MSA/mL)和0.188 mL三乙胺加入到在250 mL三口烧瓶中，60 °C水浴下搅拌4 h，然后加入50 mL乙醇，超声30 min，进行磁分离，除去上清留沉淀，重复磁分离二次。用25%的四甲基氢氧化铵调pH值为10，透析24 h，最后用I M的盐酸将其pH调至中性；
(2)取G0-C00HI mL (I mg ι?Γ1)，超声30 min后，加入两端带有氨基的PEG水溶液
1mL (10 mg ml/1)，再超声30 min，室温搅拌下，加入EDC 0.5 mL (10 mg ml/1)，继续搅拌
2h，再次加入EDC I mL (10 mg mL-1)，继续搅拌10 h。13 000 rpm离心I h，弃去沉淀，将上清用100 kDa的超滤管超滤。将截留的GO-PEG用三次水超声分散。利用红外光谱表征了所制备的GO和PEG修饰的G0，通过光谱对比证明PEG对GO的成功的进行了修饰(图3)。GO-PEG的红外光谱中在2918 cnT1和2874 cnT1处均出现非常明显的峰，归属为亚甲基的伸缩振动，由于GO本身在该处吸收峰不明显，所以这个亚甲基的峰来源于PEG。此外，在GO-PEG的红外光谱中，1460 cnT1处有一明显的峰，该峰归属于酰胺键的伸缩振动。
[0023]实施例2
(1)DMSA-Fe3O4纳米粒子水溶液(0.5 mg mL—1)用三乙胺调pH值为8.0，加入120 mgEDC和PEG-GO水溶液(1.79 mg mL—1)，室温下搅拌16 h，然后13 000 rpm离心，用三次水洗涤沉淀，重复三次，即可得到用Fe3O4磁性纳米粒子-GO复合材料(Fe 304_PEG_G0)。如图2所示，GO的大小为几十到几百个纳米的很薄的片状结构，磁性纳米粒子更多的接在GO片层边缘处，并形成了聚集体；
(2)将抗癌药物阿霉素(Doxorubicin，D0X)和Fe3O4-PEG-GO混合，使GO吸附阿霉素24 h，然后利用透析袋(截留分子量8 000-14 000)进行透析，透析液为pH 7的PBS，透析48 h，其间每隔12 h换液一次，制得Fe3O4-PEG-GCVDOX磁性纳米复合材料；
(3)通过物理吸附的方式，将DOX吸附到Fe3O4-PEG-GO磁性纳米复合材料上。对其进行紫外可见光谱表征，结果如图4所示。DOX在490 nm处有明显的吸收峰，Fe3O4-PEG-GO吸附DOX后，也出现了 DOX的吸收带，但最大吸收峰明显红移，表明阿霉素已成功地装载到了Fe3O4-PEG-GO 上。
[0024]实施例3
(1)在96孔细胞培养板中培养HeLa细胞，每孔细胞密度大约为5000个，在CO2浓度为5%的37 °C培养箱中培养24 h ；
(2)除去上清，在各孔中分别加入含铁浓度为0.25 μg mL'0.5 μg mL'l μg mL'2I^g mL—1的Fe 304-PEG_G0/D0X磁性纳米复合材料的100 μ?的新鲜1640细胞培养液(每孔重复3个)，孵育24 h ；
(3)每孔加10μ?的WST溶液，置37°C细胞培养箱中孵育2 h，使用酶标仪在490 nm处检测各孔的紫外吸收值；
(4)Fe304-PEG-G0/D0X磁性纳米复合材料对细胞的WST分析如图5所示。Fe3O4-PEG-GO/DOX磁性纳米复合材料在铁含量浓度为20 μg mL—1时，即阿霉素的浓度为I Pg mL—1时，对HeLa细胞具有明显毒性，当铁浓度达到40 μg mL—1，阿霉素的浓度为2 μg mL—1时，细胞的相对存活率为76%，存在显著性差异，证明了复合材料对肿瘤细胞具有一定的杀伤能力。
[0025]实施例4
(1)在6孔细胞培养板中培养HeLa细胞，每孔细胞密度大约为IX 16个细胞，并补足每孔2 mL的培养液，在CO2浓度为5%的37 °C培养箱中培养24 h ；
(2)除去上清，在孔中分别加入含有铁浓度为2.5 μg mL'5 μg mL'10 μg mL'20 μgmL'40 μg mL—1的Fe 304-PEG_G0/D0X磁性纳米复合材料的2 mL的新鲜培养基，孵育24 h ；
(3)除去上清培养液，并用含有10%胎牛血清的1640细胞培养液，将6孔板2个孔中的细胞收集到1.5 mL离心管中，离心收集细胞，用PBS洗三次，收集细胞加入核磁管用，1%琼脂糖进行凝固，进行细胞MRI成像；
(4)所用MRI 成像设备为 11.7 T Bruker micro2.5 micro-MRI system，米用多片多回波序列(MSME)，图像为其对应的T2加权影像，实验参数:TR=2500 ms,matrix=128X 128，F0V=20X20 cm，slice thickness=l mm;
(5)结果如图6所示。可以发现，磁性纳米材料与HeLa细胞孵育后，当材料铁浓度为10 Pg/mL时，可以获得很好的细胞MRI成像。
【主权项】
1.一种具有肿瘤磁靶向、T2模式成像、化学治疗的Fe 304-PEG-G0/D0X纳米复合材料，其特征在于:为了增加其水溶性，通过EDC化学在GO表面键合氨基化的PEG衍生物，获得GO-PEG0
2.取GO-COOH水溶液，加入两端带有氨基的PEG水溶液，再超声30min，室温搅拌下，加入EDC，继续搅拌2 h，再次加入EDC，继续搅拌10 h。
3.13 000 rpm离心I h，弃去沉淀，将上清用100 kDa的超滤管超滤。
4.一种如权利要求1所述的具有肿瘤磁靶向、T2模式成像、化学治疗的Fe304-PEG-G0/D0X纳米复合材料的制备方法，其特征在于:选用10 nm Fe3O4磁性纳米粒子的正己烷溶液加入含有DMSA的丙酮溶液，60 °C水浴下搅拌4 h，然后加入2倍体积的乙醇，超声30 min，进行磁分离，除去上清留沉淀，重复操作2次。
5.根据权利要求2所述的一种具有肿瘤磁靶向、T2模式成像、化学治疗的Fe3O4-PEG-GCVDOX纳米复合材料的制备方法，其特征在于！DMSA-Fe3O4纳米粒子水溶液加入EDC和GO-PEG水溶液，室温下搅拌16 h，然后13 000 rpm离心，用三次水洗涤沉淀，重复三次。
6.根据权利要求3所述的一种具有肿瘤磁靶向、T2模式成像、化学治疗的Fe3O4-PEG-GCVDOX纳米复合材料的制备方法，其特征在于:将抗癌药物阿霉素DOX和Fe3O4-PEG-GO混合，使GO吸附阿霉素24 h，然后透析除去过量的D0X。
7.根据权利要求4所述的一种具有肿瘤磁靶向、T2模式成像、肿瘤治疗的Fe3O4-PEG-GCVDOX纳米复合材料在作为抗肿瘤药物载体中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种对肿瘤能够实现诊断与治疗的多功能纳米粒子。常温常压下，将羧基化Fe3O4磁性纳米粒子水溶液与氨基化PEG化修饰的氧化石墨烯（GO）水溶液混合，在EDC缩合条件下，制备了具有良好生物相容的磁性氧化石墨烯纳米材料。又通过π-π堆垛作用将水难溶性芳香结构的抗癌药物阿霉素（DOX）负载到Fe3O4-PEG-GO上，制备出抗肿瘤、成像和生物相容性于一体的Fe3O4-PEG-GO/DOX磁性纳米粒子，利用MRI结合其他检测手段研究抗癌药物肿瘤治疗效果，获得抗癌药物对肿瘤的治疗效果，为构建新型肿瘤纳米药物诊疗平台提供新的方法和途径。
【IPC分类】A61K49-08, A61K47-04, A61K9-14, A61P35-00, A61K31-704, A61K47-48
【公开号】CN104815337
【申请号】CN201510242930
【发明人】陈卫红, 郑秀文, 甄国荣
【申请人】临沂大学
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年5月14日