kg的剂量灌胃，正常对照组和阴性对照组灌胃 等溶剂的生理盐水。其中在配置本发明的组合物时，桑甚和乌梅蒸馈液之外的余份为蒸馈 水。灌胃时间间隔为12小时。
[0034] 3. 3标本的采集与处理
[0035] 治疗结束后，各组大鼠均测空腹血糖，称体重，做好相关记录，然后抓紧大鼠直 接剪断一侧股动脉致其死亡，接着对大鼠进行解剖并迅速取膜腺，4°C生理盐水冲洗干净 后用4%甲醒固定2地，蒸馈水浸泡地。取出常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋， LEICA2135石蜡切片机连续切片，厚度5 ym，每隔20片取1片，每个标本取6片，分别棟于 涂有聚赖氨酸的载玻片上，室溫保存备用。
[0036] 3. 4观察指标
[0037] 3. 4. 1 -般情况
[0038] 每日观察大鼠进食，饮水情况，尿量，精神状况等变化。分别在造模前，造模后，治 疗后测体重。
[0039] 3. 4. 2血糖测定
[0040] 3. 4. 2. 1空腹血糖及随机血糖
[0041] 各组动物分别在造模前、造模后、治疗后测空腹血糖（FBG) (mmol/L)，并每隔3天 测一次随机血糖，测空腹血糖前夜，大鼠禁食12h，次日鼠尾静脉取血，用自动血糖仪测定空 腹血糖，并做好相关记录。
[0042] 3. 4. 2. 2 口服葡萄糖耐量试验（OGTT)
[0043] 于造模前、造模后、治疗后行口服葡萄糖耐量试验（OGTT)。大鼠禁食1化后，按2g/ kg剂量，用50%葡萄糖溶液灌胃，于化、0. 5h、比、化取尾静脉血测血糖。实验结束后绘制 各组大鼠葡萄糖耐量曲线。
[0044] 3. 4. 3病理形态学
[0045] 治疗结束后动物处死并迅速摘取膜腺，4 °C生理盐水冲洗干净后4 %甲醒固定 2地，蒸馈水浸泡地。常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，LEICA2135石蜡切片机连 续切片，厚度5 y m，棟于涂有聚赖氨酸的载玻片上，使用苏木精-伊红染色法染色后光学显 微镜下观察。
[0046] 3. 4. 4免疫组织化学
[0047] 准备HIF-I a亲和纯和抗体、即用型SABC试剂盒，DAB显色试剂盒。取上述切片置 于6(TC烤箱考片Ih,严格按照试剂盒操作说明书进行操作，行切片常规脱蜡，蒸馈水浸泡2 分钟；加3%过氧化氨室溫下10分钟；蒸馈水洗1分钟X 3次；切片置于0.0 lmol/L构祿酸 缓冲液中，微波加热至沸腾，断电15分钟，再次加热沸腾后自然冷却；加0. 02mol/LPBS洗1 分钟X3次；加5% BSA抗原封闭，室溫下20分钟，甩去多余液体；滴加一抗（1 : 100)稀 释，37°C解育1小时；0. 02mol/LPBS洗2分钟X 3次；滴加生物素化二抗，37°C解育20分钟； 0. 02mol/LPBS洗2分钟X 3次；滴加辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素，37°C解育20分钟； 0. 02mol/LPBS洗5分钟X4次；DAB显色，镜下控制反应时间；苏木紫复染10秒，自来水冲 洗；脱水、透明、中性树脂封片。光镜下观察，特异性染色为片状栋黄色颗粒。对每批染色均 同步设立WO. Imol/LPBS液代替一抗的阴性空白对照。光学显微镜（400倍）下，每张切片 随机选择4个视野，分别计数每个视野内的阳性细胞数，最后W各组的均数做此较。
[0048] 3. 4. 5免疫巧光染色
[0049] 组织冰冻切片室溫丙酬（冷丙酬）固定lOmin，固定后用毛细滴管吸取经适当 稀释的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的湿度，37°C作用30min，然后用 0. 01mol/lpH7. 2PBS洗两次，lOmin，用吸水吸去或吹干余留的液体；再滴加间接巧光抗体 (如兔抗人丫 -球蛋1白巧光抗体等），再用PBS洗两次，lOmin，染色30min，37°C，缓冲盐水 洗两次lOmin，揽拌，缓冲甘油封固，用激光共聚焦显微镜镜下观察。对照染色：用正常兔血 清或人血清代替免疫血清，再用上法进行染色，结果应为阴性。 阳化0] 3. 4. 6RT-PCR 阳化U 从组织提取RNA后测浓度，A1/A2应在1. 8-2. 0之间，将RNA短暂离屯、后，加入 M-MLV逆转录酶lul、5XRT缓冲液加l、01igo(dT)18(20mol/L)化l、dNTP(20umol/L)化l、 RNA化g、补去离子水至20ul体积，42°C Ih逆转录反应，95°C 5min灭活M-MLV，再离屯、，70°C 加热5min，中止上述反应，置于冰上，行逆转录反应，在PCR反应管中严格按试剂盒操作说 明书再依次加入反应试剂，再将PCR管插入PCR仪，95°C变性5min ;进行35次循环扩增反 应（94°C，Imin ;退火溫度视引物而定巧0-60°C )，Imin ;72°C，Imin);然后72°C恒溫7min， 取出PCR反应管，对反应产物进行电泳检测，电泳结束后取出琼脂糖凝胶，轻轻地置于凝胶 成像仪上或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标准估计扩增条带的大小，将电泳结果形 成电子文件存档或用照相系统拍照。
[0052] 3. 4. TWestem blot
[0053] 从组织提取蛋白并定量，经10% SDS聚丙締酷胺凝胶电泳分离蛋白后，用电转移 至硝酸纤维素膜上，转膜完后称脱脂奶粉用TBST缓冲液配成5 %的浓度封闭，洗膜后加一 抗（一抗用TBST稀释至适当浓度）解育比，再度洗膜后加入用Western二抗稀释液稀释辣 根过氧化物酶（HR巧标记的二抗并解育比，用DAB显色液显色比，用凝胶图像分析系统分 析目标带的分子量和净上进行光密度值。 阳054] 实施例
[0055] 分别将1000 g桑甚和乌梅的鲜果（或冷冻鲜果）用揽拌机揽碎匀浆，置于如图1 所示的蒸馈瓶中，蒸馈后收集蒸馈产物。其中桑甚的蒸馈产物为452g，收率为45. 2%，乌梅 的蒸馈产物为337g，收率为33. 7 %。
[0056] 将上述蒸馈产物进行不同比例的配方，并饲喂给模型大鼠及作为对照的正常大 鼠，具体实验例和对此例如表1所示。四周饲喂实验结束后，统计各组大鼠的血液指标检测 值，W葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖的浓度（单位为mg/dl)。
[0057] 图2显示的是本发明组合物一典型实验例的结果，各实验组为=次重复实验的平 均值。 阳05引 其中，
[0059] a组为正常大鼠的空白对照
[0060] b组为糖尿病模型大鼠的空白对照
[0061] C组为糖尿病模型大鼠经本发明组合物干预治疗后的血糖浓度
[0062] d组为单独服用制乌梅的糖尿病模型大鼠
[0063] e组为单独服用桑甚的糖尿病模型大鼠 W64] 图3显示了本专利所申请的药物有降低糖尿病大鼠葡萄糖耐量试验曲线下面积 的作用，图中a为正常组，b组，C组，d组和e组分别为糖尿病空白对照组和不同用药组，取 正常对照组为1，其余与之对比。其中， 阳O化]a组为正常大鼠的空白对照
[0066] b组为糖尿病模型大鼠的空白对照
[0067] C组为糖尿病模型大鼠经本发明组合物干预治疗后的血糖浓度糖尿
[0068] d组为单独服用制乌梅的糖尿病模型大鼠 W例 e组为单独服用桑甚的糖尿病模型大鼠
[0070] 本发明的其它实施例与对照例的结果如表1所示，根据表1所示结果，可得知使用 发明的药物组合物后，取得的技术效果有：
[0071] 1.与对照组相此，单独饲喂制乌梅或桑甚的蒸馈液，虽然对糖尿病模型大鼠中高 血糖有一定的抑制作用，但是本发明的组合物却能将大鼠的血糖降低到更低的水平。
[0072] 2.尤其是按照本发明的此例混合使用制乌梅与桑甚，结果显示大鼠的血糖浓度被 控制在7-lOmg/dl之间的正常值，取得了意想不到的效果。
[0073] 表1.各实验例和对照例中4周后大鼠的血糖浓度
【主权项】
1. 一种干预治疗糖尿病的药物，其特征在于，含有制乌梅和桑椹为有效成分。2. 如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述有效成分占所述药物组合物总 重量的百分比为：所述制乌梅占50%~79%，所述桑椹占10%~16%。3. 如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述制乌梅占79%，所述桑椹占 16%〇4. 如权利要求1~4任一项所述的药物组合物，其特征在于，还包括药学上可接受的载 体和/或赋形剂。5. -种药物组合物在干预治疗糖尿病中的应用，其特征在于，所述药物组合物含有制 乌梅和桑椹为有效成分。6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述有效成分占所述药物组合物总重量的 百分比为：所述制乌梅占50%~79%，所述桑椹占10%~16%。7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述制乌梅占79%，所述桑椹占16%。
【专利摘要】本发明公开了一种干预治疗糖尿病的药物，含有制乌梅和桑椹为有效成分，有效成分占所述药物组合物总重量的百分比为：所述制乌梅占50％～79％，所述桑椹占10％～16％。动物实验表明，这种干预治疗糖尿病的药物组合物能有效地降低糖尿病大鼠的血糖水平，缩小葡萄糖耐量实验曲线下面积。
【IPC分类】A61P3/10, A61K36/605, A61K36/736
【公开号】CN105497205
【申请号】CN201410557099
【发明人】步世忠, 陈争跃, 马丽丽, 阮泓莅
【申请人】宁波大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2014年10月15日