本发明的非限制性水凝胶的表1、4和 5优于所有其它测试的嗜热菌蛋白酶制剂。这些其它制剂的初始活性小于目标量的85%， 并且一些最初甚至是目标量的0%。
[0115] 用于确定表1和表4-19中的水凝胶的嗜热菌蛋白酶活性（稳定性）的方法是 酪蛋白消化法：通过测量消化的酪蛋白片段在消化后相对于参考标准的吸光度增加来确 定嗜热菌蛋白酶活性。将嗜热菌蛋白酶水凝胶（250mg)溶解于25ml的TBS缓冲液（50mM Tris, IOOmM NaCl, 13. 5mM CaCl2, pH = 7. 4)中。在溶解后，使用 TBS 将溶液以 1:10 稀释。 使用嗜热菌蛋白酶原材料和TBS制备标准溶液，制备为一系列的浓度。底物是酪蛋白溶液 (2g于100mL磷酸盐缓冲液50mM Na2HPO4* )。消化程序如下：将2. 5ml酪蛋白溶液、1.0 ml 分析物或标准物在水浴中在37°C孵育30min。在消化后，添加终止溶液I. 5ml三氯乙酸 (TCA，30g于80ml DI水中）。制得如下的空白溶液：2. 5ml酪蛋白溶液、I. 5ml TCA和1.0 ml 分析物或标准物（在TCA后添加）。使样品在37°C保持45分钟，之后通过0. 45 μ m尼龙过 滤器（nylon filter)过滤并且在280nm进行分光光度法分析。
[0116] 通过使用三阶多项式曲线拟合来计算嗜热菌蛋白酶的标准曲线。使用标准曲线计 算嗜热菌蛋白酶在不同的储存条件下在每种制剂中的量。
[0117] 通过以下计算靶％ :
[0118] 靶％=(测试的活性单位/g制剂）*10(V(以mg表示的嗜热菌蛋白酶标准物的测 试的活性单位*制剂中的嗜热菌蛋白酶浓度，mg/g)。
[0119] 图2提供另外的嗜热菌蛋白酶稳定性测定，其中测试了来自表1的水凝胶并且使 其经受包括在4°C、室温（20°C到25°C )和40°C持续6个月、9个月、12个月、18个月和24 个月的储存条件。水凝胶在室温下稳定，如通过活性在6个月、9个月、12个月、18个月和 24个月降低小于20% (即，保持至少80%的活性）所示。类似地，水凝胶在4°C储存后稳 定24个月。当在40°C的升高温度下储存18个月时，大约55-60%的嗜热菌蛋白酶保持稳 定，并且当在40°C的升高温度下储存24个月时，40%的嗜热菌蛋白酶保持稳定一这等同于 水凝胶的长期贮存期/室温储存条件，因为使用升高的温度来证实给定产品在较短测试期 内的贮存期稳定性。这也解释了当在40°C储存时在24个月时稳定性损失的增加。
[0120] 实施例3
[0121] (猪烧伤伤口的体内清创）
[0122] 评价表2和表3中的水凝胶在对猪的烧伤伤口进行清创方面的功效。在该体内 研宄中，在猪的背部上产生烧伤伤口。将猪麻醉，用剪刀和剃刀剃光躯体，并且用vedadine 洗涤。然后进行异丙基冲洗以对手术区域进行灭菌。在每头猪的背部上产生20个2cm伤 口。使用在砂浴中加热到100°C的实心黄铜棒在皮肤上保持45秒来产生伤口。使伤口干 燥5日，给焦痂留出形成时间，在焦痂形成期间每隔一日更换保护性泡沫敷料。在焦痂形成 后，并且对于处理每日地，将伤口用盐水清洗，拍照，根据处理方案进行处理，并且用不粘敷 料（用盐水预先湿润）包扎，所述不粘敷料被Transpore胶带和封闭性第二敷料固定。利 用费雪精确检验（Fisher' s Exact test)来确定完全清创的焦痂数的统计学显著性。
[0123] 在焦痂形成后，用以下中的任一种一日一次地处理所有伤口 ：木瓜蛋白酶/尿素 软膏（具有2. 5 %木瓜蛋白酶和10 %尿素）；SANTYL胶原酶软膏；稀嗜热菌蛋白酶水凝胶 (表2);稠嗜热菌蛋白酶水凝胶（表3);或水凝胶安慰剂（即，缺乏嗜热菌蛋白酶的水凝 胶）。如图3中所示，在用表2和表3的嗜热菌蛋白酶水凝胶处理三日后，20%的伤口被完 全清创。在三日时间点，在用木瓜蛋白酶/尿素软膏或SANTYL胶原酶软膏处理后，没有伤 口被完全清除。在4日或5日后，在用表2和表3的嗜热菌蛋白酶水凝胶处理后，30-35% 的伤口被完全清创，而在用木瓜蛋白酶/尿素软膏处理后，仅5%的伤口被完全清创。在用 SANTYL胶原酶软膏处理5日后，没有伤口被完全清创。
【主权项】
1. 一种水凝胶，其包含： (a) 包括非离子型纤维素醚的亲水性胶凝剂；和 (b) 活性嗜热菌蛋白酶， 其中当在室温下储存6个月时，所述嗜热菌蛋白酶的蛋白水解活性不降低超过20%。2. 根据权利要求1所述的水凝胶，其中当在室温下储存6个月时，所述嗜热菌蛋白酶的 所述蛋白水解活性不降低超过10%。3. 根据权利要求1所述的水凝胶，其中当在室温下储存24个月时，所述嗜热菌蛋白酶 的所述蛋白水解活性不降低超过10%。4. 根据权利要求1-3中任一项所述的水凝胶，其中所述非离子型纤维素醚是羟烷基纤 维素醚。5. 根据权利要求4所述的水凝胶，其中所述羟烷基纤维素醚是羟乙基纤维素、羟丙基 纤维素或羟丙基甲基纤维素或其任一组合。6. 根据权利要求1-5中任一项所述的水凝胶，其包含0. 1 % w/w到10. 0% w/w或0. 1 % w/w到5% w/w的所述非离子型纤维素醚。7. 根据权利要求1所述的水凝胶，其中所述非离子型纤维素醚包含羟乙基纤维素，并 且其中所述水凝胶包含2. 5% w/w到4. 5% w/w的所述羟乙基纤维素。8. 根据权利要求1所述的水凝胶，其中所述非离子型纤维素醚包含羟丙基纤维素，并 且其中所述水凝胶包含〇. 01% w/w到10% w/w的所述羟丙基纤维素。9. 根据权利要求1所述的水凝胶，其中所述非离子型纤维素醚是羟丙基甲基纤维素， 并且其中所述水凝胶包含I. 5w/w到2. 5% w/w的所述羟丙基甲基纤维素。10. 根据权利要求1-9中任一项所述的水凝胶，其包含0. 1 % w/到5% w/w或0. 5% w/ 到1% w/w的所述嗜热菌蛋白酶。11. 根据权利要求1-10中任一项所述的水凝胶，其进一步包含具有7. 0到8. 0或约7. 5 的pH的缓冲液。12. 根据权利要求1-11中任一项所述的水凝胶，其中所述水凝胶具有15, OOOcps到 100, OOOcps的粘度，如利用Brookfield RV粘度计、具有小样品接头的转子14以IOrpm在 室温下以30秒读取所测量。13. 根据权利要求1-12中任一项所述的水凝胶，其中所述水凝胶进一步包含金属盐。14. 根据权利要求13所述的水凝胶，其中所述金属盐是氯化钠或氯化钙或其混合物。15. 根据权利要求1-14中任一项所述的水凝胶，其中所述水凝胶进一步包含防腐剂。16. 根据权利要求15所述的水凝胶，其中所述防腐剂是对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯 甲酸丙酯或苯氧乙醇、或其混合物。17. 根据权利要求1-16中任一项所述的水凝胶，其中所述嗜热菌蛋白酶在所述水凝胶 内溶解。18. 根据权利要求1-16中任一项所述的水凝胶，其中所述嗜热菌蛋白酶悬浮于所述水 凝胶内。19. 根据权利要求1-16中任一项所述的水凝胶，其中所述嗜热菌蛋白酶部分地溶解和 部分地悬浮于所述水凝胶内。20. -种对伤口进行清创的方法，其包括对需要清创的伤口局部施用根据权利要求 1-19中任一项所述的组合物。21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述伤口是慢性伤口。22. 根据权利要求21所述的方法，其中所述慢性伤口是糖尿病性足部溃疡、静脉性腿 部溃疡、动脉性腿部溃疡、褥疮性溃疡、淤积性溃疡、皮肤性溃疡、烧伤或压力性溃疡。23. 根据权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述伤口包括坏死组织。24. 根据权利要求23所述的方法，其中所述坏死组织是焦痂。25. -种用于使嗜热菌蛋白酶稳定的方法，其包括制备根据权利要求1-19中任一项所 述的水凝胶。
【专利摘要】本发明公开了一种水凝胶，所述水凝胶包含包括非离子型纤维素醚的亲水性胶凝剂和活性嗜热菌蛋白酶，其中当在室温下储存6个月时，所述嗜热菌蛋白酶的蛋白水解活性不降低超过20％。
【IPC分类】A61K38/48, A61P17/02, A61K47/02, A61K9/06, A61K9/00, A61K33/14, A61K47/38, A61K47/10
【公开号】CN104884079
【申请号】CN201380069305
【发明人】石磊, A·乔瓦诺维奇, D·卡森
【申请人】史密夫和内修公司
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2013年11月14日
【公告号】CA2890757A1, EP2919805A1, US20150283217, WO2014078581A1