溶液中，室温下机械搅 拌4.5d。缓慢加入稀盐酸溶液中，调节pH为5.5,加入大量丙酮，直至沉淀完全，过滤，再用无 水乙醇洗涤，真空干燥即得四乙烯五胺壳聚糖(TEPACS);
[0083] (3)合成TEPACS-Ad，需先参考文献(Kulkarni et al，2012)合成Ad-CH0(1-金刚烷 甲酸-4-苯甲醛酯），称取上述所得的TEPACS-定量(约含8mmol壳聚糖单体)加入圆底烧瓶， 加水溶解。称取3mmol Ad-CH0溶于300mL甲醇中，之后加入圆底烧瓶中，室温反应10h。旋蒸 出甲醇，洗涤出未反应的Ad-CH0，冷冻干燥得产品TEPACS-Ad;
[0084] (4)将步骤（1)和(3)得到的产品通过嵌套方法结合在一起。嵌套就是材料结构中 的金刚烷与环糊精混合，理论上使得金刚烷嵌套在环糊精中。称取步骤(3)所得TEPACS-Ad 一定量(约含3mmol壳聚糖单体），溶解于水中，加入0.2mmol HCPT-⑶，溶解并使环糊精充分 嵌套金刚烷，后冷冻干燥，得产品抗肿瘤缓释药物材料TEPACS-Ad/HCPT-⑶。
[0085]实施例5药物缓释实验
[0086]按照实施例1的方法制备的抗肿瘤缓释药物材料，在三个不同的pH = 4.5，7.4，9.4 下和两个不同温度37°C和0°C下探究缓释性，pH=7.4时设置一个0°C的对照组。
[0087] 称取60 ? Omg实施例1制备的TEPACS-Ad/HCPT-CD四份，分别加入到40mL pH = 4 ? 5， 7.4，7.4，9.4的体积约为30 %甲醇的磷酸缓冲液溶中，并开始计时，快速装入活化过的透析 袋(MWC0:3500Da)中，快速夹好夹子分别放入上述装有160mL相同pH缓冲液的锥形瓶中。 [0088] 将pH = 4.5，7.4，9.4的锥形瓶封好盖子快速置于已经调好温度为37 °C的恒温摇床 中保持漏槽状态以80rpm的转速孵育，分别标记为①号、②号和③号锥形瓶。将pH=7.4的另 外一个锥形瓶封好盖子快速置于已经调好温度为0°C的恒温摇床中保持漏槽状态以80rpm 的转速孵育中，记为④号锥形瓶。将剩余缓冲液也放入相应的相同温度下，用于补样。
[0089]从开始计时起，依次于卟、211、411、611、1211、2411、3611、4811、6011、7211时，对4个锥形瓶 在透析袋外各取样2mL装入5mL离心管中，取样后立即补充同温度的等量介质，使总体积保 持不变。如此每个锥形瓶取样10个，共40个样。
[0090] 采用高效液相色谱和紫外-可见分光光度计测试样品数据，探究缓释性。结果如附 图3所示，缓释效果良好，可以看出，前8个小时药物具有较大的释放率，在2d时药物能基本 达到最大释放量。碱性有助于释放，酸性不利于释放;低温使释放变慢，不利于药物释放。
[0091] 实施例6细胞毒性实验
[0092] 采用CCK-8试剂盒（购于上海酶联生物科技有限公司）测定Ad-CHO、TEPACS和 TEPACS-Ad对小鼠胚胎成纤维细胞(MEF细胞，购于上海歌帆生物科技有限公司）的抑制率。 首先用细胞培养液(90%RPMI-1640培养基+10%胎牛血清+1%双抗（200mM L-谷氨酰胺、 10mg/mL链霉素和10000U青霉素））配置系列浓度的待测物质溶液，然后细胞增殖-毒性检测 实验方法按照以下操作步骤：
[0093] (1)在96孔板中配置100yL的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24h(37°C，5% C〇2)，使得每孔约为5000个细胞。
[0094] (2)向培养板加入10yL不同浓度的待测物质。
[0095] (3)将培养板在培养箱孵育48h。
[0096] (4)向每孔加入10yL CCK溶液。
[0097] (5)将培养板在培养箱内孵育4h。
[0098] (6)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
[0099] 利用抑制率=1 一（测量组-空白组)/(对照组-空白组），采用SPSS软件计算出各种 材料对相应细胞的抑制浓度，做对比。
[0100] 采用 CCK-8 试剂盒测定 Ad-CH0、TEPACS、TEPACS-Ad、HCPT-C00H、HCPT-CD 和 TEPACS-Ad/HCPT-CD对Ifep G2肝癌细胞(购于上海歌帆生物科技有限公司）的抑制率。首先用细胞培 养液(90%RPMI-1640培养基+10%胎牛血清+1%双抗(200mM L-谷氨酰胺、10mg/mL链霉素 和10000U青霉素））配置系列浓度的待测物质溶液，然后细胞增殖-毒性检测实验方法同于 以上操作步骤。得到结果，正常细胞的存活率明显高于Hep G2肝癌细胞的成活率，制备的抗 肿瘤缓释药物材料可以选择性的杀死肿瘤细胞。
[0101] 本发明具体实例制备的一种抗肿瘤缓释药物材料，对其进行核磁鉴定、药物缓释 测试，毒性评价等，得到良好的实验结果。
[0102]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种抗肿瘤缓释药物材料，其特征在于:其结构如式I所示：2. 权利要求1所述的抗肿瘤缓释药物材料的制备方法，其特征在于包含如下步骤： (1) 称取HCPT-COOH，溶解于溶剂中，室溫揽拌，加入氨基环糊精，加入交联剂，室溫反 应;加入低溫水溶液，低溫静止，析出固体;离屯、沉淀出固体，烘干即得HCPT-CD; (2) TEPACS的合成，分为Ξ步;A:称取壳聚糖，溶解;慢慢加入甲醇，继续揽拌，停止揽 拌，获得A溶液，待用;B:将四乙締五胺溶解，获得四乙締五胺溶液;将苯甲醒溶解，然后加入 到四乙締五胺溶液中，加热回流;缓慢滴加环氧氯丙烷反应，获得B溶液;C:将B溶液加入A溶 液中，室溫下揽拌;调节抑，沉淀，过滤，洗涂，真空干燥即得TEPACS; (3) 将步骤(2)获得的TEPACS溶解，得到TEPACS溶液;称取Ad-C册溶解，然后将其加入到 TEPACS溶液中，室溫反应;旋蒸出甲醇，洗涂，干燥得产品TEPACS-Ad; (4) 称取步骤(3)所得的TEPACS-Ad，溶解，加入肥PT-CD，溶解并使环糊精充分嵌套金刚 烧，干燥，得产品抗肿瘤缓释药物材料TEPACS-Ad/HCPT-CD。3. 根据权利要求2所述的抗肿瘤缓释药物材料的制备方法，其特征在于： 步骤(1)中所述的溶剂为DMSO、THF和水中的任意一种或者至少两种； 所述的交联剂为邸C ·肥巧日NHS的任意一种或者两种。4. 根据权利要求2所述的抗肿瘤缓释药物材料的制备方法，其特征在于： 步骤（1)中所述的肥PT-COOH的终浓度为3.75mmol/L~lOmmol/l; 步骤(1)中所述的加入氨基环糊精的终浓度为3.75mmo 1 /L~1 Ommo 1 /L。5. 根据权利要求2所述的抗肿瘤缓释药物材料的制备方法，其特征在于： 步骤(1)中所述的室溫揽拌的揽拌时间为1~化； 步骤（1)中所述的室溫反应的反应时间为6~2地。6. 根据权利要求2所述的抗肿瘤缓释药物材料的制备方法，其特征在于:步骤(2)A中所 述的壳聚糖在A溶液中的终浓度为0.05mol/L~0.25mol/L; 步骤(2)A中所述的溶解的时间为1~3d; 步骤(2)A中所述的继续揽拌的时间为3~化。7. 根据权利要求2所述的抗肿瘤缓释药物材料的制备方法，其特征在于： 步骤(2)B中所述的四乙締五胺在B溶液中的终浓度为1~5mol/l; 步骤(2) B中所述的苯甲醒在B溶液中的终浓度为1~5mo 1 /1; 步骤(2)B中所述的环氧氯丙烷在B溶液中的终浓度为1~5mol/L。8. 根据权利要求2所述的抗肿瘤缓释药物材料的制备方法，其特征在于： 步骤(2)B中所述的加热回流的条件为40~80°C回流12~24h; 步骤(2)B中所述的反应的条件为40~60°C反应12~24h; 步骤(2) C中所述的机械揽拌的时间为4~5d; 步骤(2)C中所述的pH为5~6。9. 根据权利要求2所述的抗肿瘤缓释药物材料的制备方法，其特征在于： 步骤(3)中所述的TEPACS中的壳聚糖单体与Ad-C册的摩尔比为(2~5)山步骤(3)中所 述的反应的时间为6~12h; 步骤(4)中所述的TEPACS-Ad中的壳聚糖单体与肥PT-CD的摩尔比为(4~15): 1。10. 权利要求1所述的抗肿瘤缓释药物材料在抗肿瘤缓释药物领域中的应用。
【专利摘要】本发明公开一种抗肿瘤缓释药物材料及其制备方法与应用。该抗肿瘤缓释药物材料应用一种水溶性非常好的壳聚糖衍生物，改善了HCPT的水溶性，通过环糊精与金刚烷的主客体作用将羟基喜树碱与水溶性的四乙烯五胺壳聚糖结合在一起，增溶了HCPT。将HCPT以醚键连接在材料上，药物难易脱落，强烈地延长了药物的半衰期。基于材料结构中含有的C＝N结构可以在酸性条件下还原断开、材料结构中的环糊精和金刚烷的主客体作用也可以打开，因此材料起到双控缓释的作用。该材料具有良好的生物相容性，对正常细胞的生长没有明显的抑制作用；且定点长效缓释，增强了对肿瘤细胞的抑制作用，并且延长了给药时间，极大提高了药物的利用度。
【IPC分类】C08B37/08, A61P35/00, A61K31/4745, A61K47/48, A61K9/107, C08B37/16
【公开号】CN105561325
【申请号】CN201510927181
【发明人】蒋刚彪, 刘永林, 陈文照, 林晓萍
【申请人】华南农业大学
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2015年12月11日