糖缀合方法和组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 概括地说，本发明涉及包含通过（2-((2-氧代乙基）硫基）乙基）氨基甲酸酯 (eTEC)间隔基共价缀合到载体蛋白的糖的糖缀合物（glycoconjugate)、包含此类糖缀合 物的免疫原性组合物以及制备和使用此类糖缀合物和免疫原性组合物的方法。
【背景技术】
[0002] 通过使弱免疫原性分子缀合到"载体"分子来增加这些分子的免疫原性的方 法已被成功地利用了数十年（参见例如Goebel等人（1939) J. Exp. Med. 69:53)。例如， 许多免疫原性组合物已被描述，其中纯化的荚膜聚合物已被缀合到载体蛋白以通过利 用这一 "载体效应"来产生更有效的免疫原性组合物。Schneerson等人（1984) Infect. Immun. 45:582-591)。还证明缀合可绕开当用游离多糖对婴儿进行免疫时通常在其体内观 察到的弱抗体反应（Anderson等人（1985) J. Pediatr. 107:346 ;Insel等人（1986)】』叉卩· Med. 158:294)。
[0003] 已使用多种交联试剂或偶联试剂（例如同型双官能（homobifunctional)交联剂、 异型双官能（heterobifunctional)交联剂或零长度（zero-length)交联剂）成功地生成 缀合物。许多方法目前可用于将免疫原性分子（例如糖、蛋白和肽）偶联到肽或蛋白载体。 多数方法产生胺、酰胺、聚氨酯、异硫脲或二硫键，或在一些情况下产生硫醚。使用向载体和 /或免疫原性分子上的反应性氨基酸分子的侧链中引入反应性位点的交联试剂或偶联试剂 的缺点是所述反应性位点如果不被中和，则能够自由地在体外（由此可能不利地影响所述 缀合物的功能性或稳定性）或在体内（从而在用所述制剂免疫的人或动物中构成潜在不利 事件的风险）与任何不期望的分子反应。可利用多种已知的化学反应使此类过量的反应性 位点反应或"加帽"，以使这些位点灭活，但这些反应可能会以其它方式破坏所述缀合物的 功能性。当尝试通过向载体分子中引入反应性位点来产生缀合物时，这可能尤其会引发问 题，因为缀合物的大尺寸和更复杂的结构（相对于免疫原性分子）可能使其更易于受到化 学处理的破坏性影响的作用。因此，仍然需要制备经适当加帽的载体蛋白缀合物从而使载 体的功能性得以保持并且所述缀合物保留引发期望的免疫应答的能力的新方法。
【发明内容】
[0004] 本发明涉及制备包含通过异型双官能二价连接体（在本文中被称作（2-((2-氧代 乙基）硫基）乙基）氣基甲酸醋（eTEC)间隔基）共价缀合到载体蛋白的糖的糖缀合物的 方法。所述eTEC间隔基包括7个线性原子（即，-C(O)NH(CH 2)2SCH2C(O)-)，并且在糖与载 体蛋白之间提供稳定的硫醚键和酰胺键。本发明还提供eTEC连接的糖缀合物、包含它们的 免疫原性组合物以及使用此类糖缀合物和免疫原性组合物的方法。
[0005] 在一个方面中，本发明提供包含通过eTEC间隔基缀合到载体蛋白的糖的糖缀合 物，其中所述糖通过氨基甲酸酯键共价连接到所述eTEC间隔基，并且其中所述载体蛋白通 过酰胺键共价连接到所述eTEC间隔基。
[0006] 在一些实施方案中，所述糖是多糖，例如源自细菌、尤其源自病原细菌的荚膜多 糖。在其它实施方案中，所述糖是寡糖或单糖。
[0007] 本发明的eTEC连接的糖缀合物可由通式⑴表示：
【主权项】
1. 制备包含通过（2-((2-氧代己基）硫基）己基）氨基甲酸醋（eTEC)间隔基缀合到 载体蛋白的糖的糖缀合物的方法，其包括W下步骤： a) 使糖与1，r -幾基-二-(1，2, 4- S挫）仰T)或1，1' -幾基二咪挫仰I)在有机 溶剂中反应W产生活化的糖； b) 使所述活化的糖与脱胺或半脱胺或其盐反应，W产生硫醇化糖； C)使所述硫醇化糖与还原剂反应W产生包含一个或多个游离琉基残基的活化的硫醇 化糖； d) 使所述活化的硫醇化糖与包含一个或多个a-面代己酷胺基的活化的载体蛋白反 应，W产生硫醇化糖-载体蛋白缀合物；W及 e) 使所述硫醇化糖-载体蛋白缀合物与（i)能够将所述活化的载体蛋白的未缀合的 a -面代己酷胺基加帽的第一加帽试剂郝/或（ii)能够将未缀合的游离琉基残基加帽的 第二加帽试剂反应； 由此产生eTEC连接的糖缀合物。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述加帽步骤e)包括使所述硫醇化糖-载体蛋白 缀合物与（i)作为第一加帽试剂的N-己酷基半脱氨酸和/或（ii)作为第二加帽试剂 的舰己酷胺反应。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其还包括通过反应使所述糖与=挫或咪挫复合 W提供复合糖的步骤，其中在步骤a)前将所述复合糖壳形冷冻，冻干并且在有机溶剂中复 原。
4. 根据权利要求1、2或3所述的方法，其还包括将步骤C)中产生的硫醇化多糖纯化， 其中所述纯化步骤包括渗滤。
5. 根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中步骤C)中的所述还原剂是=(2-駿己 基）麟（TCE巧、二硫苏糖醇值TT)或琉基己醇。
6. 根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中用活化的漠己酸衍生物将所述载体蛋 白活化。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述漠己酸衍生物是漠己酸的N-哲基班巧酷亚胺 醋炬AAN巧。
8. 根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述方法还包括通过渗滤来纯化所述 eTEC连接的糖缀合物。
9. 根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中步骤a)中的所述有机溶剂是选自二甲 基亚讽值MSO)、二甲基甲酯胺值MF)、二甲基己酷胺值MA)、N-甲基-2-化咯烧酬（NMP)、己 膳、1，3-二甲基-3, 4, 5, 6-四氨-2(1H)-喀晚酬值MPU)和六甲基磯酷胺（HMPA)或其混合 物的极性非质子溶剂。
10. 根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中糖：载体蛋白比率（w/w)是0.2-4。
11. 根据权利要求10所述的方法，其中所述糖：载体蛋白比率（w/w)是0.4-1. 7。
12. 根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述糖是源自肺炎链球菌 (S. pneumoniae)的英膜多糖。
13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述英膜多糖选自肺炎球菌（Pn)血清型1、3、 4、5、6A、她、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F英膜多糖。
14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述英膜多糖是Pn-血清型33F英膜多糖。
15. 根据权利要求13所述的方法，其中所述英膜多糖是Pn-血清型22F英膜多糖。
16. 根据权利要求13所述的方法，其中所述英膜多糖是Pn-血清型10A英膜多糖。
17. 根据权利要求13所述的方法，其中所述英膜多糖是Pn-血清型11A英膜多糖。
18. 根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述糖是源自脑膜炎奈瑟球菌 (N. meningitidis)的英膜多糖。
19. 根据权利要求19所述的糖缀合物，其中所述英膜多糖选自脑膜炎球菌（Mn)-血清 型A、C、化35和Y英膜多糖。