一种麦胚凝集素修饰的苦参碱纳米粒制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药领域，特别是一种麦胚凝集素修饰的苦参碱纳米粒制备方法及其 应用。
【背景技术】
[0002] 结肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，在欧美国家肿瘤患者的死亡原因中位居第 二，在我国也逐渐呈高发趋势。如何将抗癌药物制成纳米粒并赋予它主动识别癌细胞的功 能，是药剂学界普遍关注度问题。ChunxiaWang等采用麦胚凝集素修饰紫杉醇纳米粒，研宄 其对结肠癌细胞CaCo-2和HT-29的增值活性影响，与普通紫杉醇纳米粒进行比较，结果表 明结肠癌细胞上糖蛋白对麦胚凝集素的表达水平高于正常结肠细胞。YingLiu等用戊二醛 法将麦胚凝集素（WGA)键合在蟾酥灵的脂质纳米粒上，采用体外法评价法研宄其与结肠癌 细胞株CaCo-2的作用，并与未经WGA修饰脂质纳米粒比较，发现前者可提高细胞对蟾酥灵 的吸收，提示可通过口服WGA修饰的脂质纳米粒提高药物的生物利用度。SakumaS报道， 包载荧光探针香豆素-6的纳米粒经花生凝集素修饰后，可识别结肠癌特异抗原，用于内窥 镜检查结肠癌的成像剂。CohenS研宄结果表明，将肿瘤靶向配体花生凝集素通过碳二亚 胺法与生物可降解荧光剂白蛋白制成的纳米粒结合后，利用其与结肠癌细胞特异亲和的特 性，采用NIR技术将其应用于结肠癌检查。大量癌变的结肠上皮细胞的细胞膜上和细胞顶 端胞浆内存在与麦胚凝集素结合位点；结肠癌HT-29细胞膜和细胞内蛋白上存在WGA可识 别的大量糖蛋白，而正常结肠细胞则明显缺乏这种糖蛋白。因此，凝集素对结肠癌细胞具有 特异亲和作用。综上所述，凝集素具有作为抗癌药物载体，用于结肠癌靶向治疗的可能性。
[0003] 苦参碱（Matrine，Mt)是从豆科植物苦参的干燥根中提取的主要生物碱之一，有 a-，0-，Y-，S-四种异构体，常见的为a-苦参碱，溶于水、氯仿、苯、乙醚等，略溶于石油 醚。属于四环的喹诺里西啶生物碱。研宄发现，Mt可显著抑制HT-29细胞的体外侵袭力， 其机制可能与下调HT-29细胞HSPE基因表达有关。同时还发现，Mt可诱导结肠癌SW1116 细胞凋亡，其机制可能与上调Fax和BaxmRNA表达有关。报道苦参碱体外可抑制人大肠癌 SW480细胞环氧化酶-2的表达，抑制SW620细胞增殖，诱导凋亡。因此，苦参碱是一个非常 有潜力的抗结肠癌药物。但目前关于苦参碱各类纳米粒的报道较多，如：氧化苦参碱胶束纳 米粒制备及其体外抗肿瘤活性研宄，《中国药业》2011年第15期；苦参碱纳米粒在小鼠体内 组织分布和药动学研宄，《中南药学》2010年第7期；苦参碱/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚 糖纳米粒子的制备及性能表征，《材料导报》2010年第6期；苦参碱聚氰基丙烯酸正丁酯纳 米粒冻干粉针剂的制备及体外释放，《中国医药工业杂志》2009年第6期；HPLC法测定苦参 碱白蛋白纳米粒的包封率，《药物分析杂志》2008年第1期；苦参碱固体脂质纳米粒的试制 及物相分析，《中国医药工业杂志》CS⑶2005年第4期；苦参碱固体脂质纳米粒的制备，《中 国实验方剂学杂志》2013年第19期；磁性聚乳酸-羟基乙酸氧化苦参碱纳米粒的制备及其 特性，《生物医学工程与临床》2012年第3期；氧化苦参碱聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的体 外释药及肝脏分布研宄，《中国药科大学学报》CSCD2010年第6期，但未见麦胚凝集素修饰 的苦参碱纳米粒的相关报道。
【发明内容】
[0004] 针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明的目的就是提供一种麦胚凝集素 修饰的苦参碱纳米粒制备方法及其应用，可有效解决麦胚凝集素修饰的苦参碱纳米粒的制 备及苦参碱靶向性低，使用效果差的问题。
[0005] 本发明的技术方案为：所述的麦胚凝集素修饰的苦参碱纳米粒是在苦参碱纳米粒 上通过化学键连接有麦胚凝集素，其制备方法包括以下步骤：
[0006] (1)制备苦参碱纳米粒（Mt-NPs):称取苦参碱（MT)0. 4-0. 6g，用水0.8-1. 2ml水 浴加热溶解，成苦参碱水溶液；称取聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA)O. 25-0. 3g，用18-22ml 丙酮水浴加热溶解，作为有机相；在1600r?mirT1转速搅拌下，将苦参碱水溶液滴注入 有机相中，形成初乳，以质量浓度为〇.46%的聚乙烯醇（?￥4)水溶液12〇-13〇1111作为水 相，在815r?mirT1转速搅拌下，将初乳注入水相中，继续搅拌2小时，挥去丙酮，在4°C、 40000r^化―1下离心lh，收集沉淀，沉淀用蒸馏水洗涤3次，一50°C预冻10h，升温至一 30°C 维持6h，再升温至一 20°C维持2h，最后升温至10°C维持3h，得干燥物，干燥物研磨成粉末 状，即为苦参碱纳米粒（Mt-NPs);
[0007] (2)制备麦胚凝集素修饰苦参碱纳米粒（WGA-Mt-NPS):取上述制备的苦参碱纳 米粒（Mt-NPs)用PBS溶液45-55ml溶解，将碳二亚胺（DEAC)O. 7g和N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)O. 03g，加入PBS溶液溶解成25ml，然后加入苦参碱纳米粒（Mt-NPs)的PBS溶液中， 搅拌均匀，室温下活化4h，4000r?mirT1离心lOmin，取上清液加入含麦胚凝集素（WGA)浓 度为0. 12mg/ml的PBS溶液25ml，4°C下孵化14h，4°C下40000r?mirT1离心lh，收集沉淀， 沉淀用蒸馏水洗涤3次，于一 50°C预冻10h，升温至一 30°C维持6h，再升温至一 20°C维持 2h，最后升温至1(TC维持3h，得干燥物，将干燥物研磨成粉末状，即为麦胚凝集素修饰苦参 碱纳米粒（WGA-Mt-NPS);
[0008] 所述的PBS溶液为pH值7. 2-7. 4的PBS溶液。
[0009] 所述的麦胚凝集素修饰的苦参碱纳米粒在制备抗结肠癌药物中的应用。
[0010] 本发明利用结肠癌细胞存在凝集素的结合位点及凝集素受体的表达，将麦胚凝集 素（WGA)修饰在苦参碱制成的纳米粒（NPS)上，使之与结肠癌细胞产生特异亲和作用，选择 性杀伤癌细胞并发挥长效作用，能够实现肿瘤特异性靶向，且制备的条件容易满足，原料来 源丰富，成本低，是肿瘤治疗药物上的创新。
【附图说明】
[0011] 图1为本发明不同浓度MT-NPS随时间变化对癌细胞增殖的抑制作用；
[0012] 图2为本发明不同浓度WGA-MT-NPS随时间变化对癌细胞增殖的抑制作用。
【具体实施方式】
[0013] 以下结合实施例对本发明的【具体实施方式】做详细说明。
[0014] 本发明在具体实施中可由以下实施例给出。
[0015] 实施例1
[0016] 本发明麦胚凝集素修饰的苦参碱纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
[0017] (1)制备苦参碱纳米粒（Mt-NPs):称取苦参碱（MT)0. 5g，用水1. 0ml水浴加热溶 解，成苦参碱水溶液；称取聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA)O. 279g，用20ml丙酮水浴加热 溶解，作为有机相；在1600r?mirT1转速搅拌下，将苦参碱水溶液滴注入有机相中，形成初 乳，以质量浓度为〇. 46%的聚乙烯醇（PVA)水溶液125ml作为水相，在815r?mirT1转速 搅拌下，将初乳注入水相中，继续搅拌2小时，挥去丙酮，在4°C、40000r?mirT1下离心lh， 收集沉淀，沉淀用蒸馏水洗涤3次，一 50°C预冻10h，升温至一 30°C维持6h，再升温至一 20°C维持2h，最后升温至1(TC维持3h，得干燥物，干燥物研磨成粉末状，即为苦参碱纳米粒 (Mt-NPs)；
[0018] (2)制备麦胚凝集素修饰苦参碱纳米粒（WGA-Mt-NPS):取上述制备的苦参碱 纳米粒（Mt-NPs)用PBS溶液50ml溶解，将碳二亚胺（DEAC)O. 7g和N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)O. 03g，加入PBS溶液溶解成25ml，然后加入苦参碱纳米粒（Mt-NPs)的PBS溶液中， 搅拌均匀，室温下活化4h，4000r?mirT1离心lOmin，取上清液加入含麦胚凝集素（WGA)浓 度为0. 12mg/ml的PBS溶液25ml，4°C下孵化14h，4°C下40000r?mirT1离心lh，收集沉淀， 沉淀用蒸馏水洗涤3次，于一 50°C预冻10h，升温至一 30°C维持6h，再升温至一 20°C维持 2h，最后升温至1(TC维持3h，得干燥物，将干燥物研磨成粉末状，即为麦胚凝集素修饰苦参 碱纳米粒（WGA-Mt-NPS)。
[0019] 实施例2
[0020] 麦胚凝集素修饰的苦参碱纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
[0021] (1)制备苦参碱纳米粒（Mt-NPs):称取苦参碱（MT)0. 4g，用水0. 8ml水浴加热溶 解，成苦参碱水溶液；称取聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA) 0. 26g，用18ml丙酮水浴加热溶 解，作为有机相；在1600r?mirT1转速搅拌下，将苦参碱水溶液滴注入有机相中，形成初乳， 以质量浓度为〇. 46%的聚乙烯醇（PVA)水溶液122ml作为水相，在815r?mirT1转速搅拌下， 将初乳注入水相中，继续搅拌2小时，挥去丙酮，在4°C、40000r?mirT1下离心lh，收集沉淀， 沉淀用蒸馏水洗涤3次，一 50°C预冻10h，升温至一 30°C维持6h，再升温至一 20°C维持2h， 最后升温至l〇°C维持3h，得干燥物，干燥物研磨成粉末状，即为苦参碱纳