良好，对于研宄纳米材料与生物效应方面，提供材料和技术上的保证，无论基础研宄或临床应用，均具有重要的意义。
【附图说明】
[0034]图1是荧光碳纳米颗粒(FCNs)/siRNA球形核酸的合成过程示意图。
[0035]图2是荧光碳纳米颗粒的理化性质表征，其中，(A)为荧光碳纳米颗粒的红外光谱图；(B)为荧光碳纳米颗粒的高清透射电镜(HR-TEM)图；(C)为荧光碳颗粒在白光和紫外光照射下的图片。
[0036]图3是MDA-MB-231-EGFP、A375细胞分别和荧光碳纳米颗粒共孵育后的细胞毒性测试。
[0037]图4是标准曲线法分析荧光碳纳米颗粒负载核酸能力；其中，(A)表示激发光为670nm时的荧光强度vs.Cy5_siRNA浓度，Excel软件线性拟合，R2= 0.999 ； (B)表示405nm时的吸光值vs.FCNs的浓度，Excel软件线性拟合，R2= 0.9974。
[0038]图5是纳米颗粒在MDA-MB-231-EGFP细胞中的转染情况；其中，㈧表示不同siEGFP组分处理后的荧光图片:a.阴性对照；b.FCNs ；c.siEGFP ；d.FCNs/Scrambledsequence(FCNs/ 随机序列)；e.Lipo2000/siEGFP ；f.FCNs/siEGFPl ；g.FCNs/siEGFP2 ；h.FCNs/siEGFP3，其中，比例尺表示200 ym ;第一行和第三行表示相差模式下的图片，第二行和第四行表示荧光模式下的图片；(B)表示不同组分处理后的EGFP的表达情况，其中，siEGFP, FCNs/随机序列和 Lipo2000/siEGFP 对应的 siRNA 浓度是 150nM ；FCNs/siEGFP I, FCNs/siEGFP2 和 FCNs/siEGFP3 对应的 siEGFP 浓度分别是 50nM，10nM 和 150nM(n=3) ο
[0039]图6是不同的siPlk-Ι组分对A375细胞的影响情况；其中，(A)表示荧光定量PCR测定不同siPlk-Ι组分处理后的Plk-1mRNA水平，Plk-1mRNA的表达水平对GAPDH mRNA表达水平进行归一化处理。数据为三次独立转染实验的结果，对FCNs/随机序列组进行显著性差异分析，**ρ〈0.01，***ρ〈0.001 (η = 3) ； (B)Western blot 分析不同 siPlk-1 组分中Plk-1蛋白的表达情况；(C)表示不同siPlk-Ι组分处理后诱导A375细胞凋亡的情况，其中，siRNA浓度都是ΙΟΟηΜ。
[0040]图7是FCNs/Cy5-siPlk_l的细胞摄入和共定位，其中，A375细胞与FCNs/Cy5-siPlk-l共孵育4h，激发波长:FCNs 405nm和Cy5633nm ；比例尺表示20 μ m。
[0041]图8是流式细胞仪测定细胞对Cy5_标记siPlk_l的摄入率，其中，细胞与Cy5-siPlk-l 或 FCNs/Cy5_siPlk_l 孵育 4h 后的结果。
[0042]图9是FCNs/siPlk-Ι用于抑制荷瘤小鼠肿瘤的结果，其中，⑷表示注射不同的siPlk-Ι组分后，从荷瘤小鼠上取出的肿瘤图片；(B)表示肿瘤体积随时间变化情况，肿瘤体积归一化为第16天时的百分比(每一实验组的平均值土标准差)；(C)表示体重随时间变化情况，小鼠体重归一化为第16天时的百分比(每一实验组的平均值土标准差)。
[0043]图10是FCNs/Cy5-siPlk-l复合物经尾静脉注射荷瘤小鼠24h后，小动物成像仪成像的结果。
【具体实施方式】
[0044]为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
[0045]图1是荧光碳纳米颗粒(FCNs)/siRNA球形核酸的合成过程示意图。
[0046]实施例1:荧光碳纳米颗粒(FCNs)的制备及分离纯化
[0047](I)荧光碳纳米颗粒(FCNs)的制备:
[0048]以低分子量壳聚糖为原料，采用水热合成法得到具有良好荧光特性的碳纳米颗粒，其制备方法为:称取0.35g的低分子量壳聚糖加入到70mL的去离子水中同时充分搅拌，然后置于密闭容器(高压釜)中反应12h，温度为180°C。
[0049](2)荧光碳纳米颗粒(FCNs)的分离纯化:
[0050]将所得的产品溶液在高速台式冷冻离心机(14000rpm)中离心lOmin，然后用透析袋(截留分子量100Da)处理除去小分子物质，透析时间为2d。
[0051]实施例2:荧光碳纳米颗粒(FCNs)的性质表征
[0052](I)荧光碳纳米颗粒的傅立叶红外光谱
[0053]图2A为荧光碳纳米颗粒的红外光谱图，由图2A可以看出，实施例1制备所得的荧光碳纳米颗粒在1660?1580左右有N-H伸缩振动吸收峰。
[0054](2)荧光碳纳米颗粒的高清透射电镜表征
[0055]图2B为荧光碳纳米颗粒的高清透射电镜表征图，由图2B可以看出，荧光碳纳米颗粒的粒径为11.83±2.22nm，且粒径分布比较均匀，单分散性较好。
[0056](3)荧光碳纳米颗粒的成像
[0057]图2C为荧光碳颗粒在白光和紫外光照射下的图片，由图2C可以看出，荧光碳纳米颗粒在白光照射下，呈现棕黄色；在紫外光照射下，激发出强烈的蓝色荧光。
[0058]实施例3:荧光碳纳米颗粒(FCNs)的细胞毒性测试
[0059]将MDA-MB-231和A375细胞，按5000/孔的密度到96孔板中，置于5% C02，37°C培养箱中孵育 24ho 加入浓度分别为 O，10，20，50，80，100，150，200，250，300 和 350 μ g/mL 的荧光碳纳米颗粒(FCNs)。每个浓度5个复孔。48h后，吸去培养液，每孔加入换上新鲜配制的200 μ L浓度为5mg/ml的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)溶液，继续培养4h后，吸去孔内培养液，每孔加入200 μ L 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪0D490nm处测量各孔的吸光值。
[0060]由图3可以看出:荧光碳纳米颗粒毒性较低，甚至浓度高达350 μ g/mL，细胞的存活率也超过80 %。这就为荧光碳纳米颗粒在生物医学中的应用提供了前提条件。
[0061]实施例4:荧光碳纳米颗粒(FCNs)与siRNA结合形成球形核酸
[0062](I)荧光碳纳米颗粒(FCNs)的活化
[0063]将双功能偶联剂Ν-[γ -马来酰亚胺]磺基琥珀酸酯(N- [ γ -maleimidobutyryloxy] sulfosuccinimide ester，sulfo-GMBS)与 FCNs 震荡反应12h，超滤离心洗涤，除去未反应完的偶联剂，收集活化的FCNs。
[0064](2)巯基化siRNA的激活
[0065]取50 μ L 0.1M的二硫苏糖醇(DTT)，加入到50 μ g巯基化的siRNA中，混匀后室温静置2h，利用尺寸排阻柱(S印hadex?G-2roNA Grade)除盐，纯化，收集样品。
[0066](3)荧光碳纳米颗粒(FCNs)与巯基化siRNA结合
[0067]将除盐处理后的巯基化siRNA与碳纳米颗粒混合，在4h以上的时间内缓慢加入3M的NaCl至0.3M，震荡反应12h后，形成荧光的球形核酸体系，超滤离心，洗涤多次，收集产物。
[0068]实施例5:荧光碳纳米颗粒(FCNs)的负载能力测试
[0069]荧光碳纳米颗粒(FCNs)的负载能力可通过标准曲线法测定。将DTT还原后纯化所得的Cy5-siRNA制备成浓度分别为0，0.01，0.02，0.04，0.08，0.16mg/mL的溶液，各取100 μ L滴加到黑底96孔板中，测定其在激发波长为650nm，发射波长为670nm处的荧光强度，并绘制标准曲线(如图4A)。取100 μ L制备好的FCNs/Cy5-siRNA滴加到黑底96孔板中，多功能酶标仪测定其荧光强度为33069，可计算出Cy5-siRNA浓度为0.072mg/mL。将FCNs制备成0，0.25，0.5，1，2，4mg/mL的溶液，各取100 μ L滴加到透明96孔板中，测定其在405nm时的吸光度，并绘制标准曲线(如图4B)。取100 μ L制备好的FCNs/Cy5-siRNA滴加到透明96孔板中，多功能酶标仪测定其吸光值为0.434，可测得FCNs浓度为3.147mg/mL。通过负载能力(Loading capability (LC))计算公式:LC = FCNs的浓度/Cy5_siRNA的浓度，可计算出LC为43.71。
[0070]实施例6:荧光碳纳米颗粒(FCNs) /siRNA用于沉默靶基因
[0071](I)增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的沉默
[0072]将靶向EGFP 的 FCNs/siRNA复合物(FCNs/siEGFP)与稳转EGFP质粒的MDA-MB-231细胞共孵育48h后，倒置荧光显微镜观察沉默情况。与对照组(siEGFP，FCNs/随机序列orLipo2000/siEGFP)相比，FCNs/siEGFP的沉默效果明显。将细胞裂解后，HOOOrpm高速离心，取上清，多功能酶标仪测定荧光情况。其中的蛋白浓度可通过BCA试剂盒测定。EGFP的表达情况可表示为相对焚光强度(Relative light units，即RLU)对总蛋白浓度的归一化处理值，即RLU/mg蛋白。其中，针对EGFP进行双链设计的siRNA为:
[0073]正义链:5，-Th11-ACCCUGAAGUUCAUCUGCACC-3，；
[0074]反义链:5’ -UGCAGAUGAACUUCAGGGUCA-3 ’。
[0075](上述引入参考文献:Afonin, K.A.；Viard, M.；Martins, A.N.；Lockett, S.J.；Maciag, A.E.；Freed, E.0.；Heldman, E.；Jaeger, L.；Blumenthal, R.；Shapiro, B.A.Nat.Nanotechnol.2013, 8:296-304.)
[0076]图5A是siEGFP的不同组分转染MDA_MB_231后，荧光显微镜观察的图片，FCNs/siEGFP相比其他组，能最有效地抑制EGFP的表达。图5B可定量测