胞密度为5*10 6个/孔的六孔板细胞 孔中直线匀速轻轻划过，显微观察可见宽度均匀的细胞划痕。拍照记录划痕后在各孔中分 别加入含0. 01~100yg/ml裂果馨总皂巧的培养基2ml，并设空白对照孔，24h后观察划痕变 化情况并拍照记录； 1. 2实验结果 细胞的迁移与扩散运动与微管蛋白的聚合解聚已及微管蛋白的形态维持相关，调控微 管蛋白的药物通过影响微管的功能降低细胞的迁移能力。图1中可见裂果馨总皂巧高剂量 组相比空白对照组，划痕无法愈合且相比2地前更宽。说明裂果馨总皂巧对细胞的迁移有 抑制作用，该效应通过作用于微管蛋白实现。
[0019] 2.裂果馨总皂巧对细胞克隆增殖的抑制作用 2. 1实验方法 将对数生长期的SMMC-7721消化稀释至200个/ml,每孔2ml接种于六孔板中，37°C、 5%C02培养箱中培养48h，换入含有0. 01~100yg/ml裂果馨总皂巧的培养基2ml，并设空白 对照孔，每剂量组设3个平行孔，培养4h后吸走含药培养基，PBS洗2次后加入普通培养基 2ml继续培养，每2d换液一次，6d后W吉姆萨染色法进行染色观察并对细胞集落计数，细胞 数小于200的集落不记入集落数中，相连的集落按1个集落计数； 2. 2实验结果
细胞的增殖与集落形成能力与微管相关，微管蛋白调控剂可通过调节微管功能降低细 胞的增殖与集落形成能力。由图2与表1可见，裂果馨总皂巧加药组细胞克隆数显著低于 空白对照组，且呈剂量依赖性。说明裂果馨总皂巧能够抑制肿瘤细胞的增殖与分裂，该效应 通过作用于微管蛋白实现。
[0020] 3.免疫巧光观察裂果馨总皂巧对微管形态的影响 3. 1实验方法 SMMC-7721细胞调整细胞密度约为3*105个/ml,每孔2ml接种于6孔板中，培养24h后弃去原培养基，加入含有0. 01~100yg/ml裂果馨总皂巧的培养基2ml，并设空白对照组， 继续培养2地，弃去培养基，PBS洗2次每次5min，加入lml4%多聚甲醒固定30min，PBS洗 2次每次5min，加入ImlO. 5%TritonX-100 (PBS配制）室溫通透20min，PBS洗3次每次 3min，吸干PBS后滴加山羊血清封闭液室溫封闭30min，按博±德试剂盒操作说明滴加一 抗化bulin-a鼠抗人多克隆抗体（1 :50)，4°C解育过夜，PBST洗涂3次，滴入二抗巧光 (門TC)标记（1 : 64)，37°C解育lh，PBST洗3次每次3min，抗巧光泽灭剂封片，避光，在 巧光显微镜下观察细胞并拍照； 3. 2实验结果 微管蛋白的正常形态是细胞功能的保证，微管蛋白调控剂可影响微管的功能使细胞形 态发生改变，微管蛋白的分布出现异常。由图3可见与空白对照组相比，裂果馨总皂巧作用 后的SMMC-7721细胞微管皱缩于细胞核周围，细胞呈圆形或梭形，正常细胞的微管W细胞 核为中屯、向外伸展平铺。可见裂果馨总皂巧可W调控微管蛋白的功能。
[0021] 4.微管聚合实验观察裂果馨总皂巧对微管蛋白聚合的影响 4.1微管蛋白的分离纯化 取SD大鼠（280±20g),迅速断头取脑，除去脑膜剪碎，MES缓冲液（MES0.Imol/L ，EGTA0.Immol/L，MgCl20.Imol/L，ATPl.Ommol/L，pH6. 5 )洗 2 次，4°C玻璃匀浆器匀 浆，4°C，10500g离屯、比，取上清，加入等体积聚合缓冲液（MES0.Imol/L，EGTAl.Ommol/ L，MgCl20. 5mmol/L，丙S醇 8.Omol/L，ATPl.Ommol/L,抑6. 5)，置于 37°C水浴内保溫 30min，同时振摇，再W26°C，10500g离屯、比，取沉淀，加入1/10匀浆体积的冷MES缓冲液揽 拌置冰浴30min，重复上诉低、高溫离屯、各一次。Lowry'S法测定蛋白含量； 4. 2裂果馨总皂巧对微管蛋白活性的作用 将微管蛋白放冰浴用MES缓冲液稀释加入96孔板中，加入裂果馨总皂巧或紫杉醇，对 照组不加药物；紫杉醇与裂果馨总皂巧终浓度均为2yg/ml，微管蛋白终浓度为2. 5mg/ml， 每孔终体积为200yL;加药后从冰浴上取出，迅速在酶标仪350nm处调定为0点，然后将96 孔板置于37°C水浴保溫，于不同时间点测定0D值，25min后，将比色杯置冰浴，随时测定0D 值。比较37°C保溫20min时0D值与冰浴lOmin后0D值； 4. 3实验结果 微管蛋白在由ATP供能的情况下，可在37°C发生聚合进而使吸光度增大，当从37°C转 移至冰浴时，微管蛋白聚合体可发生解聚使吸光度减小。正常的微管蛋白可完全的反复进 行运一过程，由图4可见，微管蛋白的吸光度-时间曲线在37°C上升直到稳定，冰浴后又降 低到0点。作用于微管蛋白的药物可破坏运一过程，图4中紫杉醇的曲线可见冰浴后0D值 下降很慢，是因为紫杉醇具有抗微管蛋白解聚的作用，因此在冰浴中微管蛋白仍保持聚合 状态。相比空白组与紫杉醇，裂果馨总皂巧在开始解育时曲线上升较慢，冰浴后出现与紫杉 醇类似的效应，说明裂果馨总皂巧具有干扰微管聚合与抗微管解聚的作用，证明裂果馨总 皂巧对微管蛋白具有调控作用。
【主权项】
1. 裂果薯总皂苷在制备以细胞微管为靶点的药物中的应用。2. 根据权利要求1所述的裂果薯总皂苷在制备以细胞微管为靶点的药物中的应用，其 特征在于：该药物对细胞的迀移起到抑制作用。3. 根据权利要求1所述的裂果薯总皂苷在制备以细胞微管为靶点的药物中的应用，其 特征在于：该药物对微管蛋白具有调控作用。4. 根据权利要求1所述的裂果薯总皂苷在制备以细胞微管为靶点的药物中的应用，其 特征在于：该药物具有干扰微管聚合与抗微管解聚的作用。5. 如权利要求1所述的裂果薯总阜苷，为裂果薯拉丁学名：Schizocapsa plantaginea Hance中提取的总皂苷成分和包含的各皂苷单体化合物成分。
【专利摘要】本发明属于医药领域，本发明公开一种从广西特色植物裂果薯（拉丁学名：Schizocapsa？plantaginea？Hance）的块茎中提取出的总皂苷在以细胞微管为靶点的药物中的应用。裂果薯总皂苷对细胞的迁移有抑制作用，能够抑制肿瘤细胞的增殖与分裂，裂果薯总皂苷具有干扰微管聚合与抗微管解聚的作用，对微管蛋白具有调控作用。裂果薯总皂苷的作用在肿瘤与血管、神经药物中有广泛的应用，是一种非常有价值的药物靶点；而且裂果薯总皂苷的植物来源为广西本地特有的植物品种，有较大的开发利用价值，有一定种植规模，廉价易得。
【IPC分类】A61P35/00, A61K36/88, A61K36/8945
【公开号】CN105147883
【申请号】CN201510436857
【发明人】梁钢, 孙悦文, 唐安洲, 欧明春, 邱汉琛, 陈燕燕
【申请人】广西医科大学
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年7月23日