有PEP1的PBS)及假手术组（无双侧夹紧）。在诱发缺血-再灌注前的30分钟及诱发缺 血-再灌注12小时后以1000nmol/kg的浓度皮下注射PEP1。
[0110] 使用C57BL/6 小鼠（8 周大；CharlesRiverLaboratories,Wilmington,MA)诱发 肾缺血-再灌注损伤。在通过血管钳夹紧肾蒂阻断血流及诱发缺血28分钟后，执行再灌注。
[0111] 在PBS中稀释肽PEP1至1000nmol/kg的浓度，并在缺血-再灌注前的30分钟及 缺血-再灌注12小时后于腹腔内（i.p.)注射两次。针对施用组（PEP1)、对照组（PBS)及 假手术组（无缺血-再灌注）实施测试。
[0112] 测试实施例2:PEP1对IRI诱发肾衰竭的预防效果
[0113] 在缺血-再灌注24小时后采集血液并测量血尿素氮（BUN)及肌酸的水平作为肾 毒性标记。采集肾组织及制备成石蜡块用于免疫组织化学及组织学研究。随后，提取蛋白 并测量细胞因子的水平。使用自动分析器（TechniconRA-1000;Bayer，Tarrytown，NY)测 量肌酸及BUN的浓度。
[0114] 结果是，施用PEP1组展示出与PBS对照组相比明显减少的BUN及肌酸水平（图 1)0
[0115] 测试实施例3:PEP1对预防肾组织损伤的效果
[0116] 在缺血-再灌注24小时后根据制造商（Polysciences,Inc.，华盛顿，PA，美国） 的规程用过碘酸-希夫氏（PAS)染色剂对肾组织染色。在染色后，经由肾组织损伤计分评 估肾组织损伤。施用PEP1组展示出与PBS对照组相比显著减少的肾组织损伤（图2及图 3) 〇
[0117] 测试实施例4 :抑制肾细胞凋亡的效果
[0118] 通过在缺血-再灌注24小时后用TUNEL染色剂对肾组织染色评估肾细胞凋亡。使 用TUNEL染色试剂盒（RocheAppliedScience，印第安娜波利斯，IN，美国）用TUNEL对肾 石蜡切片染色。
[0119] 结果是，施用PEP1组展示出与PBS对照组相比显著减少的TUNEL阳性细胞，表明 PEP1抑制肾组织的细胞死亡（图4及图5)。
[0120] 测试实施例5 :抑制肾组织中的先天性免疫细胞的侵润的效果
[0121] 在缺血-再灌注24小时后通过用F4/80 (巨噬细胞标记物）及Gr-Ι(嗜中性粒细 胞标记物）对肾组织进行免疫组织学染色来评估先天性免疫细胞的浸润。特定而言，使用 巨噬细胞特异性抗体（F4/80 ;Abcam，Cambridge，MA)对石蜡切片中的浸润巨噬细胞及嗜中 性粒细胞进行免疫组织学染色。
[0122] 施用PEP1组展示出与PBS对照组相比显著减少的巨噬细胞及嗜中性粒细胞对肾 组织浸润（图6及图7)。
[0123] 测试实施例6 :抑制炎性细胞因子的分泌的效果
[0124] 在缺血-再灌注24小时后从肾组织中提取蛋白质并根据流式细胞术微珠阵列 法测量IL-6、MCP-1及TNF-α的水平。小鼠IL-6、MCP-1、TNF-aELISA试剂盒购自R&D Systems，并根据制造商规程实施测试。
[0125] 结果是，施用PEP1组展示出与PBS对照组相比明显减少的IL-6及MCP-1水平， 但对于TNF-α未观察到明显差异（参看图8至图10)。
[0126] 如上文所描述，通过测试肾衰竭（BUN及肌酸）、肾组织损伤（肾小管损伤）、肾细 胞凋亡、免疫细胞浸润及肾组织中细胞因子分泌，评估了PEP1对预防肾缺血-再灌注损伤 的效果。
[0127] PBS对照组展示出与假手术组相比增加的血清BUN和肌酸水平以及更大的肾组织 损伤。相比的下，施用PEP1组展示出与对照组相比明显减少的BUN和肌酸水平以及减少 的肾组织损伤及肾细胞凋亡。而且，施用PEP1组展示出与PBS对照组相比抑制炎性细胞 (嗜中性粒细胞及巨噬细胞）的浸润，并明显抑制肾脏中的炎性细胞因子（白介素-6及单 核细胞趋化蛋白-1)的分泌。
[0128] 实施例3:PEP1对改善缺血-再灌注损伤模型中的腹直肌肌皮皮瓣存活率的效果
[0129] 测试实施例1 :缺血-再灌注的诱发
[0130] 从Sprague-Dawley大鼠（体重180-230g)的腹部获得5cmX5cm皮瓣，施用PEP1 或盐水，经由夹紧诱发局部缺血及随后在7小时后通过移除夹具恢复血流，从而建立缺 血-再灌注损伤大鼠模型（参看图11)。
[0131] 测试组被分成施用组（PEP1)、对照组（没有PEP1的PBS)及假手术组（未诱发 缺血-再灌注损伤）。在诱发缺血-再灌注前的30分钟及诱发缺血-再灌注1、2、3、4、5及 7 天后肌内注射PEP1 (10mg/500μL)或PBS(500μL)。
[0132] 测试实施例2 :ΡΕΡ1对改善皮瓣存活率的效果
[0133] 在诱发缺血-再灌注7天后测量皮瓣存活率。使用imagej程序分析数字影像测 量皮瓣存活率。
[0134] 结果是，PBS治疗组的皮瓣存活率为34.69% ±16. 44%，PEP1治疗组展示出 58.88% ±11. 44%的改善的皮瓣存活率（参看图12)。在组间有统计学显著性（p〈0. 05)。
【主权项】
1. 一种用于治疗和预防缺血性损伤的组合物，该组合物包含：含有SEQIDNO. 1所示 氨基酸序列的肽、与所述氨基酸序列具有80%或以上序列同源性的肽或上述肽的片段。2. 如权利要求1所述的用于治疗和预防缺血性损伤的组合物，其中，所述片段由三个 以上个氨基酸组成。3. 如权利要求1所述的用于治疗和预防缺血性损伤的组合物，其中，所述缺血性损伤 由选自以下的一种或多种引发：缺血-再灌注损伤、血管疾病、冠状动脉血栓、脑血管血栓、 动脉瘤破裂、全身性出血、挤压损伤、败血症、皮肤烧伤、血管结扎术、心肺转流术、器官移 植、心肺衰竭（心源性猝死）及室息。4. 如权利要求3所述的用于治疗和预防缺血性损伤的组合物，其中，所述缺血性损伤 由缺血-再灌注损伤引发。5. 如权利要求4所述的用于治疗和预防缺血性损伤的组合物，其中，所述缺血-再灌 注损伤选自由以下组成的组：脑血管缺血-再灌注损伤、肾缺血-再灌注损伤、肝缺血-再 灌注损伤、缺血-再灌注心肌症、缺血-再灌注皮肤损伤、肠胃缺血-再灌注损伤、肠道缺 血-再灌注损伤、胃缺血-再灌注损伤、缺血-再灌注肺损伤、胰腺缺血-再灌注损伤、缺 血-再灌注骨骼肌损伤、缺血-再灌注腹肌损伤、缺血-再灌注肢损伤、缺血-再灌注结肠 炎、肠系膜缺血-再灌注损伤及无症状缺血-再灌注损伤。6. 如权利要求4所述的用于治疗和预防缺血性损伤的组合物，其中，所述缺血-再灌注 损伤由器官移植引发。7. 如权利要求4所述的用于治疗和预防缺血性损伤的组合物，其中，所述缺血-再灌注 损伤在肾脏中发生。8. 如权利要求4所述的用于治疗和预防缺血性损伤的组合物，其中，所述缺血-再灌注 损伤在皮瓣中发生。9. 如权利要求8所述的用于治疗和预防缺血性损伤的组合物，其中，所述组合物用于 改善皮瓣的存活率。10. 如权利要求1所述的用于治疗和预防缺血性损伤的组合物，其中，所述肽衍生自人 类端粒酶。11. 如权利要求1所述的用于治疗和预防缺血性损伤的组合物，其中，所述组合物是药 物组合物。12. 如权利要求1所述的用于治疗和预防缺血性损伤的组合物，其中，所述组合物是食 品组合物。13. -种用于治疗和预防缺血性损伤的方法，该方法包括：将权利要求1至12中任一 项所述的组合物施用于有需要的受试者。
【专利摘要】本发明涉及一种用于治疗和预防缺血性损伤的组合物。更具体而言，本发明涉及一种含有端粒酶衍生肽的组合物，该组合物对治疗和预防缺血性损伤有效。具有本发明序列ID编号所示序列的肽、与所述序列具有80％或以上序列同源性的肽或肽片段对治疗和预防缺血性损伤具有优良效果。因此，含有本发明肽的组合物可有效用于缺血性损伤，尤其是用于缺血性-再灌注损伤。
【IPC分类】A61K38/10, A61P9/00, A61P9/10
【公开号】CN105263508
【申请号】CN201480031495
【发明人】金商在
【申请人】杰姆维克斯&凯尔有限公司, 金商在
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2014年4月18日
【公告号】EP2987497A1, US20160082089, WO2014171792A1