一种peg修饰的磁性氧化石墨烯的制备及其抗肿瘤活性的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及纳米材料制备及其生物应用领域，特别涉及一种具有肿瘤磁靶向、T2模式成像、肿瘤治疗的材料制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002]诊疗学(Theranostics)，是指将诊断和治疗集成一个材料体系，在过去几年里，这个新兴生物医学领域的研宄获得了越来越多的广泛关注。超顺磁性Fe3O4纳米粒子本身作为常用的T2磁共振成像对比剂，也可以用于热疗以及药物载体，是构建纳米诊疗平台的最佳载体之一。Fe3O4磁性纳米粒子以三维聚集体的形式存在要比单分散性的磁性纳米粒子呈现出更高的弛豫率，从而能够提高MRI成像效果。氧化石墨烯(GO)是由石墨经化学氧化、超声剥离制备得到，其含有大量的含氧活性基团，如羰基、羧基、羟基和环氧基等。环氧基与羟基基主要位于GO的基面上，而羰基和羧基则通常分布于GO的边缘处。这些含氧基团的存在使得GO具有良好的生物相容性和水溶液稳定性，且易于功能化修饰。氧化石墨烯的Sp2离域电子体系以及含氧基团的的结构特性使其可以通过化学键，π-π相互作用，离子键以及氢键等非共价键作用实现化疗药物或基因的装载。基于此，我们通过共价偶联的方法，将羧基修饰的Fe3O4磁性纳米粒子连接到GO表面，形成了 Fe 304纳米粒子的聚集体，该磁性复合材料具有良好的生物相容性，更重要的是，与单分散的Fe3O4纳米粒子相比，前者具有更高的MRI T2弛豫时间，可以有效改善MRI成像效果。近年来GO和磁性纳米粒子的复合材料的制备以及其在材料化学、生物医学等领域的应用研宄发展迅速。磁功能化的GO复合材料因其具有磁介导的靶向载药，MRI等应用而备受瞩目。与单分散的Fe3O4纳米粒子相比，组装在GO表面的Fe3O4纳米粒子T2弛豫率显著提高，有利于改善生物MRI成像效果。GO上含有大量的含氧活性基团，因此具有良好的生物相容性和水溶液稳定性。同时，GO比表面积巨大，具有在氧化过程中尚未完全破坏的残留芳香体系，使其对不溶于水的芳香类药物分子表现出超强的吸附能力，考虑到Fe3O4纳米粒子和氧化石墨烯的上述特点，我们设计、合成了 Fe3O4纳米粒子-氧化石墨稀(Fe 304-G0)复合体系，目的是利用GO可控装载抗肿瘤药物，同时，利用磁性纳米粒子实现该多功能药物系统的磁靶向输运及生物MRI成像功能。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是提供一种实现磁靶向、T2模式成像诊断、肿瘤治疗的特异性诊疗功能纳米粒子及其制备方法，该方法操作简单、反应条件温和，Fe3O4纳米粒子-氧化石墨烯(Fe3O4-GO)复合体系抗肿瘤效果好，具有靶向肿瘤功能，且具有T2模式成像的特性。
[0004]本发明的一种一种PEG修饰的磁性氧化石墨烯的制备及其抗肿瘤活性，所述复合材料通过π-π吸附作用将DOX偶联到复合材料表面，合成复合材料集靶向、成像诊断和治疗一体的具有生物相容性的诊疗功能。
[0005]本发明的一种具有成像功能的复合材料的制备方法，包括:
选用75 mL Fe3O4磁性纳米粒子的正己烷溶液、75 mL DMSA的丙酮溶液(1.5 mg DMSA/mL)和0.188 mL三乙胺加入到在250 mL三口烧瓶中，60 °C水浴下搅拌4 h，然后加入50mL乙醇，超声30 min，进行磁分离，除去上清留沉淀，重复磁分离二次。用25%的四甲基氢氧化铵调PH值为10，透析24 h，最后用盐酸将其pH调至中性。
[0006]GO的PEG修饰简述如下:取G0-C00H I mL (I mg ml/1)，超声30 min后，加入两端带有氨基的PEG水溶液I mL (10 mg mL—1)，再超声30 min，室温搅拌下，加入EDC 0.5 mL(10 mg mL—1)，继续搅拌 2 h，再次加入 EDC I mL( 10 mg mL—1)，继续搅拌 10 h。13 000 rpm离心I h，弃去沉淀，将上清用100 kDa的超滤管超滤。将截留的GO-PEG用三次水超声分散。
[0007]DMSA-Fe3O4纳米粒子水溶液(0.5 mg mL ^1)用三乙胺调pH值为8.0，加入120 mgEDC和PEG-GO水溶液(1.79 mg mL—1)，室温下搅拌16 h，然后13 000 rpm离心，用三次水洗涤沉淀，重复三次，即可得到用Fe3O4磁性纳米粒子-GO复合材料(Fe 304_PEG_G0)。
[0008]将抗癌药物阿霉素(Doxorubicin，D0X)和Fe3O4-PEG-GO混合，使GO吸附阿霉素24 h，然后利用透析袋(截留分子量8 000-14 000)进行透析，透析液为pH 7的PBS，透析48 h，其间每隔12 h换液一次，制得Fe3O4-PEG-GCVDOX磁性纳米复合材料。
[0009]一种具有成像功能的复合材料的抗肿瘤活性实验的方法:
(I)利用WST细胞增殖抑制分析试剂盒评估纳米材料对细胞的毒性。当细胞在96孔板中长到50-60%时，加入不同量的Fe3O4-PEG-GCVDOX磁性纳米复合材料。孵育24 h后，WST-1被加入到样品孔和对照孔(未加纳米材料)中，37°C细胞培养箱内孵育2 h后，用酶标仪记录在490 nm处的吸收值。细胞的相对存活率等于(0D450样品/0D450对照)X 100%。
[0010]所述步骤(I)中所述Fe3O4-PEG-GCVDOX磁性纳米复合材料中DOX浓度为0.25、0.5、1、2 M-g/mlο
[0011]所述步骤(I)中PBS缓冲溶液的pH值为7。
[0012]步骤(2) Fe3O4-PEG-GCVDOX磁性纳米复合材料与肿瘤细胞孵育24 h，上清用PBS洗三次，收集细胞加入核磁管，进行细胞MRI成像。
[0013]所述步骤(2)中所述Fe3O4-PEG-GCVDOX磁性纳米复合材料中Fe浓度为2.5、5、10、20、40 M-g /ml ο
[0014]有益效果
(1)本发明通过多步合成法，合成Fe304-PEG-G0/D0X磁性纳米复合材料，制备方法操作简单、实验条件温和；
(2)本发明利用EDC化学缩合反应，将氨基化的PEG衍生物共价偶联到GO纳米材料，再将羧基化Fe3O4与氨基化的GO共价偶联，制备出Fe 304_PEG_G0复合材料，最后将抗癌药物负载到Fe3O4-PEG-GO复合材料，制备出集磁革El向、成像诊断和化疗一体的诊疗功能纳米探针；
(3)本发明中从细胞层次研宄Fe304-PEG-G0/D0X磁性纳米复合材料诊疗探针对肿瘤靶向、成像和治疗的可行性、选择性和特异性，提高微小病灶的检出率，获得肿瘤治疗及疗效评价的可视化信息。
【附图说明】
[0015]图1为制备的Fe3O4纳米材料的TEM图。
[0016]图2为制备的Fe3O4-PEG-GO纳米材料的TEM图。
[0017]图3为制备的PEG-GO纳米材料的红外图谱。
[0018]图4为制备的Fe304-PEG-G0/D0X纳米材料的紫外可见吸收图谱。
[0019]图5为所得的Fe304-PEG-G0/D0X纳米材料对肿瘤细胞的WST细胞毒性检测结果图。
[0020]图6为所得的Fe3O4-PEG-GCVDOX纳米材料对肿瘤细胞的MRI检测结果图。
【具体实施方式】
[0021]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定
的范围。
[0022]实施例1
(1)选用75mL 10 nm Fe3O4磁性纳米粒子正己烧溶液(图1为Fe 304磁性纳米粒子的TEM),75 mL DMSA的丙酮溶液(1.5 mg D