得到的玉竹总黄酬样品，加水溶解使其浓度为0.5% (w/v)，加于甲基 丙締酸醋大孔吸附树脂柱上，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用40%乙醇洗脱至洗 脱液近无色，弃去洗脱液，用90 %乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，减压回收得玉竹 高异黄酬提取物8.95g。
[0048] 根据实施例1的方法对上述步骤（2)中玉竹提取液进行含量测定，结果表明使用 MnCl2能将提取液中高异黄酬含量提升~35%; W (回收液体积X高异黄酬浓度）比较回收 率变化，结果表明高异黄酬回收率提升21.1 %。
[0051]对上述步骤(2)所得玉竹总黄酬提取物用不同树脂进行柱层析分离，制备固体提 取物样品。根据实施实例1所述方法测定其中高异黄酬含量：
[0053]结果表明，使用甲基丙締酸醋大孔吸附树脂比传统聚酷胺树脂方法提高高异黄酬 含量30%左右。
[0054] 实施例4
[0055] -种抗菌、防病毒的皮肤保护洗液，将实施例3得到的玉竹高异黄酬与献下安、醋 酸氯已定配伍，得到抗菌、防病毒的皮肤保护洗液。平板抑菌实验证明对大肠杆菌、葡萄球 菌、霉菌等具有较好的抑制作用。抗病毒实验证明对流感病毒、HPV病毒具有抑制作用。 CAC02细胞实验证明对肿瘤细胞具有抑制作用。
[0056] W下通过药效学试验和对比试验来进一步阐述本发明所述玉竹高异黄酬的有益 效果。
[0057] 试验例1)
[005引将根据实施例3制备的玉竹高异黄酬与献下安、醋酸氯已定配伍，对得到的抗菌、 防病毒的皮肤保护洗液进行体外抗菌活性试验。
[0059] 在不同的培养基上分别接种金黄色葡萄球菌（编号CICC 10001、大肠杆菌（编号 CMCC44102，）、白色念珠菌(编号ATCC 10231)，W上菌株均由其编号对应的微生物保藏中屯、 提供。在37°C，培养2地后缓慢向培养基上滴加5%护肤洗液（由玉竹高异黄酬与献下安、醋 酸氯已定W50 :1:10的比例配伍得到）各5ml，阳性对照组滴加5ml生理盐水。经2分钟、4分 钟、6分钟、8分钟观察抑菌情况，结果见表1。
[0060] 表1该洗液体外抗菌活性实验
[0062] 表1所示结果表明：玉竹高异黄酬与献下安、醋酸氯已定配伍，得到的抗菌、防病毒 的皮肤保护洗液有广谱的抗菌活性，2分钟几乎能杀灭女性阴道常见病原菌。
[0063] 试验例2)
[0064] 将根据实施例3制备的玉竹高异黄酬与献下安、醋酸氯已定配伍，对得到的抗菌、 防病毒的皮肤保护洗液进行抗病毒试验。
[0065] 断颈处死雄性新西兰大耳白兔（（北京实验动物研究中屯、提供，4月~5月龄，10只， 体重2.4kg~3kg)，无菌条件下迅速切取阴茎，剥离表皮组织，RPMI1640完全培养液反复冲 洗，剪碎置无菌培养瓶备用。无菌条件下局麻切取口诊确诊的男性CA病人阴茎包皮较大痛 体(0.5cm-l. Ocm)，RPMI1640完全培养液反复冲洗，置匀浆器研磨制成HPV痛体组织悬液，置 无菌培养瓶加 RPMI1640完全培养液培养备用。
[0066] 培养兔阴茎表皮细胞至细胞长满培养孔底部时，将不同剂量"洗液"分别加入各细 胞培养孔，同时留2孔不加"洗液"作为对照组，继续培养，与对照组相比，相同培养时间内， 未致细胞死亡的最大剂量作为"洗液"杀伤抑制病毒活性实验时用药的上限剂量。细胞病变 的记录：表示细胞正常生长，表示1 %~25 %细胞病变，"++"表示26%~50%细胞病 变，"+++"表示51 %~75 %细胞病变，"+++++"表示76 %~100 %细胞病变。
[0067] 培养兔阴茎表皮细胞至细胞长满培养孔底部时，将HPV痛体组织悬液Iml与不同浓 度的"洗液"Iml.充分混合，37°C、5%C02条件下过夜处理后加入细胞培养孔内，用细胞维持 液补足培养孔，同时设3个对照组，其中1组两孔只加细胞维持液Iml/孔；1组2孔只加 HPV痛 体组织悬液，用细胞维持液补足Iml/孔；1组2孔只加"洗液"（50mg/ml )，用细胞维持液补足 Iml/孔;37°C、5%C02继续培养，每日镜下观察细胞生长情况。
[006引培养兔阴茎表皮细胞至细胞长满培养孔底部时，加入HPV痛体组织悬液，留4孔不 加痛体组织悬液作为对照组，37 °C、5 % C02继续培养24h后，将多余的痛体组织悬液吸去后 各孔加入不同浓度"洗液"并用细胞维持液补足lml/孔.同时设3个对照组，实验方法同上， 37°C、5%C02继续培养，每日镜下观察细胞生长情况。
[0069] 培养兔阴茎表皮细胞至细胞长满培养孔底部时，Id后将HPV痛体组织悬液加入细 胞培养孔，并用细胞维持液补足lml/孔，同时设3个对照组，实验方法同上，37°C、5%C02继 续培养，每日镜下观察细胞生长情况。
[0070] 试验结果：
[0071] 表2洗液对于兔包皮细胞增殖生长的影响
[0073] 表3洗液对于HPV的直接杀伤
[0076] 表4洗液对于HPV感染兔阴茎表皮细胞的阻断作用
[0077]
[0078] 由表2可知，"洗液"浓度小于或等于95111邑/1111时对细胞的增殖无影响，说明"洗^极' 对正常机体组织细胞损害作用小，提示临床应用安全。
[0079] 由表3可知，随着药物浓度的增大，"洗液"对HPV的杀伤作用增强。当"洗液"浓度在 35mg/ml~95mg/ml时具有显著的抑制或杀灭作用。
[0080] 由表4可知，随着药物浓度的增大/'洗液"对HPV感染并造成细胞病变的阻断作用 不断增强，特别在55mg/ml~75mg/ml时作用最强。
[0081] 综上说明该洗液对HPV病毒具有一定抑制作用，且对正常机体组织细胞损害作用 小。
[0082] 实施例5
[0083] -种保健食品，将实施例3得到的玉竹高异黄酬添加到食品和饮料中，得到健康食 品和保健饮料。
[0084] 实施例6
[0085] -种免疫调节功能的药品，将实施例3得到的玉竹高异黄酬加入片剂中，得到具有 免疫调节功能的药品，制剂具有与玉竹高异黄酬全部相同或相近的药理活性和用途。
【主权项】
1. 一种用于制备玉竹高异黄酮的方法，所述方法包括以下步骤： 1) 对经粉碎的玉竹根茎进行超临界流体萃取脱脂， 2) 对脱脂产物进行热回流提取以得到玉竹总黄酮，以及 3) 对步骤2)中获得的玉竹总黄酮进行柱层析纯化， 其中在所述热回流提取步骤中向所述脱脂产物加入乙醇和MnCl2,并且在所述柱层析纯 化步骤中使用甲基丙烯酸酯大孔树脂。2. 根据权利要求1所述的方法，其中在所述柱层析纯化步骤前，对所述树脂进行预处 理。3. 根据权利要求1所述的方法，所述方法包括以下步骤： 取玉竹根茎，粉碎后经不加改性剂的超临界流体萃取脱脂； 向脱脂所得的药渣加入乙醇和MnCl2以进行热回流提取，过滤热回流后的液体，将滤液 合并并浓缩，得到玉竹总黄酮样品； 树脂预处理：取适量甲基丙烯酸酯大孔吸附树脂，用乙醇浸泡，然后用乙醇洗涤，直到 洗出液中加适量蒸馏水无白色浑浊现象，再用蒸馏水洗至无醇，然后依次用NaOH、HCl浸泡， 分别用蒸馏水洗至中性，备用； 取所述玉竹总黄酮样品加水溶解，加于经所述预处理的甲基丙烯酸酯大孔吸附树脂柱 上，用蒸馏水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，然后先用低浓度乙醇洗脱至洗脱液近无 色，弃去洗脱液，再用高浓度乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液并减压回收，得到玉竹 高异黄酮提取物。4. 根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在所述热回流提取步骤中加入的MnCl2 的量为〇. 1%~5%w/v。5. 根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在所述柱层析纯化步骤中使用HP-2MG 型甲基丙烯酸酯大孔树脂。6. 根据权利要求3所述的方法，其中所述低浓度乙醇的浓度为10-40%v/v并且所述高 浓度乙醇的浓度为50-90%v/v。7. 根据权利要求1-6中任一项所述的方法制备的玉竹高异黄酮在制备抗菌、防病毒制 剂中的用途。8. -种抗菌、防病毒的皮肤保护洗液，其包含根据权利要求1-6中任一项所述的方法制 备的玉竹高异黄酮。9. 一种保健食品，其包含根据权利要求1-6中任一项所述的方法制备的玉竹高异黄酮。10. -种具有免疫调节功能的组合物，其包含根据权利要求1-6中任一项所述的方法制 备的玉竹高异黄酮。
【专利摘要】本发明提供一种用于制备玉竹高异黄酮的方法，所述方法包括以下步骤：1)对经粉碎的玉竹根茎进行超临界流体萃取脱脂，2)对脱脂产物进行热回流提取以得到玉竹总黄酮，以及3)对步骤2)中获得的玉竹总黄酮进行柱层析纯化，其中在所述热回流提取步骤中向所述脱脂产物加入乙醇和MnCl2，并且在所述柱层析纯化步骤中使用甲基丙烯酸酯大孔树脂。本发明还提供根据本发明的方法制备的玉竹高异黄酮的用途。
【IPC分类】A23L2/52, A61K125/00, A61K36/8969, A61Q19/10, A61K8/97, A61P31/10, A61P37/02, A61P31/12, A23L33/10, A61P31/04, A61Q17/00
【公开号】CN105663673
【申请号】CN201610051427
【发明人】张文昕, 李昭华, 戴宇, 董先智
【申请人】中国科学院生物物理研究所
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年1月26日