定EGFP的表达情况，FCNs/siEGFP可下调EGFP表达量是阳性对照Lipo2000/siEGFP的5倍以上。
[0077](2)Plk_l基因的沉默
[0078]将靶向Plk-1 的 FCNs/siRNA 复合物(FCNs/siPlk-Ι)分别与 A375 和 A375 细胞共孵育48h后，提取细胞的总RNA，反转录生成cDNA。以cDNA为模板，在引物5’ -AGCCTGAGGCCCGATACTACCTAC-3，(PIk-1-forward), 5?-ATTAGGAGTCCCACACAGGGTCTTC-3? (Plk-1-reverse)的存在下扩增。
[0079]以“看豕”基因GAPDH为内参，引物序列为:
[0080]Forward:5，-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3，；
[0081 ] Reverse:5，-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3，。
[0082] 图6A表示荧光定量PCR检测基因和内参基因的表达量。与阴性对照组(PBS)相比，单独的siPlk-Ι或FCNs/随机序列并没有明显的沉默效果。作为阳性对照Lipo2000/siPlk-Ι中Plk-1mRNA水平相对于FCNs/随机序列只下调了 44%。相比之下，当FCNs/siPlk-Ι中，Plk-1mRNA的表达量则下调了 80%。这比阳性对照Lipo2000/siPlk_l要高出很多。
[0083]Western blot用于分析Plk_l蛋白的变化情况。转染48h后的细胞先用4°C的PBS缓冲液洗涤三次，然后加入新鲜配制含有Roche’s蛋白酶抑制剂的50 μ L裂解液(50mM HEPES, pH 7.5，150mM NaCl, 1% Triton X-100，10% glycerol, 1.5mM MgCl2 和 ImMEGTA)。所有的裂解液经SDS凝胶电泳处理后，采用1:1000稀释的Plk-1 —抗(RabbitmAb#4513, Cell Signalling Technology)进行免疫印迹实验。从图6B可见，对照组中(NC，FCNs，单纯的siPlk-1，FCNs/随机序列和阳性对照Lipo2000/siPlk_l)，Plk-1蛋白的下调不明显，而FCNs/siPlk-Ι中，条带灰度值大约为FCNs/随机序列的1/500。荧光定量PCR和Western blot的结果都表明，FCNs/siPlk-Ι能有效地沉默目标基因。
[0084]从图6C可以看出，Plk-1蛋白的表达的抑制会引起细胞的凋亡，通过测试了 FCNs/siPlk-Ι诱导细胞凋亡的效果，以A375细胞为模型，转染后48h，流式细胞仪测得，30%以上的细胞处于凋亡状态。
[0085]针对Plk-1进行双链设计的siRNA为:
[0086]正义链:5，-Th1l-UGAAGAAGAUCACCCUCCUUAdTdT-3，；
[0087]反义链:5，-UAAGGAGGGUGAUCUUCUUCAdTdT-3，。
[0088](参考文献:Sun’T.M.；Du, J.Z.；Yao, Y.D.；Mao, C.Q.；Dou, S.；Huang, S.Y.；Zhang, P.Z.；Leong, K.ff.；Song, E.ff.；ffang, J.ACS Nano 2011, 5:1483-1494.) o
[0089]实施例7:细胞对FCNs/siPlk-Ι的摄入和共定位
[0090]按前面的合成方法，FCNs结合Cy5标记的siPlk_l后，形成FCNs/Cy5_siPlk_l复合物。在Opt1-men低血清培养基中，配制含有Cy5-siPlk_l或FCNs/Cy5-siPlk_l的悬液(悬液中Cy5-siPlk-l浓度为10nM)。A375细胞作为模型细胞，按5 X 15/孔的密度种植在6孔板中。在5% CO2, 37°C培养箱中孵育24h后，吸去培养液，换上新配制的Cy5-siPlk_l或FCNs/Cy5-siPlk-l悬液，共孵育4h。之后，吸去转染液，PBS缓冲液洗涤3次，4%多聚甲醛固定15min。PBS缓冲液洗涤后，激光共聚焦显微镜(LSM 710 ；CarlZeiss, Germany)观察。FCNs的激发波长为405nm，Cy5的激发波长为633nm。
[0091]为定量测定细胞的摄入效率，将转染后的细胞经胰酶消化后，PBS缓冲液洗涤2次，200 μ L PBS缓冲液重悬。流式细胞仪测定Cy5阳性细胞的百分比。单纯Cy5-siPlk_l标记的细胞作为对照。
[0092]从图7的共聚焦图片可看到，FCNs/Cy5-siPlk-l与细胞共孵育4h后，大量的核酸复合物进入到细胞内。需要特别说明的是，这是在没有任何转染试剂的情况下实现的。通过流式细胞仪定量测定，由图8可以看出，超过99%的细胞摄入了核酸复合物，而作为对照的 Cy5-siPlk-l 或 Lipo2000/Cy5-siPlk_l 则分别为 0.51%和 3.39%。
[0093]实施例8:肿瘤抑制研宄
[0094]将体积为200 μ L，数量为3 X 16的A375细胞(人黑色素瘤细胞)皮下接种到周龄为6周的BALB/c雌性小鼠。当肿瘤长成体积约为10mm3时，小鼠被随机分到6组中(分别标记为 PBS, FCNs, siPlk-1，FCNs/ 随机序列，Lipo2000/siPlk_l 和 FCNs/siPlk-Ι 组)，每组4只。从接种细胞后的第16d开始，隔日尾静脉注射以上组分。第32d，采用引颈处死法，处死所有小鼠。肿瘤体积的计算公式为V(mm3) = 0.5X lengthXwidth2。
[0095]从图9可看到，经过单独的PBS，FCNs及随机序列修饰的FCNs处理后，肿瘤的体积明显增加，与注射药物前相比，第30d时的肿瘤体积甚至可增大8倍。在个别情况下，注射siPlk-1或Lipo2000/siPlk-l能抑制肿瘤体积的增加，这表明它们在体内应用时疗效有限。出人意料的是，FCNs/siPlk-Ι能有效抑制肿瘤体积的增加(图9A，B)。而注射药物后，小鼠的体重只有轻微的减轻，反映出FCNs/siPlk-Ι在体内使用时，毒性较低(图9C)。
[0096]实施例9:FCNs/Cy5-siPlk-l的体内跟踪
[0097]将FCNs/Cy5-siPlk_l尾静脉注射到接种A375细胞30d的BALB/c小鼠中。24h后，麻醉小鼠。小动物成像仪观察FCNs/Cy5-siPlk-l在体内的分布情况。
[0098]从图10可知，FCNs/Cy5-siPlk_l能在肿瘤部位聚集，这就为抑制肿瘤提供了可能性。
[0099]申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
【主权项】
1.一种可视化球形核酸，其特征在于，所述可视化球形核酸包括荧光碳纳米颗粒内核和结合在其表面的寡核苷酸。
2.根据权利要求1所述的可视化球形核酸，其特征在于，所述荧光碳纳米颗粒内核为表面氨基化的荧光碳纳米颗粒； 优选地，所述焚光碳纳米颗粒的粒径小于20nm。
3.根据权利要求1或2所述的可视化球形核酸，其特征在于，所述寡核苷酸为巯基化修饰的核酸；优选地，所述寡核苷酸为siRNA或反义DNA。
4.根据权利要求1-3任一项所述的可视化球形核酸的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (1)制备荧光碳纳米颗粒； (2)将寡核苷酸进行巯基化修饰； (3)以步骤(I)得到的荧光碳纳米颗粒作为内核，表面结合步骤(2)的寡核苷酸，得到可视化球形核酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(I)所述制备荧光碳纳米颗粒包括:以氨基类化合物为原料，采用水热合成法得到荧光碳纳米颗粒； 优选地，所述氨基类化合物为碳水化合物与聚醚酰亚胺的混合物、壳聚糖或丝蛋白中的任意一种或至少两种的混合物，优选为壳聚糖。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述巯基化修饰采用过硫化钠、盐酸硫醇亚胺或硫代硫酸钠中的任意一种或至少两种的混合物进行，优选为盐酸硫醇亚胺。
7.根据权利要求4-6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (1)将壳聚糖加入到去离子水中，同时充分搅拌，然后置于密闭容器中反应，将所得产品溶液离心，然后用透析袋处理，除去小分子物质，得到的上清液即为荧光碳纳米颗粒； (2)将siRNA或反义DNA进行巯基化修饰； (3)将步骤(I)的荧光碳纳米颗粒进行活化:采用偶联剂与荧光碳纳米颗粒震荡反应12h，超滤离心洗涤，除去未反应完的偶联剂，收集活化的荧光碳纳米颗粒； (4)将步骤⑵巯基化修饰的siRNA或反义DNA进行激活:取50μ L 0.1M的二硫苏糖醇，加入到50 μ g巯基化的siRNA或反义DNA中，混匀后室温静置2h，除盐，纯化，收集样品； (5)将步骤(3)的荧光碳纳米颗粒与步骤(4)的巯基化siRNA或反义DNA结合:将除盐处理后的巯基化siRNA或反义DNA与荧光碳纳米颗粒混合，在4h以上的时间内加入浓度为3M的NaCl至浓度为0.3M，震荡反应12h后，形成荧光的球形核酸，超滤离心，洗涤多次，收集产物。
8.根据权利要求1-3任一项所述的可视化球形核酸在生物标记或药物递送中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种基于荧光碳纳米颗粒的可视化球形核酸及其制备方法和应用。本发明的可视化球形核酸包括荧光碳纳米颗粒和结合在其表面的寡核苷酸。本发明通过采用一步反应法获得了具有良好荧光特性的碳纳米颗粒，然后再将其与寡核苷酸结合制备得到可视化球形核酸体系，该方法不仅简化了制备工艺，而且，在不需要任何其他转染试剂的情况下，该可视化球形核酸可高效地将核酸递送到细胞内，提高了细胞摄入率和转染效率，具有重要的应用价值。
【IPC分类】C12N15-11, A61P35-00, A61K48-00, C12Q1-68, A61K49-00, A61K31-7088
【公开号】CN104800859
【申请号】CN201510141912
【发明人】蒋兴宇, 张灵敏, 郑文富, 靳钰
【申请人】国家纳米科学中心
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年3月27日