雄激素受体表达的调节的制作方法
【专利说明】雄激素受体表达的调节
[0001] 序列表
[0002] 本申请与电子格式的序列表一起提交。该序列表被提供为标题为200157W0SEQ. txt，创建于2013年10月1日，大小为大约556KB的文件。将该电子格式的序列表中的信 息通过引用以其全部内容结合在此。 发明领域
[0003] 某些实施例是针对靶向人雄激素受体（AR)用于抑制细胞中的雄激素受体水平的 化合物和组合物，这些化合物和组合物对于治疗癌症和抑制癌细胞生长或增殖的方法而言 可以是有用的。
[0004] 发明背景
[0005] 雄激素受体（AR)属于核受体超家族并且通过结合至其激素配体而激活，这些配 体是雄激素、睾酮或DHT。在细胞质中结合激素配体后，雄激素受体移位至细胞核，在细胞核 中它结合DNA并作为转录因子而发挥作用，以调节多种靶基因的表达，例如前列腺特异性 抗原（PSA)和TMPRSS2。Knudsen等人（Trends Endocrinol Metab (《内分泌学与新陈代谢 趋势》）21:315-24, 2010)Bennett 等人（Int J Biochem Cell BioL (《生物化学与细胞生 物学国际杂志》）42:813-827, 201)。
[0006] 雄激素受体（AR)信号转导是前列腺癌细胞的关键存活途径，并且雄激素剥夺疗 法（ADT)(又称"化学去势"）是一种对抗激素敏感、雄激素依赖性前列腺癌的一线治疗策 略，该策略减少循环的雄激素水平并且由此抑制AR活性。尽管大部分患者最初对ADT响 应，但是大多数将最终发展为去势抗性，在此情况下，不管睾酮的去势水平如何，该疾病仍 进展。此种类型的癌症称为去势抗性前列腺癌（CRPC)。存在多种引起去势（castrate， castration)抗性的发展的机制，包括AR蛋白的表达增加（该AR蛋白可以使得细胞对低 水平的雄激素敏感），AR突变（这些突变可以改变转录激活或使得AR对替代性配体敏感） AR的可变剪接形式的出现，这些可变剪接形式缺乏配体结合结构域，尽管如此但是可以起 作用以促进肿瘤在不存在配体刺激的情况下生长。另外，前列腺肿瘤还可以合成其自身雄 激素，由此增加可供激活AR使用的局部瘤内睾酮水平。
[0007] 雄激素受体（AR)信号转导是前列腺癌细胞的关键存活途径，并且雄激素剥夺疗 法（ADT)对于患有局部晚期和转移性疾病的患者而言仍是主要治疗。尽管大部分患者 最初对ADT响应，但是大多数将最终发展为去势抗性，在此情况下，不管睾酮的去势水平 如何，该疾病仍进展。此种类型的癌症称为去势抗性前列腺癌（CRPC) (Karantos等人， Oncogene advance online (《原癌基因进展在线》）：1-13, 2013)。存在多种引起去势抗性 的发展的机制，包括AR蛋白的表达增加，该AR蛋白可以使得细胞对低水平的雄激素敏感 (Gregory等人，Cancer Res (《癌症研究》）61:2892-2898, 2001 ;Linja等人，《癌症研究》 61:3550-3555, 2001)，AR突变，这些突变可以改变转录激活或使得AR对替代性配体敏感 (Scher等人，J Clin 0ncol(《临床肿瘤学杂志》）23:8253-8261, 2005)以及AR的可变剪 接形式的出现，这些可变剪接形式缺乏配体结合结构域，尽管如此但是可以起作用以促进 肿瘤在不存在配体刺激的情况下生长（Yingming等人，《癌症研究》73:483-489, 2013)。另 外，前列腺肿瘤还可以合成其自身雄激素，由此增加可供激活AR使用的局部瘤内睾酮水平 (Attard 等人，Cancer Cell (《癌细胞》）16:458-462, 2009)。
[0008] 雄激素受体在去势抗性前列腺癌中仍具有活性的事实已经引起新的药剂的研发， 这些药剂抑制雄激素配体的产生或阻断这些配体对AR的作用。这些新的药剂包括乙酸阿 比特龙，其抑制17-α-羟化酶/17, 20-裂解酶（CYP17)活性，从而引起由肾上腺和在前列 腺肿瘤自身中合成的残余雄激素的减少deBono等人（Ν Engl J Med(《新英格兰医学杂 志》）364:1995-2006, 2011)，以及恩杂鲁胺（enzalutamide)，其阻止雄激素配体结合至AR、 移位至细胞核并结合至DNA(Scher等人，《新英格兰医学杂志》367:1187-1197, 2012)。多 种其他雄激素合成抑制剂或雄激素受体阻断剂处于临床前或临床研发之下并且包括例如 ARN509、0DM201、Τ0Κ001、VT464。
[0009] 尽管药剂（例如恩杂鲁胺和阿比特龙）在CRPC中的活性是非常令人鼓舞的，但是 两者并不在所有患者体内起作用并且两者都与通过上述机制经由AR的重新激活发展另外 的抗性相关（Yingming等人，Cancer Res (《癌症研究》）73:483-489, 2013)。因此，对于鉴 定出治疗CRPC的替代性疗法，并且特别是可以除去和/或抑制所有形式的AR(包括例如， 野生型、突变和剪接变体AR)的活性的那些存在持续需求。
[0010] 本发明提供了反义寡核苷酸，凭借其设计和作用方式（与ARRNA靶标进行碱基配 对并且通过RNase H介导其破坏，该RNase H是一种破坏DNA/RNA双链体中的RNA的酶） 这些反义寡核苷酸旨在抑制主要形式的AR。通过靶向AR mRNA的适当区域，该反义寡核苷 酸将引起主要形式（全长、剪接变体和突变形式）的雄激素受体蛋白的抑制并且因此将适 于治疗患有CRPC的患者。
[0011] 除前列腺癌之外，AR在其他肿瘤（例如乳腺癌）的进展中也被牵连为一个因素。在 乳腺癌中，AR被表达于70% -80%的肿瘤中，这些肿瘤也是ER阳性的，并且在12%情况下， 被称为三阴性的（不表达ER、PR和HER2) (Hickey等人，Molecular Endocrinology(《分子 内分泌学》）26:1252-1267, 2012)。在临床前研究中，雄激素受体拮抗剂比卡鲁胺在乳腺癌 细胞中诱导体外抗增殖应答并且这通过加入Pi3K/mT0R抑制剂得以增强（Ni等人，Cancer Cell (《癌细胞》）20:119-131，2011)。第2代抗雄激素恩杂鲁胺在ER+/AR+乳腺癌细胞中 抑制二氢睾酮（DHT)介导的增殖并且在体内临床前模型中在抑制雌激素刺激的乳腺癌肿 瘤生长方面与三苯氧胺同样有效（Cochrane等人，Cancer Res(《癌症研究》)72(24增刊）： P2-14-02, 2012)。恩杂鲁胺还在HER2+和三阴性乳腺癌细胞中抑制增殖。看来在雌激素 作用被减少（例如，长期雌激素剥夺或不存在ER)的情况下，AR水平增加并且可以变得致 癌。这将表明，AR拮抗剂可以被最佳定位在三阴性或激素抗性乳腺癌环境中（Hickey等人， Molecular Endocrinology(《分子内分泌学》）26:1252-1267, 2012)。AR靶向疗法目前在 乳腺癌临床试验中的研究之下（NCT00468715、NCT01597193、NCT01381874、NCT00755886)。
[0012] AR还被表达于多种其他肿瘤中，包括但不限于膀胱、卵巢、胃、肺以及肝。临床前 数据支持如在乳腺癌中促进肿瘤细胞增殖存活的类似角色，因而阻断这些肿瘤中的AR可 以具有治疗临床益处（Chang等人，Oncogene advance online (《原癌基因进展在线》）： 1-10, 2013)。
[0013] 发明概沭
[0014] 在此提供的若干实施例涉及用于抑制细胞中的雄激素受体水平的化合物和组合 物的发现，这些化合物和组合物对于治疗癌症和抑制癌细胞增殖或生长的方法而言可以是 有用的，例如前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌或膀胱癌或癌细胞。
[0015] 详细说明
[0016] 应理解，前述的一般说明以及以下的详细说明都是示例性的并且仅是解释性的并 且不限制所要求的本发明。在此，单数的使用包括复数，除非另外明确说明。如在此所使用， 除非另外说明，"或"的使用意指"和/或"。此外，术语"包括（including) "以及其他形式 (例如，"包括（includes)"和"被包括（included)"）的使用是非限制性的。同样，除非另 外明确说明，术语例如"要素"或"组分"涵盖包括一个单位的要素和组分以及包括超过一 个亚单位的要素和组分。
[0017] 在此使用的小节标题仅是为了组织的目的并且不应被解释为限制所描述的主题。 在本申请中引用的所有文献或文献的部分（包括但不限于专利、专利申请、文章、书及论 文）通过引用以在此讨论的文献的部分以及以其全部内容而特此清楚地结合。
[0018] 定义
[0019] 除非提供了具体定义，否则与在此描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药 物化学结合使用的术语以及其程序和技术是本领域中熟知并且通常使用的那些。可以将标 准技术用于化学合成和化学分析。在允许的情况下，所有专利、申请、公开的申请以及其他 公开物、通过数据库（例如国家生物技术信息中心（NCBI))可获得的GENBANK登录号和相 关的序列信息以及其他贯穿在此的披露而提及的其他数据通过引用以在此讨论的文献的 部分以及以其全部内容而结合。
[0020] 除非另外指明，以下术语具有以下含义：
[0021] "2' -0-甲氧基乙基"（亦称2' -MOE和2' -O(CH2)2-OCH3)是指糖环（例如，呋喃糖 环）的2'位处的0-甲氧基-乙基修饰。2' -0-甲氧基乙基修饰的糖是一种经修饰的糖。
[0022] "2' -MOE核苷"（亦称2' -0-甲氧基乙基核苷）意指包括一个2' -MOE修饰的糖 部分的核苷。
[0023] "2' -取代的核苷"意指在呋喃糖基环的2' -位处包括一个除H或OH外的取代基 的核苷。在某些实施例中，2'取代的核苷包括具有二环糖修饰的核苷。
[0024] "3'靶位点"是指与特定反义化合物的最3'端核苷酸互补的靶核酸的核苷酸。
[0025] "5'靶位点"是指与特定反义化合物的最5'端核苷酸互补的靶核酸的核苷酸。
[0026] "5-甲基胞嘧啶"意指被附接至5'位的甲基修饰的胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶是一种 经修饰核碱基。
[0027] "约"意指在某值的±7%内。例如，如果指明"这些化合物影响雄激素受体的至少 约70%抑制"，则暗指雄激素受体水平在63%与77%的范围内被抑制。
[0028] "给予"或"给药"是指向受试者引入在此提供的反义化合物以完成其预期功能的 途径。可以使用的给予途径的一个实例包括但不限于胃肠外给予，例如皮下、静脉内、或肌 肉注射或输注。
[0029] 相对于乳腺癌或乳腺癌细胞，"雄激素受体阳性"是指表达雄激素受体的乳腺癌或 乳腺癌细胞。
[0030] "动物"是指人或非人动物，包括但不限于，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、猪以及非人灵长 类（包括但不限于猴和黑猩猩）。
[0031] "抗雄激素剂"是指作为雄激素合成抑制剂或雄激素受体阻断剂的治疗化合物或 药物。
[0032] "反义活性"意指可归因于反义化合物与其靶核酸杂交的任何可检测或可测量活 性。在某些实施例中，反义活性是靶核酸或由这样的靶核酸编码的蛋白的量或表达的下降。 [0033] "反义化合物"意指能够通过氢键合而经历与靶核酸杂交的寡聚化合物。反义化合 物的实例包括单链和双链化合物，例如反义寡核苷酸、siRNA、shRNA、ssRNA以及基于占据的 (occupancy-based)化合物。
[0034] "反义抑制"意指与在不存在反义化合物的情况下的靶核酸水平相比，在存在与该 靶核酸互补的该反义化合物的情况下的该靶核酸水平的减少。
[0035] "反义机制"是涉及化合物与靶核酸杂交的所有那些机制，其中杂交结果或作用是 靶标降解或靶标占据，伴随涉及例如转录或剪接的细胞机器的停止。
[0036] "反义寡核苷酸"意指具有一个允许与靶核酸的对应区域或区段杂交的核碱基序 列的单链寡核苷酸。
[0037] "碱基互补性"是指反义寡核苷酸的核碱基与靶核酸中的对应核碱基精确碱基配 对（即，杂交）的能力，并且由对应的核碱基之间的沃森 -克里克（Watson-Crick)、胡斯坦 (Hoogsteen)或反向胡斯坦氢键合介导。
[0038] "二环糖部分"意指包括一个4至7元环的经修饰的糖部分（包括但不限于呋喃糖 基），该4至7元环包括连接该4至7元环的两个原子的一个桥从而形成第二环，从而产生 双环结构。在某些实施例中，该4至7元环是糖环。在某些实施例中，该4至7元环是呋喃 糖基。在某些此类实施例中，该桥连接呋喃糖基的2' -碳和4' -碳。
[0039] 还被包括在根据本发明的LNA的定义内的是以下LNA，其中核糖基糖的2'-羟基 被连接至该糖环的4'碳原子，由此形成一个亚甲基氧基（4' -CH2-0-2'）桥，以形成该二 环糖部分。该桥还可以是一个连接2'氧原子和4'碳原子的亚甲基（-CH 2-)基团，针对其 使用术语亚甲基氧基（4' -CH2-0-2'）LNA。此外，在该二环糖部分在此位置中具有一个亚 乙基桥联基团的情况下，使用术语亚乙基氧基（4' _CH2CH2H'）LNA。α-L-亚甲基氧基 (4' -CH2-0-2'）（一种亚甲基氧基（4' -CH2-0-2'）LNA异构体）也被涵盖在LNA的定义内， 如在此所使用。
[0040] "帽子结构"或"末端帽子部分"意指已经被掺入在反义化合物的任一末端处的化 学修饰。
[0041] "去势抗性前列腺癌（castrate-resistant prostate cancer) "或"去势抗性前列 腺癌（castration-resistant prostate cancer) "和前列腺癌细胞是指前列腺癌和前列腺 癌细胞对雄激素剥夺疗法或抗雄激素剂的敏感性降低。
[0042] "cEt"或"受约束乙基"意指包括一个连接4' -碳和2' -碳的桥的二环糖部分，其 中该桥具有以下式：4' -CH(CH3)-0-2'。
[0043] "受约束乙基核苷"（亦称cEt核苷）意指包括一个包含4' -CH(CH3)-0-2'桥的二 环糖部分的核苷。
[0044] "化学上不同的区域（chemically distinct region) "是指反义化合物的一个区 域，其以一些方式在化学上不同于同一反义化合物的另一区域。例如，一个具有2'-0_甲氧 基乙基核苷酸的区域在化学上不同于一个不具有2' -O-甲氧基乙基修饰的核苷酸的区域。 [0045] "嵌合反义化合物"意指具有至少2个化学上不同的区域的反义化合物，每个位置 都具有多个亚单位。
[0046] "互补性"意指第一核酸与第二核酸的核碱基之间进行配对的能力。
[0047] "包括（comprise) "、"包括（comprises) " 和"包括（comprising) " 应当理解为暗 示包括一个所述的步骤或要素或多个步骤或要素的组，但不排除任何其他一个步骤或要素 或多个步骤或要素的组。
[0048] "连续核喊基"意指彼此紧邻的核喊基。
[0049] "脱氧核糖核苷酸"意指在核苷酸的糖部分的2'位处具有一个氢的核苷酸。可以 用多种取代基中的任何取代基修饰脱氧核糖核苷酸。
[0050] "设计"或"被设计为"是指设计与所选核酸分子特异性杂交的寡聚化合物的过程。
[0051] "下游"意指朝向核酸的3'端或C-末端的相对方向。
[0052] "疗效"意指产生希望的效果的能力。
[0053] 关于乳腺癌或乳腺癌细胞，"雌激素受体（ER)阳性"是指表达雌激素受体（ER)的 乳腺癌或乳腺癌细胞。
[0054] 关于乳腺癌或乳腺癌细胞，"雌激素受体（ER)阴性"是指不表达雌激素受体（ER) 的乳腺癌或乳腺癌细胞。
[0055] "表达"意指所有功能，借助所述功能，基因的编码信息转化成在细胞中存在和运 行的结构。此类结构包括但不限于转录和翻译产物。
[0056] "完全互补"或"100%互补"意指第一核酸的每个核碱基在第二核酸中都具有互补 核碱基。在某些实施例中，第一核酸是反义化合物并且靶核酸是第二核酸。
[0057] "缺口体（gapmer) "意指嵌合的反义化合物，在该化合物中具有多个支持RNase H 切割的核苷的内部区域被定位在具有一个或多个核苷的外部区域之间，其中这些包括该内 部区域的核苷在化学上不同于包括这些外部区域的该核苷或这些核苷。该内部区域可以被 称作"缺口（gap)"并且这些外部区域可以被称作"翼（wing)"。
[0058] 关于乳腺癌或乳腺癌细胞，"Her2/neu阴性"是指不表Her2/neu的乳腺癌或乳腺 癌细胞。
[0059] "杂交"意指互补核酸分子的退火。在某些实施例中，互补核酸分子包括但不限于， 反义化合物和核酸靶标。在某些实施例中，互补核酸分子包括但不限于，反义寡核苷酸和核 酸靶标。
[0060] "紧邻"意指在紧邻要素之间不存在介入要素。
[0061] "个体"意指选择用于治疗或疗法的人或非人动物。
[0062] "诱导"、"抑制"、"增强"、"升高"、"增加"、"减少"、"上调"、"下调"等通常表示两种 状态之间的量化差异。
[0063] "抑制表达或活性"是指表达或活性的降低、阻断并且未必指示表达或活性的完全 消除。
[0064] "核苷间连接"是指核苷之间的化学键。
[0065] "延伸的"反义寡核苷酸是相对于在此披露的反义寡核苷酸，具有一个或多个另外 的核苷的那些。
[0066] "连接的脱氧核苷"意指被由磷酸酯连接的脱氧核糖取代以形成核苷酸的核酸碱 基（A、G、C、T、U)。
[0067] "连接的核苷"意指通过核苷间连接连接在一起的相邻核苷。
[0068] "错配"或"非互补核碱基"是指当第一核酸的核碱基不能与第二或靶核酸的对应 核碱基配对的情况。
[0069] "经修饰的核苷间连接"是指来自天然发生的核苷间键（即，磷酸二酯核苷间键） 的取代或任何变化。
[0070] "经修饰核碱基"意指除腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶外的任何核碱 基。"未经修饰核碱基"意指嘌呤碱基腺嘌呤（A)和鸟嘌呤（G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶（T)、 胞嘧啶（C)和尿嘧啶（U)。
[0071] "经修饰的核苷"意指独立地具有经修饰的糖部分和/或经修饰核碱基的核苷。
[0072] "修饰的核苷酸"意指独立地具有经修饰的糖部分、经修饰的核苷间连接或经修饰 核碱基的核苷酸。
[0073] "经修饰的寡核苷酸"意指包括至少一个经修饰的核苷间连接、经修饰的糖和/或 经修饰核碱基的寡核苷酸。
[0074] "经修饰的糖"意指来自天然糖部分的取代和/或任何变化。
[0075] "单体"是指单个单位的寡聚体。单体包括但不限于无论是天然发生的还是修饰的 核苷和核苷酸。
[0076] "基序"意指反义化合物中的未经修饰的和经修饰的核苷的模式。
[0077] "天然糖部分"意指DNA (2' -H)或RNA (2' -OH)中发现的糖部分。
[0078] "天然发生的核苷间连接"意指3'至5'磷酸二酯连接。
[0079] "非互补核碱基"是指不彼此形成氢键或不以其他方式支持杂交的一对核碱基。
[0080] "核酸"是指由单体核苷酸组成的分子。核酸包括但不限于，核糖核酸（RNA)、脱氧 核糖核酸（DNA)、单链核酸以及双链核酸。
[0081] "核碱基"意指能够与另一核酸的碱基配对的杂环部分。
[0082] "核碱基互补性"是指核碱基能够与另一核碱基碱基配对。例如，在DNA中，腺嘌呤 (A)与胸腺嘧啶（T)互补。例如，在RNA中，腺嘌呤（A)与尿嘧啶（U)互补。在某些实施例 中，互补核碱基是指能够与其靶核酸的核碱基进行碱基配对的反义化合物的核碱基。例如， 如果反义化合物的某个位置处的核碱基能够与靶核酸的某个位置处的核碱基进行氢键合， 则该寡核苷酸与该靶核酸之间的氢键合的位置被认为在该核碱基对处是互补的。
[0083] "核碱基序列"意指独立于任何糖、连接和/或核碱基修饰的连续核碱基的顺序。
[0084] "核苷"意指连接至糖的核碱基。
[0085] "核苷模拟物"包括用于在寡聚化合物的一个或多个位置处替换糖或糖和碱基 以及不是必然地替换连接的那些结构，例如像具有吗啉基、环己烯基、环己基、四氢吡喃 基、二环或三环糖模拟物的核苷模拟物，例如非呋喃糖糖单位。核苷酸模拟物包括用于 在寡聚化合物的一个或多个位置处替换核苷和连接的那些结构，例如像肽核酸或吗啉基 (由-N (H)-C ( = 0)-0-或其他非磷酸二酯连接而连接的吗啉基）。糖代用品与略为宽泛的 术语核苷模拟物重叠，但是旨在指示仅替换糖单位（呋喃糖环）。在此提供的四氢吡喃基 环示意了糖代用品的一个实例，其中该呋喃糖糖基团已经被四氢吡喃基环系统替换。"模拟 物"是指替换糖、核碱基和/或核苷间连接的基团。通常，使用模拟物代替糖或糖-核苷间 连接组合，并且维持该核碱基用于与所选靶标杂交。
[0086] "核苷酸"意指一种核苷，该核苷具有共价连接至该核苷的糖部分的磷酸酯基团。 [0087] "寡聚化合物"意指连接的单体亚单位的聚合物，该聚合物能够与核酸分子的至少 一个区域杂交。
[0088] "寡核苷"意指其中的核苷间连接不包含磷原子的寡核苷酸。
[0089] "寡核苷酸"意指连接的核苷的聚合物，这些核苷中的每个核苷都可以彼此独立地 被修饰或不被修饰。
[0090] "硫代磷酸酯连接"意指核苷之间的连接，其中磷酸二酯键通过用硫原子替换非桥 氧原子之一而被修饰。硫代磷酸酯连接是一种经修饰的核苷间连接。
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