一种微生物发酵制备无患子总皂苷的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于林产化工领域，具体涉及无患子总皂苷的提取纯化方法，尤其涉及一种微生物发酵制备无患子总皂苷的方法。
【背景技术】
[0002]无患子，又称洗手果或圆肥皂，分布东南亚各国等广阔地域，资源丰富，在绿化、水土保持、环保等方面有广泛的应用。随着对无患子研宄的深入，其化学成分及药理作用已逐渐被发现，引起人们越来越多的关注。无患子果皮的主要化学成分是无患子皂苷，是一个优良的天然表面活性剂，不仅因具有良好的乳化、分散、发泡、湿润等功效，作为天然活性物质用于日常生活或化妆品行业，更因其特殊的杀菌、镇痛、消炎、杀虫及降血压的药理作用被用于细菌感染、农药乳化剂以及高血压药物等领域。
[0003]无患子作为一种多功能植物，无论被用做药用植物、经济作物还是园林树种，均具有巨大的开发潜力。具有特殊生物活性的无患子总皂苷及其苷元的研宄开发是关注的焦点。水提法和有机溶剂提取法是无患子皂苷的主要提取方法。直接水提法得率较高，但同时一些单糖、低聚糖、氨基酸、蛋白质、黏液质、果胶等溶解其中，导致提取物中皂苷纯度降低，且水提法也存在用水量大，浓缩成本高、废水排放多等缺点。此外，受植物细胞壁纤维组织的阻碍，水提法产品收率不高。超声波产生的振动可以造成植物细胞壁的瞬间破坏，可以促进植物细胞内物质的释放、扩散及溶解，从而提高提取率，降低水耗。酶具有高效性和特异性，可使植物细胞壁发生不同程度的改变，从而改变细胞壁的通透性，提高有效成分的提取率，但酶制剂的应用所引起的高成本也是亟待解决的问题。有机溶剂提取法虽提取率优于水提，但溶剂消耗量多，费用昂贵，在加上花时长且工艺繁琐，此外，残留的部分有机溶剂具有一定程度的毒性，将直接影响产品的质量，后处理对环境污染大。泡沫分离法提取过程中皂素有一定程度的分解，得率偏低；大孔树脂吸附分离法及超滤法对无患子总皂苷进行分离纯化，总皂纯度虽然提高，但工业化生产成本居高不下，无法推广应用。
[0004]微生物发酵是一种新型的无患子皂苷提取纯化的方法，其特点在于微生物培养条件粗矿、营养要求不严格、繁殖迅速。专利201210211918.1提供一种乳酸菌发酵制备无患子皂素的方法，并利用无患子果皮提取物中的纤维二糖、甘露糖和少量蛋白，经过酶解糖化发酵转化成乳酸，获得皂素和乳酸的复配产物，而高浓度的果胶等其他杂质无法有效的去除。专利201010550993.1提供一种无患子总皂苷的提取纯化的方法，利用酵母菌或米曲霉发酵对无患子皂苷进行分离纯化，但皂苷纯度并不高(只有45~60%)。同时，由于酵母菌有氧代谢只消耗葡萄糖，而水提液中的纤维素、果胶等成分无法降解；米曲霉代谢可生产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和曲酸等，经继续反应又会产生糖类。该发明单独利用两种微生物菌株，并没有发挥两者的协调效应，技术比较单一，针对性不强。还有，提取后并没有进行纯化精制处理，产品的色泽深，呈黄棕色。
[0005]黑曲霉发酵可产生淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶等酶类，是降解糖类、蛋白质、果胶、纤维素等物质的优良生物资源；酵母菌发酵糖类的代谢产物以气体的形式放出，后续处理工艺简便；两种菌株先后接入提取液中，不仅专一性降解水提液中的营养成分，而且避免竞争性抑制作用，杂质去除率较高。黑曲霉和酵母菌生长速率快，呼吸作用消耗水提液中大量糖类和水份，一定程度上对皂苷起到了浓缩作用，在工业运用上不仅节约浓缩成本，而且节能环保。总的来说，系统地阐述微生物发酵提取无患子总皂苷的方法及其多种工艺的联合运用较少报道，纯度低、成本高或可操作性差等缺点仍是制约无患子皂苷规模化生产的关键因素。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于克服上述无患子总皂苷提取纯化方法中存在的缺陷，提供一种成本低廉、操作简便、健康无毒、纯度较高且稳定的无患子总皂苷提取纯化的新方法。
[0007]本发明所采用的技术方案为一种微生物发酵无患子制备总皂苷的方法，技术解决方案如下:
将干燥后的无患子果皮粉碎到1~20目，以料液比1:1~10加入去离子水，在25~80°C的恒温条件下浸提l~24h，重复提取1~5次，滤除不容物后合并提取液；
将驯化后黑曲霉和酵母菌分别接种于YPD培养基中，在20~37°C的条件下培养1~3天，获得对数期的种子液；
皂苷上清液中添加浓度为0.05-0.1%磷酸氢二钾和浓度为0.01-0.05%硫酸镁，接种含量为1% ~10%经驯化后的黑曲霉种子液，在25~37°C的条件下培养2~20天；
再于上清液中接种含量为1% ~10%经驯化后的酵母菌种子液，在20~30°C的条件下培养2-30天；
离心，取无患子皂苷上清液进行浓缩处理，得皂苷质量分数约为50%的浓缩液，在浓缩液中加入一定量的浓度为30%的H2O2，在60°C恒温环境下脱色处理约2~4h ;
脱色后的浓缩液经喷雾干燥得淡黄色的皂苷粉末，纯度大于50%，干燥的环境下密封保存。
[0008]所述的黑曲霉和酵母菌的培养基成分为:1g酵母粉，20g蛋白胨，20g葡萄糖，水1L，若制固体培养基，加入15g琼脂粉，调节pH值为5。
[0009]本发明与现有技术相比，具有以下明显的优势和有益效果:
微生物本身具有生长速度快、生长条件简单和代谢过程特殊等特点，经生长条件(接种量、接种龄、发酵温度、发酵时间)的优化，驯化后的微生物菌株在提取液中可大量繁殖，不仅抑制皂苷提取液中其他杂菌的生长，而且专一性并最大程度地降解水提液中的营养成分，从而提高无患子总皂苷的纯度。除去杂质的皂苷浓缩液经过脱色处理，干燥后所得皂苷可以直接用于各种洗护用品和化妆品中。
[0010]【具体实施方式】实施例1
无患子果皮于60°c烘箱中烘干，粉碎过20目筛，取无患子果皮粉1Kg放入100L萃取器中，加20L去离子水，常压、30°C恒温浸提两次，每次4h，合并提取液并离心，得低纯度提取液。在YPD培养基中逐步加入无患子果皮水提液，让两种菌株循序渐进的适应该发酵环境，驯化出对水提液具有耐受性的微生物菌株。在皂苷上清液中添加0.05-0.1%磷酸氢二钾和0.01-0.05%硫酸镁，先接种3%驯化后的黑曲霉种子液，28°C下恒温培养7天，再接种3%驯化后的酵母菌种子液于上清液中，25°C下恒温培养10天，离心分离得到上清液。上清液进行浓缩，得皂苷质量分数约为50%的浓缩液，在浓缩液中加入一定量的30%的H2O2,60°C的恒温环境下脱色处理约2h。用喷雾干燥器对上清液进行脱水，得到无患子总皂苷粉末产品4 Kg，总皂苷提取率为18%，总皂苷纯度50%。
[0011]实施例2
无患子果皮于60°C烘箱中烘干，粉碎过20目筛，取无患子果皮粉10 Kg放入100L萃取器中，加40 L去离子水，常压、40°C恒温浸提两次，每次6h，合并提取液并离心，得低纯度提取液。在YPD培养基中逐步加入无患子果皮水提液，让两种菌株循序渐进的适应该发酵环境，驯化出对水提液具有耐受性的微生物菌株。皂苷上清液中添加0.05-0.1%磷酸氢二钾和0.01-0.05%硫酸镁，先接种5%对数期的黑曲霉种子液于水提液中，300C下恒温培养10天，再接种5%对数期的酵母菌种子液于上清液中，30°C下恒温培养15天，离心分离得到上清液。将无患子皂苷上清液进行浓缩，得皂苷质量分数约为50%的浓缩液；在浓缩液中加入一定量的30%的H2O2,60°C的恒温环境下脱色处理约3h。用喷雾干燥器对上清液进行脱水，得到无患子总皂苷粉末产品4 Kg,总皂苷提取率为20%，总皂苷纯度60%。
[0012]实施例3
无患子果皮于60°C烘箱中烘干，粉碎过20目筛，取无患子果皮粉10 Kg放入100L萃取器中，加30 L去离子水，常压、50°C恒温浸提三次，每次8h，合并提取液并离心，得低纯度提取液。在YPD培养基中逐步加入无患子果皮水提液，让两种菌株循序渐进的适应该发酵环境，驯化出对水提液具有耐受性的微生物菌株。皂苷上清液中添加0.05-0.1%磷酸氢二钾和0.01-0.05%硫酸镁，先接种7%对数期的黑曲霉种子液于水提液中，370C下恒温培养15天，再接种7%对数期的酵母菌种子液于上清液中，30°C下恒温培养25天，离心分离得到上清液。将无患子皂苷上清液进行浓缩，得皂苷质量分数约为50%的浓缩液；在浓缩液中加入一定量的30%的H2O2,60°C的恒温环境下脱色处理约4h。用喷雾干燥器对上清液进行脱水得到无患子总皂苷粉末产品4 Kg,总皂苷得率为24%，总皂苷纯度65%。
【主权项】
1.一种微生物发酵制备无患子总皂苷的方法，其特征在于本发明包括以下步骤: (O将干燥后的无患子果皮粉碎到1~20目，以料液比加入去离子水，在25~80°C的恒温条件下浸提l~24h，重复提取1~5次，滤除不容物后合并提取液； (2)黑曲霉和酵母菌分别接种于YPD培养基，在20~37°C的条件下培养1~3天，获得种子培养液；(3)接种含量为1%~10%的黑曲霉于提取液中，在25~37°C的条件下培养2~20天； (4)再接种含量为1%~10%的酵母菌于上清液中，在20~30°C的条件下培养2~30天，离心取上清液； (5)将无患子皂苷上清液进行浓缩，得皂苷质量分数约为50%的浓缩液，在浓缩液中加入一定量的H2O2进行恒温脱色处理； (6)脱色后的浓缩液经喷雾干燥得皂苷粉末，干燥环境下密封保存。
2.根据权利要求1所述的一种微生物发酵制备无患子总皂苷的方法，其特征在于所述的培养过程中先后加入黑曲霉和酵母菌两种微生物进行发酵。
3.根据权利要求1所述的一种微生物发酵制备无患子总皂苷的方法，其特征在于所述的接种于水提液中的黑曲霉和酵母菌是经过驯化的，对无患子水提液有一定耐性。
4.根据权利要求1所述的一种微生物发酵制备无患子总皂苷的方法，其特征在于所述的皂苷上清液中添加浓度为0.05-0.1%磷酸氢二钾和浓度为0.01-0.05%硫酸镁。
5.根据权利要求1所述的一种微生物发酵制备无患子总皂苷的方法，其特征在于所述的浓缩液中加入H2O2脱色处理。
6.根据权利要求1所述的一种微生物发酵制备无患子总皂苷的方法，其特征在于所述的皂苷粉末经喷雾干燥得到。
7.根据权利要求6所述的一种微生物发酵制备无患子总皂苷的方法，其特征在于所述的H2O2浓度为30%，脱色温度为60 °C，脱色时间为2~4h。
【专利摘要】本发明涉及无患子总皂苷的提取纯化方法，尤其涉及一种微生物发酵制备无患子总皂苷的方法，主要工艺步骤为：将干燥后的无患子果皮粉碎后，在25~80℃的温度下加水浸提l~24h。先后接种含量为1％~10％的经驯化后的黑曲霉和酵母菌，在20~37℃的温度下发酵2~30d，利用微生物发酵水提液中的糖类、蛋白质等营养成分，皂苷含量保持基本不变，上清液浓缩后用H2O2进行脱色处理，离心、喷雾干燥得皂苷粉(纯度大于50%)，本发明为无患子总皂苷提取纯化提供一种成本低廉、工艺便捷、绿色环保、纯度较高且稳定的新方法，所得皂苷可直接用于各种洗护用品和化妆品中。
【IPC分类】A61K8-97, A61K36-77
【公开号】CN104800110
【申请号】CN201510085953
【发明人】王珊珊, 陈登龙, 李敏, 黄秀萍, 刘金玲, 王勇
【申请人】福建师范大学泉港石化研究院
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年2月23日