答，尤其是婴幼儿；可通过减少各载体剂量而避免载体表位过载； 可通过两种载体增强辅助T细胞活性；
[0097] 2.由于两种载体蛋白中具有保护性的蛋白抗原表位也会诱导比两种蛋白混合注 射时更高的免疫反应，相互协同作用，进一步增进了载体蛋白的免疫原性，增加了机体对多 糖的免疫反应；
[0098] 3.本发明首创的采用磁性纳米微球作为多糖与多载体蛋白的连接体，有效地避免 在制备过程中荚膜多糖和蛋白质间的自身偶联，能够提高结合产物的收率，并且利于产品 的质量控制；可有效延长荚膜多糖与载体蛋白之间的空间距离，减小了载体蛋白对荚膜多 糖抗原表位的空间屏蔽效应，有利于提高荚膜多糖的免疫原性；
[0099] 4.所述缀合疫苗的制备过程中首创的将磁性纳米微球表面的-OH先与多糖进行 偶联反应，再将偶联体经化学改性将未反应-OH改性为-CHO在与载体蛋白中的_顯 2进行 偶联结合，较现有技术中的结合方法更为稳定；
[0100] 5.其制备方法简单，适合规模化工业生产的需要，未显著改变荚膜多糖和载体蛋 白的结构特征。
[0101] 综上述，本发明提供的缀合疫苗制备工艺简单，采用磁性纳米微球为连接物的缀 合疫苗能够增强小鼠 Thl型免疫应答，以及多糖特异性抗体的免疫持效性、特异性和亲和 性，此外还可诱导小鼠产生轮状病毒抗体；具备两种疫苗的预防效果；因此具有十分广阔 的应用前景。
【附图说明】
[0102] 图1为本发明实施例1所制得的缀合疫苗的1H-NMR谱图；
[0103] 图2为本发明提供的缀合疫苗的多糖特异性抗体的免疫应答实验结果示意图； [0104]图3为本发明提供的缀合疫苗的多糖特异性抗体的免疫持效性实验结果示意图； 图4为本发明提供的缀合疫苗的轮状病毒中和试验结果示意图。
【具体实施方式】
[0105] 下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整地说明。以下所用试剂或设备均为 市售品种，如无特殊说明，均按照说明书操作，在此不做赘述。
[0106] 以下为结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不应视为对本发明的限定。
[0107] 实施例1
[0108] -、制备磁性纳米微球
[0109] L 取 2. 24gFeS04-7H20 和 3. 24gFeCl3-6H20 分别溶于 IOmL 和 15mL 过滤除氧的 ClddH2O中，溶解后混合均勾，加入IOOmL过滤除氧的ClddH2O ;
[0110] 2.在N2的保护下搅拌5min，一次性加入50mLlmol/LNa0H溶液，再调节溶液pH至 9-10,加快搅拌速度至200-250r/min，连续搅拌30min ;
[0111] 3.将反应容器转移至65-70 °C水浴中，继续在N2的保护下搅拌陈化30min ;
[0112] 4.反应完毕定容至100mL，显微镜下观察磁性粒子合成情况；
[0113] 5.将400mgPLGA溶于IOmLEA溶剂中作为油相（0)，加入3mL上述磁性粒子溶液作 为内水相（W 1),采用超声细胞破碎仪（120W、60s)在冰水浴中进行初乳化化制备初乳，再将 初乳倒入一定量含15g/LPVA和0.9% (Q)NaCl的水溶液（外水相，W2)，磁力搅拌（300r/ min、2min)制备预复乳液（W1AVW2),再将预复乳倒入快速膜乳化的储料罐中，以一定队压 力将其反复压过SPG膜，得粒径均一的纳米微球复乳液滴。此外，未用完的纳米微球可制成 冻干剂留用。
[0114] 或通过取Fe3O4磁性粒子与50mL与无水乙醇按等体积加入，超声活化30min后， 置60°C水浴中，缓慢的滴加 IOmLPELA对磁性纳米微球进行-NH2末端改性且将I3ELA包裹在 Fe3O4磁性粒子外，在氮气保护下搅拌反应10h，制成磁性纳米微球；反应完毕后，用50mL无 水乙醇洗漆3次，再用0,01MPBS洗漆三次后，定容至50mL，显微镜下观察磁珠改性情况，至 磁性纳米微球表面_順2末端改为-OH末端。
[0115] 二、肺炎球菌多糖的制备
[0116] L 选取 24 种血清型（1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F)的肺炎球菌培养；
[0117] 2.分别提纯以上各种血清型肺炎球菌中抗原性强的荚膜多糖：肺炎球菌，灭活 后离心收集上清液，经超滤浓缩，根据各肺炎球菌血清型特性分别加入适量（体积分数为 70%的）预冷乙醇，离心收集，得粗制多糖；将粗制多糖溶于乙酸钠溶液中，然后按1 :2比 例以冷酚混匀，离心去除蛋白，反复酚提5-6次，收集上清，用蒸馏水透析，透析后液体加 2mol/L氯化钙溶液，加入乙醇搅拌，离心去除核酸，收集上清，补加乙醇（终浓度80%搅 拌），离心收集沉淀，用乙醇、丙酮洗涤沉淀，脱水干燥后即为多价精制荚膜多糖，置-20°C 保存备用。
[0118] 三、轮状病毒载体蛋白的制备
[0119] 轮状病毒载体蛋白的制备可参见现有技术中的多种重组蛋白的制备方法，本实施 例采用CN 101972475中提及的方法制备，可简化为以下步骤，具体参数不做赘述：
[0120] 1、建立轮状病毒的cDNA库
[0121] 选用的为Wa毒株VP8蛋白的VP4基因，扩增引物设计如下！sense引物 HWaVP4 P ET28 ：
[0122] 5' -TTACATATGGCTTCGCTCATTTATAG-3'，anti-sense 引物 AHWaVP4 P ET28 :
[0123] 5 ' -CCGGATCCCTAGTCTTCATTAACTTGTGCT-3 '。
[0124] 2、构建pET28aWaVP8表达全长VP8质粒
[0125] 3、表达重组VP8蛋白
[0126] 1)将制得的pET28aWaVP8质粒转化入BL21 (DE3) competent细胞中，接种细胞到 50 μ g/mL卡那霉素 LB培养皿，在37 °C下于0)2培养箱内过夜。
[0127] 2)挑选出一个菌落，接种到10毫升含有50 μ g/mL的卡那霉素 LB培养液（1 %胰 蛋白胨、〇.5%酵母提取物、1%似(：1，？!17.5)中扩增，在37°〇培养过夜。
[0128] 3)将培养液转接种到100毫升的50 μ g/mL卡那霉素 LB培养液，继续培养。待吸 光度600nm的OD到达I. 0时，将培养液转接种到6升到50 μ g/mL卡那霉素 LB培养液中，继 续在37°C，摇速200rpm的摇床内培养，待吸光度600nm的OD到达0. 6?0. 8时，加入0. 3mM 的IPTG (异丙基-β -D-硫代半乳糖苷）诱导VP8表达。
[0129] 4)在相同的培养条件下，诱导4小时后，以4000g下，在10°C离心20分钟后，收集 菌体。
[0130] 5)将细菌悬浮于20mL的I XPBS溶液，用法式压滤壶（Frenchpress)破碎细菌后， 在IOOOOg下，在10°C离心30分钟，丢弃上清液，收集沉淀的包涵体。在进一步纯化前，存储 包涵体于-40°C。
[0131] 3、从包涵体中纯化VP8蛋白
[0132] 1)称取制备的VP8包涵体0. 5克（湿重），用清洗缓冲液（lOmMTris，IOOmM磷