治疗和预防缺血性损伤的组合物的制作方法_3

文档序号:9509264阅读:来源:国知局
丸剂、软胶囊或硬胶囊、颗粒剂、粉末剂、 溶液或乳液。非口服给药的形式可为(但不限于)注射、滴剂、洗液、软膏剂、凝胶剂、乳膏 剂、悬浮液、乳液、栓剂、贴片或喷雾。
[0073] 在本发明的一个实施方式中,药物组合物必要时可含有添加剂,诸如稀释剂、赋形 剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、分散剂、表面活性剂、着色剂、芳香剂或甜味剂。在本发 明的一个实施方式中,药物组合物可由本领域中的常规工业方法制造。
[0074] 在本发明的一个实施方式中,药物组合物的活性成分的剂量可根据患者年龄、性 另IJ、体重、病理及状态、给药路径或处方医师的诊断而变化。基于这些因素的剂量可在本领 域技术人员的水平内决定,每日剂量(例如)可为(但不限于)〇· 1yg/kg/日至lg/kg/日, 特定而言1μg/kg/日至10mg/kg/日,更特别10μg/kg/日至lmg/kg/日,更特别50μg/ kg/日至100μg/kg/日。在本发明的一个实施方式中,每日可施用药物组合物1至3次,但 不限于此。
[0075] 在示例性实施方式中,本发明提供一种用于治疗和预防缺血-再灌注损伤的食品 组合物,该组合物包含:含有SEQIDNO. 1所示氨基酸序列的肽、与所述氨基酸序列具有 80%或以上序列同源性的肽、或上述肽的片段作为活性成分。
[0076] 在本发明的一个实施方式中,食品组合物不限于特定形式,但(例如)可为片剂、 颗粒剂、粉末剂、液体及固体形式。形成各形式的除活性成分外还可有由本领域技术人员适 当选择的工业中常用的成分,且它们与其它成分组合可产生协同效应。
[0077] 上述活性成分剂量的决定处于本领域技术人员的水平内,且每日剂量(例如)可 为1μg/kg/日至10mg/kg/日,更特别10μg/kg/日至lmg/kg/日,更特别50μg/kg/日至 100μg/kg/日,但不限于所述数字,并可根据年龄、健康状态、并发症及其它各种因素而变 化。
[0078] 本文所使用的术语意欲用于描述实施方式,但不欲限制本发明。前面没有数字的 术语并不限制量,但展示可存在所使用术语的一个以上的事物。应开放式地解读术语"包 含"、"具有"、"包括"及"含有"(亦即,"包括但不限于")。
[0079] 论及数值范围,而不陈述范围内的单独数字,因此除非明确指出,否则该范围应将 视为本文单独描述的范围内的所有数字。所有范围的末端值包括于该范围内且可独立组 合。
[0080] 除非另作说明或在上下文中明显矛盾,可以以适当次序执行本文所论及的所有方 法。除在权利要求中以外,任一实施方式及所有实施方式或示例性语言(例如,"诸如"、 "等")的使用是用于更清楚地描述本发明,而非限制本发明的范围。在本文中的权利要求 的任何语言不应解读为本发明必需的。除非另有定义,本文所使用的技术及科学术语具有 为本发明所属技术领域技术人员通常所理解的含义。
[0081] 本发明的优选实施方式方式包括发明人已知的执行实施本发明的最佳模式方式。 实施方式中的变化可本领域技术人员在阅读上文陈述后对熟习此项技术者变得可清楚优 选实施方式中的变化。本发明人希望本领域技术人员可充分使用变化及,并可以与本文中 所列出方式不同的其它方式实施本发明。因此,如专利法所允许,本发明包括随附权利要求 中所陈述的本发明的关键点的等效物、修改及变化。另外,除非另有明确陈述或在上下文中 矛盾,上文所述组份的任何组合内的所有可能变化皆包括于本发明中。尽管通过示例性实 施方式描述及展示了本发明,但是本领域技术人员将充分理解:在不背离由权利要求所限 定的本发明精神及范围的情况下,在形式及细节中可存在各种改变。
[0082] 在以下实例中,通过向肾及腹直肌皮瓣所诱发的缺血-再灌注损伤部分施用肽, 并确认抑制肾损伤和改善皮瓣存活性的效果,调查了具有SEQIDNO. 1所示序列的肽(PEP 1)对预防及治疗缺血性损伤的效果。
[0083] 在下文中,将经由实施例及测试实施例详细描述本发明。然而,以下实施例及测试 实施例仅出于说明性目的,且将对本领域技术人员显而易见的是本发明的范围不限于该等 实施例及测试实施例。
[0084] 实施例1 :肽的合成
[0085] 根据固相肽合成的常规已知方法合成SEQIDNO. 1的肽。更具体而言,通过使 用ASP48S(Peptron,Inc.,DaejeonR0K)经由Fmoc固相肽合成(solidphasepeptide synthesis;SPPS)从C末端偶联各种氨基酸来合成肽。使用C末端处第一个氨基酸附接于 树脂的那些肽,如下所示:
[0086] NH2_Lys(Boc) -2-氯-三苯甲基树脂
[0087] NH2-Ala-2-氣-二苯甲基树脂
[0088] NH2_Arg(Pbf) -2-氯-三苯甲基树脂
[0089] 在N末端处通过Fmoc保护用于合成肽的所有氨基酸,并通过可溶解于酸的Trt、 Boc、t-Bu(t_butylester;叔丁酯)、Pbf(2, 2, 4, 6, 7-五甲基二氢-苯并咲喃-5-磺酰基) 保护氨基酸残基。实例包括以下:
[0090] Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-〇H、Fmoc-Glu(OtBu)-〇H、Fmoc-Pro-OH、
[0091] Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-〇H、
[0092] Fmoc-Thr(tBu) -〇H、Fmoc-Lys(Boc)-〇H、Fmoc-Gln(Trt)-〇H、
[0093] Fmoc-Trp(Boc) -〇H、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asn(Trt)-〇H、Fmoc-Tyr(tBu)-〇H、
[0094] Fmoc-Ahx-〇H、Trt-疏基乙酸。
[0095] 将HBTU[2-(1H-苯并三唑-1-基)-l,l,3,3-四甲基铵六氟磷酸盐(酯)]/ H0Bt[N-羟基苯并三唑]/NMM[4-甲基吗啉]用作偶联剂。使用20%DMF中的哌啶移除 Fmoc。为了从残基上移除保护或为了从树脂中分离合成肽,使用分解混合液[TFA(三氟乙 酸)/TIS(三异丙基硅烷)/EDT(乙二硫醇)/H20 = 92. 5/2. 5/2. 5/2. 5]。
[0096] 通过使用固相支架并重复以下过程来进行肽合成:从氨基酸保护开始,各种氨基 酸的单独反应,用溶剂洗涤,和脱保护。通过以下方式合成各肽:使用与起始氨基酸结合的 固相支架及氨基酸保护,使相应氨基酸单独反应,用溶剂洗涤及脱保护,并重复该过程。在 自树脂上释放后,所合成肽通过HPLC纯化、通过质谱分析法确认,并冻干,并且通过MS对合 成进行验证,随后冻干。
[0097] 所制备肽的纯度经高效液相色谱发现为95%以上。
[0098] 具体肽合成过程基于具有SEQIDNO. 1的PEP1的合成过程描述如下。
[0099] 1)偶联
[0100] 将用NH2-Lys(B〇c)-2-氯-三苯甲基树脂保护的氨基酸(8当量)及在DMF中溶 融的偶联剂HBTU(8当量)/H0Bt(8当量)/NMM(16当量)混合在一起,并在室温(RT)下温 育2小时。在温育后,反应混合物进行DMF、MeOH及DMF的相继洗涤。
[0101] 2)Fmoc脱保护
[0102] 添加20%DMF中的哌啶,并在RT下温育5分钟,2次,随后用DMF、MeOH及DMF相 继洗涤。
[0103] 3)通过重复上述反应1)及2),制成肽的基本构架NH2-E(OtBu) -A-R(Pbf) -P-A-L -L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf) -F-I-P-K(Boc) -2-氯-三苯甲基树脂。
[0104] 4)切割:将切割混合液添加至完全合成的肽中,由此从树脂上分离所合成的肽。
[0105] 5)将预先冷却的二乙醚添加至所获得的混合物中,及随后使用离心沉淀所收集的 肽。
[0106] 6)在通过制备型HPLC纯化后,通过LC/MS确认分子量,并经冻干以产生粉末形式。
[0107] 实施例2 :确认PEP1对抑制肾缺血-再灌注损伤模型中的肾损伤的效果
[0108] 测试实施例1 :缺血-再灌注的诱发
[0109] 在双侧夹紧肾蒂30分钟并在30分钟后通过移除夹具恢复血流,诱发缺血-再灌 注,从而建立肾缺血-再灌注损伤小鼠模型。测试组被分成施用组(PEP1)、对照组(没
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