嗜碱芽孢杆菌物种α-淀粉酶变体、包括α-淀粉酶变体的组合物以及使用方法

专利名称：嗜碱芽孢杆菌物种α-淀粉酶变体、包括α-淀粉酶变体的组合物以及使用方法
技术领域：
本文公开了芽孢杆菌属物种CB""7/"s平)707的a-淀粉酶及其变体， 以及所述a-淀粉酶及其变体的組合物和用途。
背景技术：
淀粉由直链淀粉(15-30% w/w)和支链淀粉(70-85。A w/w)的混合物组 成。直链淀粉由分子量(MW)约60,000至约800，000的a-l，4-连接的葡萄糖 单元的线性链组成。支链淀粉是每24-30个葡萄糖单元含有一个a-l，6分支 点的分支聚合物；其MW可高达1亿。
目前，通过酶催化的工艺自淀粉生产浓缩的葡萄糖浆形式的糖，该工 艺包括(l)用a-淀粉酶将固态淀粉液化(或降低粘度)为平均聚合度约7-10 的糊精，和(2)用淀粉葡萄糖苷酶(也称作葡糖淀粉酶或GA)将所得的液化 淀粉(即淀粉水解产物)糖化。所得的浆液具有高葡萄糖含量。多数商品化生产的葡萄糖浆随后被酶促异构化为称作异糖浆(isosyr叩)的葡萄糖/果糖 混合物。
a-淀粉酶(EC 3.2.1.1)通过随机切割内部的a-l-4-糖苷键而水解淀粉、 糖原和相关的多糖。此类酶在诸如淀粉液化、纺织品退浆、纸和纸浆业中 的淀粉改性以及酿造中具有多种重要的商业应用。这些酶也可以用于在餐 具洗涤和衣物洗涤期间去除含淀粉的污渍，并用于糖业、酿造业、酒业和 纺织品工业。a-淀粉酶分离自多种细菌、真菌、植物和动物源。工业上， 许多重要的a-淀粉酶分离自芽孢杆菌属(j^c////)。
一种已祐束征的a-淀粉酶为嗜碱芽孢杆菌物种707的a-淀粉酶。芽孢 杆菌属物种707主要生产五类呈现淀粉水解活性的酶。其分子量据估算为 大约110、 95、 85、 75和60 kDa。 A. Tsukamoto等人，"Nucleotide sequence of the maltohexaose-producing amylase gene from an alkalophilic i fl"'〃附 sp. #707 and structural similarity to liquefying type a-amylase，" 5/oc/re附. & O 附附.151(1): 25-31 (1988)。所鉴定的a-淀粉酶长度为518
个氩基酸，估算分子量为59,007.5道尔顿。Tsukamoto等人(l988)。头33 个氨基酸为信号肽，参与该输出蛋白质的分泌。因此，胞外形式将具有485 个氛基酸，估算分子量为55,372道尔顿。编码该酶的核酸如K. Kimura 等人，"Cloning of a gene for maltohexaose producing amylase of an alkalophilic j 鎖7/附and hyper-production of the enzyme in 5鎖7/ms1 sw&,7/y cells,"」尸/;/: Af/c/^A/o/. AV^cAwo/. 27: 372-377 (1988)中所讨论的那 样进行了克隆和表征。该a-淀粉酶为G6淀粉酶或产麦芽六糖淀粉酶(E.C. 3.2.1.98)，且属于糖苷水解酶家族13。来自芽孢杆菌属物种707的a-淀粉 酶的氨基酸序列与来自解淀粉芽孢杆菌(5 "7/附 "附j^"々we/ac/e附)(BAA)、地衣芽孢杆菌CB"c,7/"s //cAw/onw/s)(BLA)和嗜 热脂肪芽孢杆菌(5"d//ws stefl/y)^w附o/;/^/附)的液化a-淀粉酶分别具有 65.5%、 65.9%和66.3%的同一性。R. K謹i等人，"Biochemical and crystallographic analyses of maltohexaose-producing amylase from alkalophilic 5ac/〃ws sp. 707,"祝oc/^附/Wo7 43: 14047-14056 (2004)。因此，芽孢杆菌属物种707的G6-淀粉酶据推定与G4-淀粉酶在结构上有所不 同。R. Kanai等人(2004)。
因此，需要芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶的变体，其具有增强的特性 和/或生产率。增加产量将会降低成本、提高利润率、节省工厂生产能力及 产生更高活性的产品等。另外，增加比活同样能够由于例如需要更少的酶 而提高利润率。
发明概述
因此，本文提供了组合物和使用所述组合物的方法，以及具有改进特 性a-淀粉酶在所述组合物和方法中使用的用途。
例如， 一方面考虑手工或自动餐具洗涤組合物，其包括芽孢杆菌属物 种707 (x-淀粉酶或其变体，和表面活性剂、洗涤剂助剂、#剂、聚合物、 漂白体系、稳定剂、增泡剂、抑泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、抗污垢再沉积 剂、染料、杀细菌剂、助水溶物、晦暗抑制剂和香料中的一种或多种。餐 具洗涂组合物可以是用于手工或自动餐具洗涤的组合物。
另一方面考虑包括芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体的洗衣洗涤 剂添加剂。
另一方面考虑洗衣洗涤剂，其包括上文所述的洗涤剂添加剂，并且还 包括下述之一种或多种表面活性剂、洗涤剂助剂、*剂、聚合物、漂 白体系、稳定剂、增泡剂、抑泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、抗污垢再沉积剂、 染料、杀细菌剂、助水溶物、荧光增白剂、织物调理剂和香料。
而另一方面考虑编码芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体的分离的 核酸，其中所述变体具有选自SEQIDNO: 3的M202、 M208、 S255、 R172 和/或M261的取代的残基取代或缺失。M202变体可以是选自M202L、 M202V、 M202S、 M202T、 M202I、 M202Q和M202W的取代变体。S255 变体可以是S255N取代。R172取代可以是R172Q。也考虑具有这些取代 的组合的变体。也考虑在多肽序列中具有这些取代的a-淀粉酶多肽(有或没 有信号序列)。
ii另一方面考虑含有编码任何前述变体的核酸的载体。也考虑其中(例如 借助于载体)插入了所述核酸的分离的细胞。所述分离的宿主细胞可以是孩吏
生物，例如细菌或真菌。细菌可以是选自枯草芽孢杆菌(必""7/船5"&//&)、 地衣芽孢杆菌、迟緩芽孢杆菌(及/ew似s)、短芽孢杆菌(及6"Ws)、嗜热脂
肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(及"汰"/<7/ / //"勾、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢
杆菌CB. o "g"/"/w)、环状芽孢杆菌(必."7tm/"ws)、杣烂芽孢杆菌(及/fl","力、 苏云金芽孢杆菌(及,/r"r!'"g/e"5^)、 变铅青链霉菌(5yre/7似附yces //vzV/""s)或 鼠灰链霉菌(51. w"W"附)的革兰氏阳性菌；或革兰氏阴性菌，其中所述革兰 氏阴性菌为大肠杆菌(jE^c/^r/c/^fl co/Z)或假单胞菌属CP^"^/m Wfls)物种。
另 一方面考虑本文所述多肽在衣物洗涂和/或餐具洗涤中的用途。这些 多肽变体可任选地为无粉尘颗粒、孩W立、稳定的液体或受保护的酶的形式。 另 一方面考虑所述洗涤剂添加剂或洗涤剂组合物还包括酶，所述酶选自 纤维素酶、蛋白酶、酰基转移酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧 化氢酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、 a-半乳糖苷酶、p-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、oi-葡萄糖苷酶、p-葡萄糖苷酶、 卣代过氧化物酶(haloperoxidase)、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、 氧化酶、果胶裂解(pectinolytic)酶、肽^J^氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、 过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰 胺酶、木聚糖酶、普鲁兰酶(pullulanase)、异淀粉酶、角叉菜聚糖酶 (carrageenase)或这些酶的任意组合。考虑用在组合物中的其他淀粉酶包括 两种或多种其他a-淀粉酶、(3-淀粉酶、异淀粉酶或葡糖淀粉酶。
还考虑利用任何上迷组合物清洁纺织品和餐具或其他硬表面的方法。
另一方面考虑本文所述的a-淀粉酶或任何a-淀粉酶变体在纺织品退 浆组合物中的用途，其中所述組合物为水性溶液。也考虑利用所述组合物 使纺织品退浆的方法。
又一方面考虑用于淀粉加工的組合物，包括芽孢杆菌属物种707 a-淀 粉酶或其变体的水性溶液。也考虑利用这样组合物加工淀粉的方法。所述 方法和组合物可以进一步包含葡糖淀粉酶、异淀粉酶、普鲁兰酶、植酸酶或其组合。而另一方面考虑生物膜水解组合物，包括在溶液或凝胶中的芽
孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体，且任选地还包括.纤维素酶、半纤维 素酶、木聚糖酶、脂肪酶、蛋白酶、果胶酶、抗孩i生物剂或其任意组合。 也考虑利用所述组合物水解生物膜的方法。
另 一方面考虑用于糖化淀粉的組合物，包括芽孢杆菌属物种707 a-淀 粉酶或其变体的溶液。因此，也考虑糖化淀粉的方法，包括施用权利要求 33的组合物至足以糖化所述淀粉的一段时间。
另一方面考虑用于液化淀粉的組合物，包括芽孢杆菌属物种707 a-淀 粉酶或其变体的溶液。因此，也考虑液化淀粉的方法，包括施用所述组合 物至足以液化所述淀粉的一段时间。
而又一方面，考虑利用芽孢杆菌属物种707 (x-淀粉酶或其变体的溶液 或凝胶的烘焙组合物。也考虑利用这样的烘焙组合物进行烘焙的方法。
附图简述
附图并入本说明书中并构成其一部分，用于举例说明实施方案。附图
是所公开实施方案的举例说明。


图1. 在pH 8.0时比较Stainzyme (▲)、 OxAm (國)(Purastar⑧)和芽 孢杆菌属物种707 a-淀粉酶(口)的稻样片测定。
图2. 在pH 10.1时比较Stainzyme (粉色園)、OxAm (A)(Purastar⑥) 和芽孢杆菌属物种707 ot-淀粉酶(橙色—的稻样片测定。
图3.图3A显示了编码Pre-LAT信号肽的DNA序列(SEQIDNO: 1)。 图3B显示了天然芽孢杆菌属物种707的a-淀粉酶基因(SEQ ID NO: 2)。
图4. pICatH质粒图。
图5.含Amy707基因序列的pICatH质粒图。
图6.显示了 Terg-o-tometer测定的结果。在芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶(O.l ppm)或Stainzyme (0.1 ppm)的存在下，试验了包括活性Tide (Tide Active)(1.8 g/L)、灭活Tide (Tide Inactivated)(1.8 g/L)或AATCC (1.5 g/L)的洗涤剂组合物。在一些样品中，还存在Purafect Prime (0.5 ppm)。测定在5 mM HEPES緩冲液中于74°F pH 7.5进行，7jc硬度为6 gpg (每加 仑的格令数)。所试验的样片为着色的淀粉棉(EMPA161， 13-02)。 SRI百分 数(。/。SRI)代表去污指数百分数或清洁过程中去除的污渍的百分数。去污通 过测量未经污染的样片、彻底污染的样片、以及已经给予过一定清洁处理 的污染样片来计算。利用CIEI^aA[^色空间通过反射计进行测量。通过清 洁和污染样片之间的色差除以未经污染和污染样片之间的色差，取比值， 来计算。/。SRI。 "dE"代表CIE 1^*3*1)*色空间中各颜色组分色差平方之和的
平方根。每一种可察觉的颜色都能够由色空间中的1^3* 3*坐标所表示。
"L"，表示标度0到100从纯黑到纯白的明度或灰阶值，"3*，，表示红色向绿 色的转变，其中大的正值表示特别红的色调，而大的负值表示特别绿的色 调。"W表示黄色向蓝色的转变，其中大的正值表示特别黄的色调，而 大的负值表示特别蓝的色调。当3*和1)*值均为0时，则没有颜色，留下 其明度为1^值所定义的纯灰色。所试验的样片为CS-2 (072，带可可污渍)、 CS-37 (005，带全卵污渍)或着色的淀粉棉(EMPA161,13-02)。
图7. Lauder-o-meter测定结果，用5 g/L IEC A夫在40°F进行，漂白， 并且水石级为12 gpg。芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶和Stainzyme⑧以0.1 ppm的量存在。在5种不同的污渍样片上对组合物进行了试验。
图8.显示了芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶、Stainzyme⑧和OxAm (Purastar⑧)在欧洲条件下的自动餐具洗涤性能。去除米乳(rice milk)的洗 涤性能测量为与mg活性蛋白质相比较的去污能力。
图9.显示了芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶、Stainzyme⑧和OxAm (Purastar⑧)在欧洲条件下的自动餐具洗涤性能。去除混合淀粉的洗涤性能 测量为与mg活性蛋白质相比较的去污能力。
图10.在有或无漂白的情况下在20。C对芽孢杆菌属物种707a-淀粉酶 的M202—L (M202L)变体进行了测定。该清洁测定的吸光度在488 nm用 渐增量的酶进行测量(测量为每百万份的份数，ppm)。将M202L变体与芽 孢杆菌属物种707的野生型a-淀粉酶进行了比较。发明详述
如下涉及化合物、组合物、制备所述化合物的方法，以及使用所述化
合物和组合物的方法，其中所述化合物为芽孢杆菌属物种707的a-淀粉酶 或其变体。寻求在例如洗衣和餐具洗涤试验中具有高性能的芽孢杆菌属物 种707 a-淀粉酶形式及其变体。
芽孢杆菌属物种707的a-淀粉酶具有8.8的最适pH，且在广的pH范 围内(即pH4，7-10.8)稳定。该多肽具有45。C的最适温度。该酶在较低温度 例如15-20。C时有活性。该酶在超过55。C的温度孵育30分钟后，保留不到 20%的其活性。
1.缩写和定义
才艮据此发明详述，应用下面的缩写和定义。必须注意，如本文所^_用， 除非上下文另有明确指明，否则单数形式"一"、"一个"和"该"涵盖对复数 形式的提及。因此，例如，提及"一种酶"包括多种此类酶，而提及"该制剂" 包括一种或多种制剂以及本领域技术人员已知的其等同制剂，等等。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通 技术人员通常所理解的含义。下面提供如下的术语。
1.1定义
术语"淀粉酶，，旨在包括任何淀粉酶，例如葡糖淀粉酶、a-淀粉酶、(5-淀粉酶和芽孢杆菌属物种如地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的野生型a-淀 粉酶。"淀粉酶"应指这样的酶，其能够催化淀粉的降解等。淀粉酶是切割 淀粉中a-D-(1—4) O-糖苷键的水解酶。通常，将a-淀粉酶(EC 3.2.1.1; a-D-(l—4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)定义为以随机方式切割淀粉分子内 a-D-(l—4) O-糖苷键的内切酶。与此相反，外切淀粉水解酶如P-淀粉酶(EC 3.2.1.2; a-D-(l—4)-葡聚糖麦芽糖水解酶)和一些产物特异性淀粉酶如产麦 芽糖(maltogenic) a-淀粉酶(EC 3.2.1.133)从底物的非还原末端切割淀粉分 子。卩-淀粉酶、a-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20; a-D-葡糖苷葡糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3; a-D-(l—4)-葡聚糖葡糖水解酶)，以及产物特异性淀粉 酶可以从淀粉产生特定长度的低聚麦芽糖。
"芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶，，是来源于芽孢杆菌属物种707的a-淀 粉酶。编码该a-淀粉酶的基因可以是野生型基因，或编码该a-淀粉酶的密 码子优化的多核苷酸。"芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶变体"表示野生型芽 孢杆菌属物种707 a-淀粉酶的变体，其包括芽孢杆菌属物种707亲本多肽 序列的序列取代、添加或缺失。芽孢杆菌属物种707的成熟a-淀粉酶为(氨 基至JtJ^取向)(SEQ ID NO: 3):
hhngtngtmm qyfewylpnci grihwnrlnsd asnlkskgit avwippawkg 50
asqndvgyga ydlycilgefn qkgtvrtkyg trsqlqaavt slknngiqvy 10 0
gdvvmnhkgg adatemvrav evnpnnrnqe vtgeytieaw trfdfpgrgn 150
thssfkwrwy hfdgvdwdqs rrlnnriykf rghgkawdwe vdtengnydy 200
lmyadidmcih pevvnelrnw gvwytntlgl dgfridavkh ikysftrdwi 25〇
nhvrsatgkn mfavaefwkn dlgaienylq ktnvmhsvfd vp丄hynlyna 300
sksggny加r nifngtvvqr hpshavtfvd nhdsqpeeal esfveewfkp 350
layaltItre qgypsvfygd yygipthgvp amrskidpil earqkyaygk 4〇0
qndyldhhni igwtregnta hpnsglatim sclgaggskwm fvgrnkagqv 4 50
wsditgnrtg tvtinadgwg nfsvnggsvs iwvnk 4 85
如本文所使用，"亲本酶"和"亲本多肽"应指芽孢杆菌属物种707的多 肽。"亲本核酸"表示编码所述亲本多肽的核酸序列。该芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶还可以在亲本多肽的信号序列中或该a-淀粉酶亲本多肽的别处包 括突变。因此，芽孢杆菌属物种707a-淀粉酶可以为含有异源a-淀粉酶多 肽的融合蛋白质的形式。它还可以包括嵌合体(即至少两种a-淀粉酶的组 合)。例如，芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶可以包含来自另一 a-淀粉酶的信 号肽，例如地衣芽孢杆菌(LAT)。参见例如图3A,其显示了 LAT信号肽 的编码序列。也考虑用不止一个氨基酸取代第一个丙氨酸(除缬氨酸之外的 任何取代)，例如一个、两个或多个苏氨酸。术语"变体"可与术语"突变体" 互换使用。变体应包括编码对芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶的另外的取代、 颠换、插入和缺失的多肽以及核酸。变体可以包括与能够同本文所示核苷 酸序列杂交的序列相互补的序列。例如，变体核酸序列与能够在严紧条件(例如50。C和0.2 xSSC{lxSSC = 0.15 MNaCl， 0.015 M柠檬酸三钠，pH 7.0})下同本文所示核苷酸序列杂交的序列互补。术语变体核酸序列涵盖与 能够在高严紧条件(例如65。C和0.1 xSSC {1 xSSC = 0.15 M NaCl， 0.015 M柠檬酸三钠，pH 7.0})下同本文所示核苷#列杂交的序列相互补的序列。
如本文所使用的术语"回收的"、"分离的"和"分开的"指化合物、蛋白 质、细胞、核酸或氨基酸从与之天然相伴且天然存在的至少一种组分中移 开。
"纯化的，，指物质处于相对纯的状态，例如至少约卯％纯的，或至少约 95%纯的，或至少约98%纯的。
"热稳定的，，指酶在暴露于升高的温度后保留活性的能力。以酶的半衰
期来衡量酶(如(X-淀粉酶)的热稳定性。半衰期(ti/2)是在规定的条件下丧失
一半酶活性的时间(以分钟、小时或天计)。通过测量残留a-淀粉酶活性来 计算半衰期值。
"pH范围"指酶在酸性到碱性^H中(跨越5个或更多个pH单位)下呈现 催化活性的能力。
如本文所使用，"pH稳定的"指酶在预定的时间阶段(例如，15分钟、 30分钟、1小时)内在广的pH范围内保留活性的能力。
如本文所使用，"氨基,列"与术语"多肽"和/或术语"蛋白质"同义。 一些情况下，术语"氨基酸序列，，与术语"肽"同义。 一些情况下，术语"M 酸序列，，与术语"酶"同义。本文使用氨基酸残基的常规单字母或三字母代 码。
术语"核酸，，包括单链或双链的DNA、 RNA及其化学修饰。术语"核酸" 和"多核苷酸"在本文可互换使用。
如本文所使用，"核苷酸序列"或"核酸序列"指编码芽孢杆菌属物种 707 a-淀粉酶多肽或其变体的寡核苷^列或多核苷^列，及其片段和 衍生物(例如其部分)。核苷酸序列可以是基因组的或合成的或重组的来源， 并且可以是双链或单链(代表正义或反义链)。如本文所使用，术语核苷酸序列包括基因组DNA、 cDNA、合成的DNA和RNA。例如，DNA可以是 编码芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体的cDNA序列。由于遗传密码 是简并的，可利用一种以上的密码子编码一种特定的氛基酸，故本发明涵 盖编码特定M酸序列的多种核苷酸序列。
"同源物"应指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有 一定程度同一 性的实体。同源序列旨在包括与主题序列具有至少75%、80%、85%或卯％ 同一性、或至少95%、 96%、 97%、 98%或99%同一性的氨基#列。通 常，同源物将包括与主题M^列相同的活性位点。
如本文所使用，"杂交，，应包括核酸链通过碱基配对与互补链结合的过 程，以及在聚合酶链式反应(PCR)技术中进行的扩增过程。a-淀粉酶或其 变体核酸可以以单链或双链DNA或RNA、 RNA/DNA异源双链体或 RNA/DNA共聚物的形式存在。
如本文所使用，"合成的"应指通过体外化学或S^1合成而产生的。其 包括，但不限于，制备的对于宿主生物如甲基营养酵母毕赤酵母属(户/d^")、 汉逊酵母属(好aw^"w/")、链霉菌属(A"/7to附yce力、木霉属(7Wc/io&r附")(例
如里氏木霉(r. "e^/))或其他表达宿主而言具有最佳密码子使用的芽孢杆
菌属物种707 a-淀粉酶或其变体的编码核酸。
"7JC硬度"指用于洗涤目的的水中钙和镁的量(1.4-1.8 mmol/L)，以及用 于餐具洗涤目的的量。
如本文所使用，术语"转化的"、"稳定转化的"和"转基因的"用于述及 细胞时，表示细胞具有整合到其基因组中的或作为染色体外质粒在多个世 代中维持的非天然(例如异源)核酸序列。
在向细胞中插入核酸序列的上下文中，术语"引入的"指"转染"或"转 化"或"转导"，并且包括向真核或原核细胞中掺入核酸序列，其中核酸序列 可以掺入到细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转 换为自主复制子，或瞬时表达(例如转染的mRNA)。
如本文所使用，"转化的细胞"应包括通过重组DNA技术的应用而已 被遗传改变的细胞。转化通常通过向细胞中插入一种或多种核苷酸序列而发生。插入的核苷酸序列可以是异源核苷酸序列(即，对于待转化的细胞而
言并非天然的序列，例如编码融合蛋白质或非天然序列的DNA序列)。
如本文所使用，"有效连接的"应指所述及的组分之间的关系允许它们 以它们期望的方式发挥功能。与编码序列有效连接的调控序列如此连接， 从而所述编码序列能够在与该控制序列相容的条件下获得表达。
如本文所使用，"生物活性的，，应指与天然存在序列具有相似的结构功 能(但不必是相同的程度)和/或相似的调控功能(但不必是相同的程度)和/或 相似的生化功能(但不必是相同的程度)的序列。
"宿主菌林"或"宿主细胞"指对含有多核苷酸的表达载体或DNA构建 体适宜的宿主，所述多核苷酸编码根据本公开内容的变体a-淀粉酶。尤其 是，宿主菌林优选为细菌细胞。在本发明优选的实施方案中，"宿主细胞，， 既指微生物菌林特别是芽孢杆菌属物种的细胞，又指由所述细胞建立的原 生质体。
术语"选择标记，，指能够在宿主中表达、允许轻松选择含有所引入的核 酸或载体的那些宿主的基因。选择标记的实例包括但不限于抗微生物剂(例 如潮霉素、博来霉素或氯霉素)，和/或赋予代谢优势(例如赋予宿主细胞营 养优势)的基因。
术语"培养"是指使微生物细胞群在适宜条件下在液体或固体培养基中 生长。在一个实施方案中，培养是指含有颗粒状淀粉的淀粉底物发酵型生 物转化为终产物(通常是在容器或反应器中)。发酵是微生物对有机物质的 酶促和厌氧降解，以产生更简单的有机化合物。虽然发酵在厌氧条件下发 生，但该术语并非旨在完全局限于严格的厌氧条件，因为发酵也可以在氧 的存在下发生。
"基因，，指参与产生多肽的DNA区段，并且包括位于编码区之前和之 后的区域，以及位于个体编码区段(外显子)之间的居间序列(内含子)。
"载体，，指设计用以将核酸引入到一种或多种细胞类型中的多核苷^f 列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、表达 盒等等。如本文所使用的"表达载体"表示含有有效连接于适宜控制序列的
DNA序列的DNA构建体，所述控制序列能够实现该DNA在适宜宿主中的表达。此类控制序列可以包括为实现转录的启动子、为控制转录的任选的操纵基因序列、编码mRNA上的适宜核糖体结合位点的序列、增强子、以及控制转录和翻译终止的序列。
"启动子，，是参与结合RNA聚合酶以起始基因转录的调控序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。本发明使用的优选启动子是地衣芽孢杆菌a-淀粉酶(AmyL)。
术语"有效连接的，，指元件的排列使之在功能上相关的毗邻关系。因此，如本文所使用的，"有效连接的，，表示所述组分处于允许他们以其期望方式发挥功能的关系中。例如，与编码序列有效连接的调控序列如此连接，从而在与控制序列相容的条件下获得编码序列的表达。
"处于转录控制之下"是本领域熟知的术语，表示多核苷酸序列(通常是DNA序列)的转录有赖于其与有助于转录起始或促进转录的元件的有效连接。
"处于翻译控制之下"是本领域熟知的术语，表示发生在mRNA已经形成之后的调控过程。
"信号序列"表示结合在蛋白质N-末端部分的氨基酸序列，其有助于成熟形式的蛋白质分泌到细胞外侧。信号序列的该定义为功能性定义。成熟形式的胞外蛋白质缺乏信号序列，后者在分泌过程中被切割掉。
如本文所使用的，当述及蛋白质和编码他们的基因时，用于基因的术语以斜体表示(例如，编码amyL (地衣芽孢杆菌AA)的基因可以表示为
fl附jl)。用于蛋白质的术语一般不以斜体表示，且首字母一般大写(例如，fl附jl基因所编码的蛋白质可以表示为AmyL或amyL)。与此类似，本文提供的来自芽孢杆菌属物种707菌株的淀粉酶基因和蛋白质分别是柳,7和Amy707。
就多核苷酸或蛋白质而言的术语"异源的，，指多核苷酸或蛋白质并非天然存在于宿主细胞中。在一些实施方案中，蛋白质为具有商业重要性的工业蛋白质。该术语旨在涵盖由天然存在的基因、突变的基因和/或合成的基 因所编码的蛋白质。
就多核苷酸或蛋白质而言的术语"内源的"指多核苷酸或蛋白质天然存 在于宿主细胞之中。
如本文所使用的，术语"表达"指基于基因的核 列产生多肽的过程。 该过程既包括转录又包括翻译。
如本文所使用的，术语"比活"表示酶单位，定义为由酶制品在特定条
件下在单位时间内转化为产物的底物摩尔数。比活表达为单位(U)/mg蛋白 质。
"ATCC，，指位于马纳萨斯，Va. 20108的美国典型培养物保藏中心 (ATCC)。
"NRRL，，指美国农业研究服务培养物保藏中心，美国国家农业利用研 究中心(而以前称为USDA Northern Regional Research Laboratory), Peoria, 111。
如本文所使用的，术语"包含/含有"及其同根词以其包罗在内的意义使 用；也就是说，等同于术语"包括"及其相应的同根词。
1.2缩写
除非另有说明，否则适用下面的缩写
AE 醇乙氧基化物
AEO 醇乙氧基化物
AEOS 醇乙氧基琉酸盐
AES 醇乙氧基琉酸盐
AFAU 酸性真菌a-淀粉酶单位
AGU 葡糖淀粉酶活性单位
AOS a-烯烃磺酸盐
AS 醇硫酸盐
BAA 解淀粉芽孢杆菌a-淀粉酶BLA 地衣芽孢杆菌(或LAT)
BSA 牛血清白蛋白
cDNA 互补DNA
CMC 羧甲基纤维素
DNA 脱氧核糖核酸
DP3 具有3个亚单位的聚合度
DPn 具有n个亚单位的聚合度
DS 干固形物
DTMPA 二亚乙基三胺五乙酸
EC 酶学委员会
EDTA 乙二胺四乙酸
EO 环氧乙烷
F&HC 织物和家居护理
FAU 真菌淀粉酶单位
GA 葡糖淀粉酶
gpg 每加仑的格令数
HFCS 高果糖玉米糖浆
HFSS 高果糖淀粉，浆
IKW 德国身体护理及洗涤工业协会
(Industrieverband Koerperpflege-und Waschmittd e. V.)
IPTG 异丙基-P-D-硫代吡喃半乳糖苷
LAS 线性烷基M酸盐
LOM Laimder-O-meter
LU Liquiphon单位
MW 分子量
MWU 改良的Wohlgemuth单位
NOBS 壬酰基ftj^^^酸盐
NT A 次氮基三乙酸PCR聚合酶链式反应
PEG聚乙二醇
PVA聚乙烯醇
PVP聚乙烯吡咯烷酮
RNA核糖核酸
SAS仲烷基磺酸盐
TAED四乙酰基乙二胺
TCA三氯乙酸
TSB胰蛋白胨大豆肉汤
UFC超滤浓缩(物)
w/v重量/体积
w/w重量/重量
wt野生型
1.3命名法
在本说明书和权利要求书中，使用氨基酸残基的常规单字母或三字母 代码。为易于引述，本发明的a-淀粉酶变体通过使用如下命名法予以描述 原始氨基酸位置取代的氨基酸
例如，根据此命名法，242位上的丝氨酸被丙氨酸取代表示为
Ser242Ala或S242A
30位上的丙氨酸缺失表示为
Ala3(^或入30*或AA30
而插入额外的氨基酸残基(例如赖氨酸)，则表示为 Ala30AlaLys或A30AK
连续一段氨基酸残基(例如氨基酸残基30-33)缺失，表示为(30-33)*或 A(A30-N33)或A30-33。两个连续的氨基酸(例如氨基酸残基R180-S181)缺 失，表示为ARS或A180-181。
在特定a-淀粉酶与其他a-淀粉酶相比含有"缺失"、且在这样的位置上进行了插入的情况下，这表示为*36Asp或*36。表示在36位插入天冬氨酸。多重突变用加号分开，即Ala30Asp+Glu34Ser或A30N+E34S
表示30和34位的丙氨酸和谷氨酸分别被天冬酰胺和丝氨酸所取代的突变。
当一个或多个可选的氨基酸残基可插入在给定位置上时，其表示为A30N，E或者A30N或A30E
此外，当本文鉴定了适于进行修饰的位置而未提出任何具体的修饰时，应理解为可用任何氨基酸残基取代处于该位置的氨基酸残基。因此，例如，当提及30位上的丙氨酸修饰却未具体指定时，应理解为该丙氨酸可以缺失或取代为任何其他氨基酸，即，如下任一
R， N， D， A， C, Q， E， G, H， I， L， K, M， F， P， S， T, W， Y， V。
此外，"A30X，，表示任一如下取代
A30R， A30N， A30D， A30C， A30Q， A30E， A30G， A30H， A30I, A30L，A30K， A30M， A30F， A30P， A30S， A30T， A30W， A30Y或A30 V;或简写为A30R，N，D，C，Q，E，G，H，I，L，K，M，F，P，S,T，W，Y，V。如果用于编号的亲本酶早已具有建议取代该位置的所讨论氨基酸残基，则使用如下命名法
"X30N，，或"X30N，V，，(例如在野生型中存在N或V中之一的情况下)因此，这表示其他相应的亲本酶30位被取代成"Asn"或"Val"。
1.4氨基酸残基的特征
带电荷氨基酸
Asp， Glu， Arg, Lys， His
带负电荷氨基酸(带最多负电荷的残基列在第一位)Asp, Glu
带正电荷氨基酸(带最多正电荷的残基列在第一位)
Arg， Lys， His
中性氨基酸
Gly， Ala, Val， Leu， lie, Phe， Tyr， Trp， Met， Cys， Asn， Gln， Ser， Thr，
Pro
疏水氨基酸残基(最疏水的残基列在最后) Gly, Ala, Val， Pro, Met, Leu， lie, Tyr， Phe， Trp， 亲水氨基酸(最亲水的残基列在最后) Thr， Ser， Cys， Gln, Asn
1.5同源性(同一性)
多核苷酸或多肽与其他序列具有一定(例如80%、 83%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%或99%)的序列同一性百分比，是指在比对时， 在两序列的比较中，该百分比的威基或氨基酸残基是相同的。这种比对以 及同源性或同 一性百分比可以利用任何本领域已知的适宜的软件程序来确 定，例如CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F, M. Ausubel等人(编辑)1987，增刊30， 7.7.18节)中所描述的那些。优选的程序 包括Vector NTI AdvanceTM 9.0 (Invitrogen Corp. Carlsbad, CA)、 GCG Pileup程序、FASTA (Pearson等人(1988)7Vfir"，爿ow/. tASL4 85:2444-2448)和BLAST (BLAST Manual, Altschul等人，Natl Cent. Biotechnol. Inf" Natl Lib. Med. (NCIB NLM NIH)， Bethesda， Md.，和 Altschul等人，(1997) NAR 25:3389-3402)。另 一优选的比对程序为ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, PA)，优选寸吏用默i人参数。另一 种有用的序列软件程序是TFASTA数据搜索程序，其可获自6.0版序列软 件包(Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)。
同源性可以确定为两序列之间的同一性程度，表明第一序列自第二序 列的衍生。同源性可以适宜地通过本领域已知的计算机程序来确定，例如GCG程序包(如上文所述)中提供的GAP。因此，可利用GapGCGv8，使用默认的同一性计分矩阵和如下默认参数对于核酸序列比较，分别是空位创建罚分5.0和空位延伸罚分0.3;而对于蛋白质序列比较，分别是空位创建罚分3.0和空位延伸罚分0丄GAP使用Needleman和Wunsch， (1970)，J. Mol. Biol. 48:443-453的方法进行比对和计算同一性。
Amy707 (SEQ ID NO: l)和例如另一 a-淀粉酶之间的结构比对可用来鉴定与Amy707具有高度同源性(例如80%、 85%、 90%、 95%、 97%或99%)的其他a-淀粉酶中的等同/相应位置。获得所述结构比对的一种方法是利用来自GCG包的PileUp程序，使用默认值的空位罚分，即，空位创建罚分3.0，而空位延伸罚分0.1。其他结构比对方法包括疏水簇分析(Gaboriaud等人，(1987)， FEBS LETTERS 224， 149-155页)和反向穿线(reverse threading) (Huber， T; Torda， AE， PROTEIN SCIENCE第7巻，第1期142-149页(1998)。
1.6魁
可用于表征上述Amy707的寡核苷酸探针可适宜地基于所讨论a-淀粉酶的全长或部分核苷酸或tt酸序列来制备。
测试杂交的适宜条件包括在5xSSC中预浸，并在40。C在20%甲酰胺、5xDenhardt溶液、50 mM磷酸钠，pH 6.8和50 mg变性超声破碎的小牛胸腺DNA的溶液中预杂交1小时，接着在补加100mMATP的相同溶液中在40。C杂交18小时，接着在2xSSC， 0.2% SDS中在40。C(低严紧度)洗涤滤膜3次，每次30分钟，优选在5(TC(中严紧度)，更优选在65。C(高严紧度)，甚至更优选在75。C(极高严紧度)。有关杂交方法的更多细节可见Sambrook等人，《分子克隆实验室手册》第二版，冷泉港，1989。
在本上下文中，"来源于"不仅旨在指由所讨论的生物林系产生或可由之产生的a-淀粉酶，而且指由分离自这样的林系的DNA序列编码、且在转化了所述DNA序列的宿主生物中产生的a-淀粉酶。最后，该术语旨在指由合成和/或cDNA来源的DNA序列编码、且具有所讨论a-淀粉酶的识说 别特征的a-淀粉酶。该术语还旨在指亲本a-淀粉酶可以是天然存在a-淀粉 酶的变体，即，由于天然存在a-淀粉酶中一个或多个氨基酸残基的修饰(插 入、取代、缺失)而得到的变体。
本领域技术人员将会意识到，本发明涵盖的序列也可以通过在严谨杂 交条件下与例示的a/wy707序歹'K例如，如图3所示的SEQ ID NO:3)杂交 的能力来定义。当单链形式的核酸能够与另一核酸序列在适当的温度和溶 液离子强度条件下退火时，则该核酸可与另一核酸杂交。杂交和洗涤条件 在本领域众所周知(参见例如Sambrook (1989)，见上，特别是第9和11 章)。在一些实施方案中，严谨条件相当于65。C的Tm和O.lxSSC， 0.1% SDS。
1.7亲本a-淀粉酶
根据本^Hf ，如上文所定义的任何Amy707 a-淀粉酶都可用作亲本(即 骨架)a-淀粉酶。在优选的实施方案中，亲本a-淀粉酶来源于芽孢杆菌属 物种707菌林，例如上文述及的那些之一，例如具有SEQIDNO: 1 (见图 1)所示^J^酸序列的707 a-淀粉酶。
1.8改变的特性
如下章节描述了本文所述变体中存在的突变与可由此产生的期望特性 改变(相对于亲本707 a-淀粉酶的特性而言)之间的关系。
如上文所述，本发明涉及可来源于芽孢杆菌属物种707菌株的a-淀粉 酶及其具有改变特性的变体。
就具体考虑的改变的特性而言，具体考虑的亲本707 a-淀粉酶有上述 亲本707 a-淀粉酶，和包含至少一部分707 a-淀粉酶的亲本杂合a-淀粉酶。
虽然利用芽孢杆菌属物种707菌株a-淀粉酶(SEQ ID NO: l)作为出发 点，但是具有高度同源性的其他芽孢杆菌属a-淀粉酶中的相应位置应理解 为也已公开并作具体考虑。
本发明一方面涉及如上文所述的具有改变特性的变体。第一方面，亲本芽孢杆菌属物种菌林a-淀粉酶的变体包含至少一种、或至少两种如下改 变
(a) C-末端截短，
(b) 氨基酸202(即M202)取代，使用SEQ ID NO:l进行编号，或
(c) 选自R181、 G182、 H182和G184的至少两个残基缺失，使用SEQ ID NO:l进行编号，且其中所述变体具有oc-淀粉酶活性。
1.8.1稳定性
就本文所述的变体而言，对于尤其是在高温(即70-12(TC)和/或极端pH (即低或高pH，即分别为pH 4.0-6.0或pH 8.0-11.0)、特别是在游离(即非 结合的，因此处于溶液中的)钓浓度低于60ppm的情况下实现改变的(即
更高或更低的)稳定性、特别是改善的稳定性而言，重要的突变(包括M 酸取代和缺失)包括"改变的特性"一节中所列的任何突变。稳定性可如下文
"方法"一节中所述来测定。 1.8.2 CaH定性
改变的C,稳定性意味着酶在C,耗竭条件下的稳定性已经得到改 善，即更高或更低的稳定性。就本文所述的变体而言，对于尤其是在高pH (即pH8.0-10.5)情况下实现改变的Ca"稳定性、特别是改善的Ca"稳定性 (即更高或更低的稳定性)而言，重要的突变(包括氨基酸取代和缺失)包括 "改变的特性"一节中所列的任何突变。
1.8.3比活
又一方面，对于获得尤其是在10-60°C、优选20-5(TC、尤其是30-40。C 的温度呈现改变的比活、特别是增加或降低的比活的变体而言，重要的突 变(包括氨基酸取代和缺失)包括"改变的特性"一节中所列的任何突变。比 活可如下文"方法"一节中所述来测定。1.8.4氧化稳定性
所述的变体与亲本a-淀粉酶相比，可以具有改变的氧化稳定性，特别 是更高的氧化稳定性。增加的氧化稳定性在例如洗涤剂组合物方面有利， 而降低的氧化稳定性可以在淀粉液化用组合物方面有利。氧化稳定性可如 下文"方法"一节中所述来测定。
1.8.5改变的pH"i普
对于获得尤其是在高pH (即pH S-10.S)或低pH (即pH 4-6)情况下具 有改变的pH谱、特别是改善的活性的变体而言，重要的位置和突变包括 紧临活性位点残基的氛基酸残基的突变。
优选的具体突变/取代是上文"改变的特性"一节中针对所讨论的位置 所列的那些。适宜的测定法在下文"方法"一节中描述。
1.8.6洗涤性能
对于获得尤其是在高pH (即pH 8.5-11)情况下具有改善的洗涤性能的 变体而言，重要的位置和突变包括上文"改变的特性"一节中针对所讨论的 位置所列的具体突变/取代。洗涤性能可如下文"方法"一节中所述来测试。
2.芽孢杆菌属物种707 ot-淀粉酶、其变体、及其生产方法 因此， 一方面提供了芽孢杆菌属物种707 ot-淀粉酶序列用于创建包括 其他以前确定的M酸取代、缺失、颠换、插入及其组合的重组形式，以 产生芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶的变体。这些变体可以具有另外的生产 力增强、增加的pH稳定性、增加的温度稳定性、减少的Ca"需求、增加 的比活、—增加的餐具洗涤或洗涤性能、增加的溶解性、增加的储存稳定性 或其组合。重组生成变体的方法可利用所提供的序列和载体、或利用本领 域已知的其他形式进行。
2.1克隆编码a-淀粉酶的DNA序列可利用本领域众所周知的多种方法，从产生所讨论(X-淀粉酶的任何细
胞或微生物中分离编码亲本a-淀粉酶的DNA序列。首先，应当利用来自 产生欲研究a-淀粉酶的生物的染色体DNA或信使RNA，构建基因组DNA 和/或cDNA文库。其次，如果该a-淀粉酶的氨基酸序列已知，则可以合 成标记的同源寡核苷酸探针，并利用之从由所讨论生物制备的基因组文库 中鉴定a-淀粉酶编码克隆。可选地，可利用含有同源于已知a-淀粉酶基因 的序列的标记寡核苷酸探针作为探针，利用较低严紧度的杂交和洗涤条件， 来鉴定a-淀粉酶编码克隆。
而鉴定a-淀粉酶编码克隆的另 一方法将包括向表达载体(如质粒)中插 入基因组DNA片段，用所得的基因组DNA文库转化a-淀粉酶阴性细菌， 然后将转化的细菌涂布在含a-淀粉酶底物的琼脂板上，由此能够鉴定表达 a-淀粉酶的克隆。
可选地，可以通过已确立的标准方法，例如，S. L. Beaucage和M. H. Camthers (1981)所述的亚磷酰胺法，或Matthes等人(1984)所述的方法， 来合成制备编码该酶的DNA序列。在亚磷酰胺法中，寡核苷酸在例如自 动化DNA合成仪中合成，纯化，退火，连接，并克隆在适当的栽体中。
最后，DNA序列可以是混合的基因组和合成来源，混合的合成和 cDNA来源，或混合的基因组和cDNA来源，按照标准技术，通过连接合 成、基因组或cDNA来源的片段(适当的情况下，所述片段对应于完整DNA 序列的各部分)制备而来。DN A序列也可以利用特异性引物通过聚合i^ 式反应(PCR)来制备，例如如美国专利No. 4，683，202或R. K. Saiki等人 (1988)所述的那样。
2.2定点诱变
一旦已经分离了编码a-淀粉酶的DNA序列，并鉴定了期望的突变位 点，则可以利用合成寡核苷酸引入突变。这些寡核苷酸含有侧接期望突变 位点的核苷酸序列；突变的核苷酸在寡核苷酸合成期间插入。在一个具体 方法中，在携带a-淀粉酶基因的载体中创建桥接a-淀粉酶编码序列的单链DNA缺口。然后使带有期望突变的合成核苷酸与该单链DNA的同源部分 退火。随之由DNA聚合酶I (Klenow片段)补平余下的缺口，并利用T4 连接酶连接该构建体。此方法的具体实例在Morinaga等人(1984)中描述。 美国专利No. 4,760,025公开了通过对盒进行微'J、改变而引入编码多重突变 的寡核苷酸。然而，Morinaga法能够于任何一次引入甚至更多种突变，因 为能够引入各种长度的多种寡核苷酸。
向编码a-淀粉酶的DNA序列中引入变体的另一种方法在Nelson和 Long (1989)中描述。该方法包括3步生成含有通过利用化学合成的DNA 链作为PCR反应引物之一而引入的期望突变的PCR片段。可通过限制性 内切酶切割而从所述PCR生成的片段中分离携带突变的DNA片段，并重 新插入到表达质粒中。
3. a-淀粉酶变体的生产
由本文所述方法或由任何本领域已知的替代方法所产生的、编码芽孢 杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体的DNA序列，能够利用表达载体表达 为酶的形式，所逸表达栽体一般包括编码适宜的启动子、操纵基因、核糖 体结合位点、翻译起始信号、和任选的阻遏基因和/或各种激活基因的控制 序列。
携带编码a-淀粉酶变体的DNA序列的重組表达载体可以是任何可方 便地进行重组DNA操作的载体，并且载体的选择通常将取决于其待引入 的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即以染色体外实体形式存 在的载体，其复制与染色体复制无关，例如质粒、噬菌体或染色体外元件、 微染色体或人工染色体。或者，载体可以是当被引入到宿主细胞中后整合 到宿主细胞基因组中并与其所整合到的染色体一起复制的载体。该整合的 基因也可以通过使用可扩增构建体来扩增，以在染色体中产生该基因的多 个拷贝，所述可扩增构建体由抗生素选择或者其它选择压力(例如必需调控 基因)来驱动，或者通过互补作用利用必需代谢途径基因的剂量效应来驱 动。载体中，DNA序列应与适宜的启动子序列有效连接。启动子可以是任 何在所选宿主细胞中显示转录活性的DNA序列，并且可源自编码与宿主 细胞同源或异源的蛋白质的基因。可用于指导编码a-淀粉酶变体的DNA 序列转录(尤其在细菌宿主中)的启动子实例有大肠杆菌lac操纵子的启动 子、天蓝色链霉菌(&"/^附yc" 0^//co/or)琼脂糖酶基因dagA或celA启 动子、地衣芽孢杆菌a-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌产 麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌a-淀粉酶(amyQ)的 启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。对于真菌宿主中的 转录，有用的启动子的实例是源自编码米曲霉(^f/^/^7/附TAKA 淀粉酶、米黑根毛霉(及/^o附Mtw鹏'e/i")天冬氨酸蛋白水解酶、黑曲霉 (^印^^///附《^^)中性01-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性a-淀粉酶、黑曲霉葡糖 淀粉酶、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶 或构巢曲霉(A附Ww/fl附)乙酰胺酶的基因的那些启动子。当在诸如大肠杆菌 的细菌物种中表达编码芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体的基因时， 可以例如从噬菌体启动子(包括T7启动子和X噬菌体启动子)中选择适宜的 启动子。适于在酵母物种中表达的适宜启动子的实例包括但不限于酿酒酵 母C^cd^fw^c^ ccev/w'"e)的Gal 1和Gal 10启动子和巴斯德毕赤酵母 (尸/d/a/7flsto^)的AOX1或AOX2启动子。对于在里氏木霉中的表达，也 可使用CBHII启动子。
表达载体也可包括与编码芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体的 DNA序列有效连接的适宜转录终止子以及，在真核生物中，多腺苷酸化序 列。终止序列和多腺苷酸化序列可适宜地但不必需源自与启动子相同的来 源。
载体还可包括使载体能够在宿主细胞中复制的DNA序列。此类序列 的实例A^粒pBR322、 pUC19、 pACYC177、 pUB110、 pE194、 pAMBl、 pICatH (图4， Genencor International, Inc.)、 pHPLT和pIJ702以及由本
领域技术人员已知的必需元件构建的载体的复制起点。
载体也可包括选择标记，例如其产物能在宿主细胞中弥补缺陷的基因，例如来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的由/基因，或者赋予抗生素抗性 (例如氨节青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的基因。此外，载体
可包括曲霉属(^^/^^///附)选择标记，例如"/m/S、 "rg必、肌ViZ)和x^C(产 生潮霉素抗性的标记)，或者可通过诸如本领域已知的共转化实现选择。参 见例如，国际PCT申请WO 91/17243。
虽然细胞内表达或固态发酵在一些方面可能是有利的，例如当使用某 些细菌或真菌作为宿主细胞时，但一般酶的表达是在胞外且在培养基中。 一般，本文述及的芽孢杆菌属物种707 oi-淀粉酶及其变体包括信号多肽形 式，允许所表达的酶分泌到培养基中。如果期望，这种信号多肽肽可由不 同的信号多肽代替，这可以通过编码相应信号多肽的DNA序列的取代而 方便地实现。所述信号多肽通常表征为具有三个结构域，即N-末端结构域、 H-结构域和C-末端结构域，且长度范围在18-35个残基。这些可以来自任 何野生型信号a-淀粉酶或其他来自细菌或真菌的分泌蛋白质。
表达载体通常包括克隆载体的组分，例如允许载体在所选的宿主生物 中自主复制的元件和一种或多种用于选择目的的表型可检测标记。表达载 体通常包括控制核苷酸序列，例如启动子、操纵基因、核糖体结合位点、 翻译起始信号和任选的阻遏基因或者一种或多种激活基因。通常利用信号 序列将物质靶向至细胞培养基，以易于酶收集和适用情况下的纯化。
用于分别连接编码芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶及其变体的DNA构 建体、启动子、终止子和其他元件，以及将它们插入到含有复制所需信息 的适宜载体中的方法是本领域技术人员公知的(参见例如，Sambrook等人， 《分子克隆实验室手册》第二版，冷泉港，1989,和第三版，2001)。
有益地，将含有DNA构建体或表达载体的分离的细胞用作重组生产 芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体的宿主细胞。可用编码变体的DNA 构建体，通过将该DNA构建体(以 一个或多个拷贝)整合到宿主染色体中而 方便地转化细胞。通常认为这种整合是有利的，因为DNA序列更有可能 稳定地维持在细胞中。可以根据常规方法，例如通过同源或异源重组实现 DNA构建体向宿主染色体的整合。或者，可以用上述有关不同类型宿主细胞的表达载体转化细胞。
适宜的细菌宿主生物的实例为革兰氏阳性细菌物种，例如芽孢杆菌科
CB""7/"c^ie),包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟緩芽孢杆菌、短芽孢 杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽胞杆 菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(5fl"7/ws w^tffeW"w)和苏云金芽孢杆菌； 链霉菌属物种如鼠灰链霉菌；乳酸细菌物种，包括乳球菌属物种 (丄ff"oo cc"s1 spp.)， ^口專'L酸專L球菌(丄tfctoc0cc"s1 乳杆菌属物种 (丄fl"o6ac/〃ws spp.)，包括罗伊氏乳杆菌(la"o6tfc/〃Ms "w,e〃〕；明串珠菌属
物种(/^MCWIO加C Spp.)， 片球菌属物种(JW/0CWC附Spp.)和链球菌属物种
(S^/7似coccws spp.)。或者，可以选择属于肠杆菌科CE"fero6flr"er/amie)(包 括大肠杆菌)或者属于假单胞菌科(/Vw^wo" 的革兰氏阴性细菌
物种的菌林作为宿主生物。适宜的酵母宿主生物可以选自生物技术相关酵 母物种，例如但不限于酵母物种，如毕赤酵母属物种、汉逊酵母属物种、 或克鲁维酵母属(/T/Mjn^w/y;c")、耶氏酵母属(FarwHvVnVO物种，或酵母属 (S"cc^flro附^M)物种，包括酿酒酵母；或属于裂殖酵母属 (Sd^仍acc/iflww^es)的物种，如粟酒裂殖酵母(51. /ww6e)物种。甲基营养 酵母物种巴斯德毕赤酵母的菌林可以用作宿主生物。或者，宿主生物可以 是汉逊酵母属物种。丝状真菌中适宜的宿主生物包括曲霉属物种，例如黑 曲霉、米曲霉、塔宾曲霉(^pe/^7/附似6Zge"wX)、泡盛曲霉(v4s/wgi7/"s "H^f附on)或构巢曲霉。或者，镰孢霉属CF"^w7Vi附)物种，i口尖镰孢(iFYisflr/ww ax^/ww附)或根毛霉属(/ /i/zcwiwcwO物种，如米黑才艮毛霉，可以用作宿主 生物。其他适宜的菌林包括嗜热丝孢菌属(77^f7mw^cM)和毛霉属(Mwcw) 物种。
示例性酵母物种包括酵母属或裂殖酵母属的物种，例如酿酒酵母。丝 状真菌可以有利地属于曲霉属的物种，例如米曲霉或黑曲霉。真菌细胞可 以通过包括原生质体形成及原生质体转化/转染、接着再生细胞壁的方法以 其本身已知的方式进行转化。转化曲霉属宿主细胞的适宜操作包括例如 EP238023中所述的那些。再又一方面，提供了生产芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体的方 法，该方法包括在有利于变体生产的条件下培养上述宿主细胞，并从该细 胞和/或培养基中回收变体。
用于培养细胞的培养基可以是任何适于所讨论宿主细胞生长和获得芽
孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体表达的常规培养基。适宜的培养基和 培养基组分可获自商品供应商(例如Difco )，或可根据公开的配方制备(例 如按美国典型培养物保藏中心的目录所述)。所用的培养基将是最适合于正
在使用的宿主细胞的。例如下文所讨论的用于培养地衣芽孢杆菌的培养基。
来源，连同无机盐作为钠、钾、磷酸盐、镁和硫酸盐的来源，以及微量元 素。通常，糖类来源如葡萄糖也是初始培养基的一部分。 一旦培养物自身 已经建立并开始生长，便向罐中定量供应糖类，以便如本领域已知的那样 维持培养物。定期从发酵罐中取样，以便利用例如比色测定法来测量酶滴 度。根据测量，当酶生产速率停止增加时，中断发酵过程。
可通过/>知的方法从培养基中回收由宿主细胞分泌的芽孢杆菌属物种 707 a-淀粉酶或其变体，包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，通过 诸如硫酸铵的盐沉淀培养基中的蛋白质组分，随后使用诸如离子交换色谱、 亲和色镨等的色谱方法。
可在允许芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体表达的适宜条件下培 养宿主细胞。蛋白质的表达可以是组成型的，从而它们可以连续生产，或 是诱导型的，从而需要刺激来起始表达。在诱导型表达的情况下，当需要 时可以通过例如向培养基中加入诱导物(例如地塞米木^或IPTG或 Sepharose)来起始蛋白质生产。也可以在体外无细胞体系(例如TnT1 (Promega)兔网织红细胞体系)中重组生产多肽。
也可以在有氧条件下，于对宿主适合的培养基中培养表达芽孢杆菌属 物种707 a-淀粉酶或其变体的宿主。可以提供振荡或搅拌及通风的组合， 在对于该宿主适合的温度例如约30。C至约75。C进^"生产，这取决于宿主的 需要以及生产期望酶的需要。培养可以进行约12至约100小时或更长(以及其间的任何小时时间值)，或例如24-72小时，或者约75小时至约120 小时。通常，培养物肉汤pH约5.5至约8.0，这也取决于宿主细胞相对于 酶生产而言所需的培养条件。
用于确定活性的测定法在本领域公知。参见例如美国专利No. 6,297,037。例如，可实施可溶底物测定法来确定变体的活性。这可例如通 过基于Megazyme (Aust.) Pty, Ltd.提供的终点测定试剂盒所开发的速率测 定法来进行。将底物对硝基苯麦芽七糖苷(p-nitrophenyl maltoheptaoside， BPNPG7)溶于10 mL无菌水中，接着在测定緩冲液(50 mM马来酸盐緩冲 液，pH 6.7， 5 mM氯化钓，0.002% Tween 20)中进行1比4的稀释。通过在 25。C向比色管的7卯nL底物中加入10pL a-淀粉酶来进行测定。水解速率 测定为75秒延迟后410 nm处吸光度的变化速率。该测定通常是线性的， 至高达0.4个吸光度单位/分钟的速率。酶浓度可以利用例如基于M. Bradford, /4wfl/. 5/oc/^附.72:248 (1976)方法的Bio-Rad测定(Bio-Rad Laboratories)和利用牛血清白蛋白标准品来测量。
可执行用以评估变体活性的另一测定法是淀粉水解测定法。这可以例 如按如下进行。可使用用于测定Spezyme⑧AA20 a-淀粉酶活性的标准方 法，或本领域已知的其他可选方法。Spezyme AA20测定法描述在例如美 国申请No. 07/785,624的实施例1中，并入本文作为参考。天然淀粉与硪 形成蓝色，但当其水解成较短的糊精分子时则不能如此。底物可为溶于磷 酸盐緩冲液，pH 6.2 (42.5克/升磷酸二氢钾、3.16克/升氢氧化钠)中的5 g/L 可溶Lintner淀粉。将样品添加在25 mM氯化钙中，活性测量为在30°C 孵育时给出阴性碘检查所需的时间。活性记录为每克或每mL的liquefon (LU),按照如下公式计算
LU/mL或LU/g = (570) x D
Vxt
其中LU = liquefon单位；V =样品体积(5 mL); t =糊精化时间(分钟)； D=稀释因子=稀释体积/mL或g所加入的酶。4. a-淀粉酶变体的纯化
发酵、分离和浓缩技术是本领域已知的，并且可以使用常规方法以制 备浓缩的含有芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体的溶液。
发酵后，获得发酵肉汤，通过常规分离技术除去微生物细胞和各种悬 浮的固形物(包括残留的发酵原料)以便获得含酶溶液。通常使用过滤、离 心、微量过滤、转鼓真空过滤、超滤、提取或色镨法等。
为优化回收，浓缩含酶溶液是值得的。为收集纯化的含酶沉淀物，未 浓缩溶液的使用需要增加的孵育时间。
可以使用任何本领域已知的可得方式浓缩含有芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体的溶液，直到获得期望的酶水平。例如，可通过上文讨论 的任何技术实现含酶溶液的浓缩。例如可以应用转鼓真空蒸发和/或超滤或 单独的超滤。
用于纯化目的的"沉淀剂，，指有效从浓缩的酶溶液中以固体形式(不管 其性质如何，即晶体、无定形或两者混合物)沉淀芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体的化合物。
例如，可以使用金属卣化物沉淀剂进行沉淀。金属卣化物沉淀剂包括 但不限于碱金属氯化物、碱金属溴化物和这些金属囟化物中两种或更多 种的混合物。示例性金属卣化物包括氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾和 这些金属卣化物中两种或更多种的混合物。或者，可从氯化钠和氯化钾中 选择金属卣化物。至于氯化钠，其既可用作金属囟化物沉淀剂，又可用作 防腐剂。
以有效沉淀芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体的量使用金属卣化 物沉淀剂。在常规试验后，本领域普通技术人员可以显而易见地至少选择 出能够有效地致使酶沉淀的金属卣化物的有效量和最佳量、以及实现最大 回收的沉淀条件，包括孵育时间、pH、温度和酶浓度。
通常，向浓缩的含酶溶液中加入至少约5% w/v (重量/体积)至约25% w/v的金属卣化物，且通常是至少8。/。w/v。通常，向浓缩的含酶溶液中加 入不超过约25% w/v的金属卣化物，且通常是不超过20% w/v。金属卣化物沉淀剂的最适浓度将取决于例如芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体 的性质及其浓度等。
另一可选的实现酶沉淀的方法是有机化合物的应用，其可以添加到浓 缩的酶溶液中。有机化合物沉淀剂可以包括4-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲 酸的碱金属盐、4-羟基苯甲酸的烷基酯、以及这些有机化合物中两种或更 多种的混合物。所述有机化合物沉淀剂的添加可以在金属卣化物沉淀剂的 添加之前、与其同时或在其后发生，并且两类沉淀剂(有机化合物和金属闺 化物)的添加都可顺序进行或同时进行。
有关进一步的说明，参见例如美国专利No， 5,281,526。通常，有机化 合物沉淀剂选自4-羟基苯甲酸的碱金属盐(例如钠或钾盐)，以及4-羟基苯 甲酸的线性或分支的烷基酯(其中烷基含有1-12个碳原子)，以及这些有机 化合物中两种或更多种的混合物。有机化合物沉淀剂可以是例如4-羟基苯 甲酸的线性或分支的烷基酯(其中烷基含有l-10个碳原子)，以及这些有枳i 化合物中两种或更多种的混合物。例如，有机化合物可以是4-羟基苯曱酸 的线性烷基酯(其中烷基含有1-6个碳原子)，以及这些有机化合物中两种或 更多种的混合物。也可以使用4-羟基苯甲酸的曱基酯、4-羟基苯甲酸的丙 基酯、4-羟基苯甲酸的丁基酯、4-羟基苯甲酸的乙基酯以及这些有机化合 物中两种或更多种的混合物。其它有机化合物还包括但不限于4-羟基苯甲 酸甲酯(称为甲基PARABEN)、 4-羟基苯甲酸丙酯(称为丙基PARABEN), 两者也是淀粉酶防腐剂。
所述有机化合物沉淀剂的添加提供了沉淀条件高度灵活性的优势(就 pH、温度、酶浓度、沉淀剂浓度和孵育时间而言)。
以有效提高金属囟化物沉淀剂引起的酶沉淀的量使用有机化合物沉淀 剂。基于本发明公开，在常规试验后，本领域普通技术人员将可以显而易 见地至少选择出有机化合物沉淀剂的有效量和最佳量、以及用于实现最大 回收的沉淀条件，包括孵育时间、pH、温度和酶浓度。
通常，向浓缩的含酶溶液中加入至少0.01% w/v (重量/体积)的有机化 合物沉淀剂，且通常至少0.02% w/v。通常向浓缩的酶溶液中加入不多于0.3% w/v (重量/体积)的有机化合物沉淀剂，且通常不多于0.2% w/v。
必然地根据待纯化的酶，可调整含有金属闺化物沉淀剂和有机化合物 沉淀剂的浓缩酶溶液的pH。通常，将pH调整至芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体的等电点附近。通常，将pH调整至处于如下范围的pH: 低于等电点(pl)约2.5个pH单位至高于等电点约2.5个pH单位。为举例 说明目的，可将浓缩的含酶溶液调整至约5.5-9.7的pH或约6.5-9.0的pH。 可以类似地制定芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体的pH范围变化。
获得纯化的酶沉淀物所需的孵育时间取决于具体酶的性质、酶浓度、 以及具体的沉淀剂(一种或多种)及其浓度。通常，有效沉淀酶的时间为约1 至约30小时之间；通常不超过约25小时。在有机化合物沉淀剂存在下， 孵育时间还可以减至小于约10小时，且在大多数情况下甚至是约6小时。
通常，孵育期间的温度为约4。C至约50。C。通常，在例如约10。C至约 45。C或约20。C至约40。C的温度进行所述方法。用于诱导沉淀的最佳温度根 据溶液条件和所用酶或沉淀剂而变化。
可以通过搅拌包括酶、添加的金属囟化物和添加的有机化合物的溶液， 来提高纯化的酶沉淀物的总回收率以及该方法的实施效率。在添加金属卤 化物和有机化合物期间，以及在随后的孵育期均可以进行搅拌步骤。适宜 的搅拌方法包括才几械搅拌或振荡、强有力的通风或任何类似的技术。
孵育期后，随之通过常规分离技术，例如过滤、离心、孩史量过滤、旋 转真空过滤、超滤、压滤、交叉膜微量过滤(cross membrane microfiltration)、交叉流膜微量过滤等，自解离的色素以及其他杂质中分 离和收集纯化的酶。可以通过用水洗涤沉淀物获得对纯化的酶沉淀物的进 一步纯化。例如，用含有金属卣化物沉淀剂的水，或用含有金属卣化物和 有枳i化合物沉淀剂的水来洗涤纯化的酶沉淀物。
培养期间，淀粉酶胞外累积在培养物肉汤中。为了分离和纯化期望的 芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体，离心或过滤培养物肉汤以除去细 胞，并利用所得的无细胞液体进行酶纯化。在一个实施方案中，使用约70% 饱和度的硫酸铵对无细胞肉汤进行盐析；然后将70%饱和度沉淀的级分溶解在緩沖液中并施加到诸如S印hadex G-100柱等柱中，然后洗脱以回收酶 活性级分。为了进一步的纯化，可使用诸如离子交换色谦等常规方法。可 选地，可应用有机絮凝剂絮凝细胞或细胞碎片，以通过过滤或离心除去细 胞及细胞碎片。絮凝剂可单独或与金属卣化物或本文所述的任何步骤组合 使用。通常，酶浓度可以是4 g/L或更高的数量级，且在一些应用中超过 25g/L或更高。
纯化的酶可用于通常利用该酶的所有应用中。例如，它们可以用于洗 衣洗涤剂和除斑剂，用于食品工业，用于淀粉加工和烘焙，且可作为消化 助剂用于药物组合物。可以将它们制成液体(溶液、浆液)或固体(颗粒、粉 末)终产物。本文描述了纯化的芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体的制 剂。
可如本文一般性描述的那样来部分地纯化酶。这包括用聚合物通过絮 凝除去细胞，或者使用膜和可用材料进行」微量过滤、超滤浓缩。对于一些 应用，可能不需要纯化酶，可以裂解全肉汤培养物，且无需进一步处理而 4吏用之，或加工成颗粒或微颗粒。
5.清洁和餐具洗涤组合物及用途
可以将本文讨论的芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体配制在用于 清洁餐具的洗涤剂组合物中或其他清洁组合物中。这些组合物可以是粉末 或液体。例如，組合物可以是颗粒或微颗粒的形式。多肽可按已知的方法 进一步被稳定化。组合物可以包括芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体 (单独地)、其他淀粉分解酶、其它清洁酶以及清洁組合物常用的其他组 分。
组合物可以包括芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体作为主要的酶 组分，例如单组分组合物。或者，组合物可以包括多种酶活性，例如氨肽 酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、 环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苷酶、P-半乳糖苷 酶、葡糖淀粉酶、oi-葡萄糖苷酶、j5-葡萄糖苷酶、囟代过氧化物酶(haloperoxidase)、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶裂 解(pectinolytic)酶、肽基谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、 过氧化物酶、 植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖 酶。这些其他酶可通过属于曲霉属、木霉属、腐质霉属(i/w附/"/")及镰孢
霉属的樣i生物生产。示例性曲霉属成员包括棘孢曲霉(A flCW/efl似s)、泡盛
曲霉、黑曲霉或米曲霉。示例性腐质霉属成员包括特异腐质霉(好M/m'co/" /wm/^w);示例性镰孢霉属成员包括杆孢状镰孢(尸.6flC,V//wV^s)、 F. cemi//51、 F. m^wZ/mse 、 大刀嫌抱(尸.cw/附ori/附)、禾本科嫌抱(F. gr"附/rte"/"M附)、禾赤錄抱(尸.gm附/履附)、异抱錄抱(F. /r"ems/wi/附)、合 欢木镰孢(F. M^""力)、尖镰孢、多枝镰孢(F. "//c /W"/w)、粉红镰孢(尸. raseM附)、接骨木錄抱(尸.s"附6wc/WW附)、狭色錄抱(77. 5YWCOcArOM附)、石危色
錄抱(F. 5^//7/rwre"附)、K ,orw/osew附、才以丝抱錄抱(F. Zn'cAo幼ec/0iVifey)和jF.
因此，餐具洗涤洗涤剂组合物可以包括表面活性剂。表面活性剂可以 是阴离子型、非离子型、阳离子型、两性离子型或这些类型的混合。洗涤 剂可以含有0%至约90%的非离子表面活性剂，例如低泡或无泡型乙氧基 化丙氧基化直链醇。
在洗涤剂应用中，芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体可用在含丙 二醇的液体组合物中。例如通过在含有10%氯化钙的25%体积/体积丙二 醇溶液中循环，使芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体溶解于丙二醇。
洗涤剂组合物可含有无才几和/或有机类型的洗涤剂助剂盐。洗涤剂助剂 可细分为含磷和不含磷的类型。洗涤剂组合物通常含有约1%至约卯％的 洗涤剂助剂。当存在含磷的无积减性洗涤剂助剂时，其实例包括水溶性盐， 尤其是碱金属焦磚酸盐、正磷酸盐和聚磷酸盐。当存在含磷的有机碱性洗 涂剂助剂时，其实例包括水溶性膦酸盐。当存在不含磷的无机助剂时，其 实例包括水溶性碱金属碳酸盐、硼酸盐和硅酸盐以及多种类型的水不溶性 晶体或无定形硅铝酸盐，其中沸石是最为公知的代表。
适宜的有机助剂的实例包括碱金属；铵盐和取代的铵盐；柠檬酸盐；琥珀酸盐；丙二酸盐；脂肪酸磺酸盐；氣基甲氧基琥珀酸盐；聚乙酸铵； 羧酸酯；聚羧酸酯；氨基聚羧酸酯；聚乙酰基羧酸酯和多羟基磺酸酯 (polyhydroxsulphonates)。
其它适宜的有机助剂包括已知具有助剂性能的较高分子量的聚合物和 共聚物，例如适当的聚丙烯酸、聚马来酸和聚丙烯^/聚马来酸共聚物，及 它们的盐。
清洁组合物可含有氯/溴类型或氧类型的漂白剂。无机氯/溴类型漂白 剂的实例是锂、钠或钙的次氯酸盐和次溴酸盐，以及氯化磷酸三钠。有机 氯/溴类型漂白剂的实例是杂环N-溴和N-氯亚胺，如三氯异氰脲酸、三溴 异氰脲酸、二溴异氰脲酸、和二氯异氰脲酸，及其与7JC增溶性阳离子(如钾 和钠)的盐。乙内酰脲化合物也是适宜的。
清洁组合物可含有氧漂白剂，例如无机过酸盐的形式，任选地还含有 漂白前体，或作为过氧酸化合物的形式。适宜的过氧漂白化合物的典型实 例是碱金属过硼酸盐(四水合物和一水合物)，碱金属过碳酸盐、过硅酸盐 和过磷酸盐。示例性的活性剂材料包括TAED和三乙酸甘油酯。
可使用常规用于酶的稳定剂来稳定清洁组合物，例如多元醇如丙二醇、 糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(例如硼酸芳香酯)。
清洁組合物也可含有其它常规洗涤剂成分，例如反絮凝剂材料、填充 剂材料、消泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、多价螯合剂、防污垢再沉积剂、脱 水剂、染料、杀菌剂、荧光剂、增稠剂和香料。
芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体可用于常规餐具洗涤洗涤剂 中，例如用于任何如下专利公开中所述的任何洗涤剂中(考虑该芽孢杆菌属 物种707 a-淀粉酶或其变体可包含信号序列，例如来自例如如下专利和专 利申请中所列任何芽孢杆菌属a-淀粉酶的信号序列)CA 2006687、 GB 2200132、 GB 2234980、 GB 2228945、 DE 3741617、 DE 3727911、 DE 4212166、 DE 4137470、 DE 3833047、 DE 4205071、 WO 93/25651、 WO 93/18129、 WO 93/04153、 WO 92/06157、 WO 92/08777、 WO 93/21299、 WO 93/17089、 WO 93/03129、 EP 481547、 EP 530870、 EP 533239、 EP554943、 EP 429124、 EP 346137、 EP 561452、 EP 318204、 EP 318279、EP 271155、 EP 271156、 EP 346136、 EP 518719、 EP 518720、 EP 518721、EP 516553、 EP 561446、 EP 516554、 EP 516555、 EP 530635、 EP 414197、美国专利No. 5,112,518、美国专利No. 5,141 ，664和美国专利No. 5,240,632。这些組合物既可用在手工又可用在自动餐具洗涤条件。示例性制剂包括但不限于如下
1) 粉末自动餐具洗涤组合物非离子表面活性剂0.4-2.5%;偏硅酸钠
0- 20%;焦硅酸钠3-20%;三磷酸钠20-40%;碳酸钠0-20%;过硼酸钠2-9%;四乙酰基乙二胺(TAED)l-4o/o;硫酸钠5-33%;和酶0.0001-0.1%。
2) 粉末自动餐具洗涤组合物非离子表面活性剂(例如醇乙氧基化物)
1- 2%;焦硅酸钠2-30%;碳酸钠10-50%;膦酸钠0-5%; 二水合柠檬酸三钠9-30%;次氮基三乙酸钠(NTA)0-20。/。； 一7JC合过硼酸钠5-10%;四乙酰基乙二胺(TAED); 1-2%聚丙烯酸聚合物(例如马来^/丙烯酸6-25%共聚物)；酶0.0001-0.1%;香料0.1-0.5%;和水5%-10%。
3) 粉末自动餐具洗涤组合物非离子表面活性剂(例如醇乙氧基化物)1-2%;焦硅酸钠2-30%;碳酸钠10-50%;膦酸钠0-5%; 二7JC合柠檬酸三钠9-30%;次氮基三乙酸钠(NTA)0-20。/。； 一水合过硼酸钠5-10%;四乙酰基乙二胺(TAED) 1-2%;聚丙烯酸聚合物(例如马来i^/丙烯酸6-25%共聚物)；酶0.0001-0.1%;香料0.1-0.5%;和水5%-10%。
4) 粉末自动餐具洗涤组合物非离子表面活性剂1-2%;沸石MAP15-42%;焦硅酸钠30-34%;柠檬酸钠0-12%;碳酸钠0-20%; —7JC合过硼酸钠7-15%;四乙酰基乙二胺(TAED) 0-3%;聚合物0-4%;马来^/丙烯酸共聚物0-5%;有机膦酸盐0-4%;粘土 1-2%;酶0.0001-0.1%;制剂余量为硫酸钠。
5) 粉末自动餐具洗涤组合物非离子表面活性剂1-2%;沸石MAP15-42%;焦硅酸钠30-34%;柠檬酸钠0-12%;碳酸钠0-20%; —水合过硼酸钠7-15%;四乙酰基乙二胺(TAED) 0-3%;聚合物0-4%;马来l丙烯酸共聚物0-5%;有机膦酸盐0-4%;粘土 1-2%;酶0.0001-0.1%;制剂余量为硫酸钠。
6) 粉末自动餐具洗涤组合物非离子表面活性剂1-2%;沸石MAP15-42%;焦硅酸钠30-34%;柠檬酸钠0-12%;碳酸钠0-20%; —水合过硼酸钠7-15%;四乙酰基乙二胺(TAED) 0-3%;聚合物0-4%;马来^/丙烯酸共聚物0-5%;有机膦酸盐0-4%;粘土 1-2%;酶0.0001-0.1%;制
剂余量为硫酸钠。
7) 非水性液体自动餐具洗涤组合物液体非离子表面活性剂(例如醇乙氧基化物)2.0-10.0%;碱金属珪酸盐3.0-15.0%;碱金属磷酸盐20.0-40.0%;从高级二元醇、聚二元醇中选择的液体载体25.0-45.0%;多
氧化物、二元醇醚稳定剂(例如，磷酸的部分酯和0.5-7.0%<:16-<:18烷醇)；
抑泡剂(例如，聚珪氧烷)0-1.5%;和酶0.0001-0.1%。
8) 非水性液体餐具洗涤组合物液体非离子表面活性剂(例如醇乙氧基化物)2.0-40.0%;硅酸钠3.0-15.0%;碱金属碳酸盐7.0-20.0%;柠檬酸钠0.0-1.5%;稳定体系(例如，细粒0.5-7.0%聚硅氧烷和低分子量二烷基聚二元醇醚的混合物)；低分子量聚丙烯酸聚合物5.0-15.0%;粘土凝胶增稠剂(例如斑脱土) 0.0-10.0%;羟丙基纤维素聚合物0.0-0.6%;酶0.0001-0.1%;和余量的从高级二元醇、聚二元醇、多氧化物和二元醇醚中选择的液体栽体。
9) 非水性液体餐具洗涤组合物液体非离子表面活性剂(例如醇乙氧基化物)2.0-40.0%;珪酸钠3.0-15.0%;碱金属碳酸盐7.0-20.0%;柠檬酸钠0.0-1.5%;稳定体系(例如，细粒0.5-7.0%聚硅氧烷和低分子量二烷基聚二元醇醚的混合物)；低分子量聚丙烯酸聚合物5.0-15.0%;粘土凝胶增稠剂(例如斑脱土) 0.0-10.0%;羟丙基纤维素聚合物0.0-0.6%;酶0.0001-0.1%;和余量的从高级二元醇、聚二元醇、多氧化物和二元醇醚中选择的液体载体。
10) 液体自动餐具洗涂组合物醇乙氧基化物0-20%;脂肪酸酯磺酸盐0-30%;十二烷基硫酸钠0-20%;烷基多苷0-21%; 酸0-10%; —水合焦硅酸钠18-33%; 二7jc合柠檬酸钠18-33%;硬脂酸钠0-2.5%; —水合过硼酸钠0-13%;四乙酰基乙二胺(TAED) 0-8%;马来^/丙烯酸共聚物
11) 液体自动餐具洗涤组合物醇乙氧基化物0-20%;脂肪酸酯磺酸盐0-30%;十二烷基^L酸钠0-20%;烷基多苷0-21%;油酸0-10%; —水合焦硅酸钠18-33%; 二7jc合梓樣酸納18-33%;石更脂酸钠0-2.5%; —7jc合过硼酸钠0-13%;四乙酰基乙二胺(TAED) 0-8%;马来^/丙烯酸共聚物4-8%;和酶0.0001-0.1%。
12) 如1)、 2)、 3)、 4)、 6)和IO)中所述的自动餐具洗涤组合物，其中过硼酸盐被过碳酸盐代替。
13) 如l)-6)中所述的自动餐具洗涤组合物，还含有锰催化剂。
6.洗衣洗涤剂组合物及用途
根据一个实施方案，通常一种或多种芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体可为洗衣洗涤剂组合物的组分。同样地，其可以以无粉尘颗粒、稳定的液体或受保护的酶的形式包括在洗涤剂组合物中。干燥制剂可以是颗粒或孩l颗粒的形式。可以例如，按美国专利No. 4，106，991和4,661,452所公开的那样来生产无粉尘颗粒，并且可任选地由本领域已知的方法进行包衣。蜡质包衣材料的实例是平均分子量为l，OOO至20,000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG);具有16-50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有12-20个碳原子，且其中有15-80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯及甘油三酯。例如英国专利No. 1483591给出了适于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例。可例如通过加入多元醇诸如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸，按照已建立的方法来稳定液态酶制品。其它酶稳定剂是本领域公知的。可按照例如EP申请No. 238,216公开的方法来制备受保护的酶。长期以来多元醇被公认为蛋白质的稳定剂，而且可以提高蛋白质的溶解性，参见例如，J. K. Kaushik等人，"Why is trehalose an exceptional protein stabilizer Ananalysis of the thermal stability of proteins in the presence of thecompatible osmolyte trehalose" / 5,7 /. C7^附.278: 26458-65 (2003)以及其中引用的参考文献；和M. Conti等人"Capillary isoelectric focusing: theproblem of protein solubility," / C7if0附atogra/7/^ 757: 237-245 (1997)。
组合物可以包括芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体作为主要的酶组分，例如单组分组合物。或者，组合物可以包括多种酶活性，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苷酶、P-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡萄糖普酶、P-葡萄糖苷酶、卣代过氧化物酶(haloperoxidase)、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶裂解(pectinolytic)酶、肽基谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶，以及下文所讨论的其他酶。这些其他酶可通过属于曲霉属、木霉属、腐质霉属(例如特异腐质霉)及镰孢霉属的微生物生产。示例性曲霉属成员包括棘孢曲霉、泡盛曲霉、黑曲霉或米曲霉。示例性镰孢霉属成员包括杆孢状錄孢、F附"r/"附cemi//s\ F"s肌'w附m^w/Zm^ 大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、石克色镰孢、F附tfW"附torM/仍ew柳、拟丝孢镰抱和F附ar/w附micw幽附。
洗涤剂组合物可以是任何便利的形式，例如粉末、颗粒、糊剂或液体。液体洗涤剂可以是水性的，通常含有高达约70%的水和0%至约30%的有机溶剂。其也可以是只含有约30。/。水的压缩胶(compact gel)类型的形式。酶可以用在与酶的稳定性兼容的任何洗涤剂组合物中。通常可以用已知的包嚢化形式(例如通过在水凝胶中粒化或隔离)来保护酶免于遭遇有害组分。酶，尤其是a-淀粉酶，不局限于洗衣和餐具洗涤应用，而且可用于表面清洁剂，以及用于由淀粉或生物质(biomass)生产乙醇。
洗涤剂组合物可以包括一种或多种表面活性剂，其中每种都可以是阴离子型、非离子型、阳离子型或两性离子型。洗涤剂将通常含有0%至约50%的阴离子表面活性剂，例如线性烷基M酸盐(LAS); a-烯烃磺酸盐(AOS);烷^i^危酸盐(月旨肪醇硫酸盐)(AS);脂肪醇乙氧^5克酸盐(AEOS或AES);仲烷基磺酸盐(SAS); a-磺基脂肪酸甲酯；烷基或烯基琥珀酸；或皂。组合物也可含有0%至约40%的非离子表面活性剂，例如醇乙氧基化物(AEO或AE)、羧化的醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、或多羟基烷基脂肪酸酰胺(如例如在WO 92/06154中所述)。
洗涤剂组合物可另外包括一种或多种其他酶，例如脂肪酶、角质酶、蛋白酶、纤维素酶、过氧化物酶、和/或漆酶的任何组合。
洗涤剂可任选地含有约1%到约65%的洗涤剂助剂或^^剂，如沸石、二砩酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、 二亚乙基三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如，来自Hoechst的SKS-6)。洗涤剂也可以是未加强的，即基本上不含洗涤剂助剂。
洗涂剂可任选地包括一种或多种聚合物。实例包括羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、马来^/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
洗涤剂可任选地含有漂白体系，这可包括11202来源(例如过硼酸盐或
过碳酸盐)，其可以与形成过酸的漂白活性剂，如四乙酰基乙二胺(TAED)或壬酰基氧基苯磺酸盐(NOBS)联用。或者，漂白体系可包括过氧酸(例如酰胺、亚胺或砜类过氧酸)。漂白体系也可以是i^l漂白体系，其中过水解酶(perhydrolase )活化过氧化物，如例如WO 2005/056783中所述的那样。
可使用常规稳定剂来稳定洗涤剂組合物中的酶，稳定剂例如多元醇如丙二醇或甘油；糖或糖醇；乳酸；硼酸或硼酸衍生物如硼酸芳香酯；并且可按例如WO 92/19709和WO 92/19708所述配制组合物。
洗涤剂也可含有其它常规洗涤剂成分，例如织物调理剂，包括粘土、增泡剂、抑泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、抗污垢再沉积剂、染料、杀细菌剂、荧光增白剂或香料。pH (在使用浓度下于水性溶液中测量)通常是中性或碱性，例如pH约 7.0至约11.0。
包括芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体的洗涤剂组合物可以配制 成的具体形式包括
1) 具有体积密度(bulk density)为至少600 g/L的颗粒剂形式的洗涤剂 组合物，包括约7%至约12%的线性烷基恭璜酸盐(按酸计算)；约1%至约 4%的醇乙氧基石克酸盐(例如<:12-18醇，1-2环氧乙烷(EO))或烷基琉酸盐(例 如<:16-18);约5。/。至约9。/。的醇乙氧基化物(例如dws醇，7EO);约14%至 约20y。的碳酸钠(例如Na2CO3);约2%至约6%的可溶性硅酸盐(例如 320， 2SK)2);约15%至约22%的沸石(例如NaAlSiO"; 0%至约6%的石危酸钠(例 如Na2S04);约0%至约15%的柠檬酸钠/柠檬酸(例如C6H5Na307/C6H807); 约11%至约18Vo的过硼酸钠(例如NaB03H20);约2%至约6%的TAED; 0%至约2。/。的羧曱基纤维素(CMC); 0-3%的聚合物(例如马来^/丙烯酸共 聚物，PVP, PEG); 0.0001-0.1%蛋白质的酶(按纯酶计算)；和0-5%次要 成分(例如抑泡剂、香料、荧光增白剂、光漂白剂)。
2) 具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括 约6%至约11%的线性烷基笨璜酸盐(按酸计算)；约1%至约3%的醇乙氧 基硫酸盐(例如<:12-18醇，1-2 EO)或烷基硫酸盐(例如C16.18);约5%至约9% 的醇乙氧基化物(例如C"-,5醇，7 EO);约15%至约21%的碳酸钠(例如 Na2C03);约1%至约4%的可溶性硅酸盐(例如Na20， 2Si02);约24%至 约34%的沸石(例如NaAlSi04);约4%至约10%的石充酸钠(例如Na2S04); 0%至约15%的柠檬酸钠/柠檬酸(例如C6H5Na307/C6H807); 0%至约2%的 羧甲基纤维素(CMC); 1-6%的聚合物(例如马来^/丙烯酸共聚物，PVP， PEG); 0.0001-0.1%的酶(按纯酶蛋白质计算)；0-5%的次要成分(例如抑泡 剂、香料)。
3) 具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括 约5%至约9%的线性烷基笨璜酸盐(按酸计算)；约7%至约14%的醇乙氧 基化物(例如(:12.15醇，7 EO);约1%至约3%的皂如脂肪酸(例如(:16_22脂肪酸)；约10%至约17%的碳酸钠(如Na2C03);约3%至约9%的可溶性珪 酸盐(例如Na20， 2Si02);约23%至约33%的沸石(如NaAlSiO。； 0%至约 4。/。的硫酸钠(例如Na2S04);约8%至约16%的过硼酸钠(例如NaB03H20); 约2%至约8%TAED; 0%至约1%的膦酸盐(例如EDTMPA); 0%至约2% 的羧甲基纤维素(CMC); 0-3%的聚合物(例如马来^/丙烯酸共聚物，PVP, PEG); 0.0001-0.1%的酶(按纯酶蛋白质计算)；0-5%的次要成分(例如抑泡 剂、香料、荧光增白剂)。
4) 具有体积密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括 约8%至约12%的线性烷基笨璜酸盐(按酸计算)；约10%至约25%的醇乙 氧基化物(例如<:12.15醇，7 EO);约14%至约22%的碳酸钠(如Na2C03); 约1%至约5%的可溶性硅酸盐(例如Na20， 2Si02);约25%至约35%的沸 石(例如NaAlSK)4); 0%至约10%的硫酸钠(例如Na2S04); 0%至约2%的 羧甲基纤维素(CMC); 1-3%的聚合物(例如马来^/丙烯酸共聚物，PVP， PEG); 0.0001-0.1%的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5%的次要成分(例如抑 泡剂、香料)。
5) 水性液体洗涤剂组合物，包括约15%至约21%的线性烷基笨璜酸 盐(按酸计算)；约12%至约18%的醇乙氧基化物(例如(:12-15醇，7 EO或 dw5醇，5 EO);约3%至约13%的皂如脂肪酸(例如油酸)；0%至约13% 的烯基琥珀酸(<:12_14);约8%至约18%的氨基乙醇；约2%至约8%的柠檬 酸；0%至约3%的膦酸盐；0%至约3。/。的聚合物(例如PVP， PEG); 0% 至约2%的硼酸盐(例如B407); 0%至约3%的乙醇；约8%至约14%的丙 二醇；0.0001-0.1%的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5%的次要成分(例如分 散剂、抑泡剂、香料、荧光增白剂)。
6) 水性结构型液体洗涤剂组合物，包括约15%至约21%的线性烷基 笨璜酸盐(按酸计算)；3-9%的醇乙氧基化物(例如Cms醇，7 EO或C12-1S 醇，5 EO);约3%至约10%的皂如脂肪酸(例如油酸)；约14%至约22%的 沸石(如NaAlSK)4);约9%至约18%的柠檬酸钾；0%至约2%的硼酸盐(例 如B407); 0%至约2。/。的羧甲基纤维素(CMC); 0%至约3%的聚合物(例如PEG, PVP); 0%至约3。/。的锚定聚合物(anchoring polymer),例如甲 基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物；摩尔比25:1， MW 3800); 0%至约5%的 甘油；0.0001-0.1%的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5%的次要成分(例如分 散剂、抑泡剂、香料、荧光增白剂)。
7) 具有体积密度为至少600 g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括 约5%至约10%的脂肪醇硫酸盐；约3%至约9%的乙氧基化脂肪酸单乙醇 酰胺；0-3%的皂如脂肪酸；约5%至约10%的碳酸钠(例如Na2C03);约 1%至约4%的可溶性硅酸盐(例如Na20， 2Si02);约20%至约40%的沸石 (例如NaAlSK)4);约2%至约8%的硫酸钠(例如Na2S04);约12%至约18% 的过硼酸钠(例如NaB03H20);约2%至约7%的TAED;约1%至约5% 的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PEG); 0.0001-0.1%的酶(按纯酶蛋 白质计算)；和0-5%的次要成分(例如荧光增白剂，抑泡剂、香料)。
8) 颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约8%至约14V。的线性烷基M
酸盐(按酸计算)；约5%至约11%的乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺；0%至约
3%的皂如脂肪酸；约4%至约10%的碳酸钠(例如Na2C03);约1%至约 40/o的可溶性硅酸盐(Na20， 2Si02);约30%至约50%的沸石(例如 NaAlSiO》；约3%至约11%的石危酸钠(例如Na2S04);约5%至约12%的 柠檬酸钠(例如C6H5Na307);约1%至约5。/。的聚合物(例如PVP，马来l 丙烯酸共聚物，PEG); 0.0001-0.1%的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5%的
次要成分(例如抑泡剂、香料)。
9) 颗粒剂形式的洗涤剂組合物，包括约6%至约12%的线性烷基^ 酸盐(按酸计算)；约1%至约4。/。的非离子表面活性剂；约2%至约6%的 皂如脂肪酸；约14%至约22%的碳酸钠(例如Na2C03);约18%至约32% 的沸石(例如，NaAlSi04);约5%至约20%的硫酸钠(例如Na2S04);约3% 至约8%的柠檬酸钠(例如C6H5Na307);约4%至约9%的过硼酸钠(例如 NaB03H20);约1%至约5%的漂白活性剂(例如NOBS或TAED); 0%至 约2。/。的羧甲基纤维素(CMC);约1%至约5%的聚合物(例如聚羧酸酯或 PEG); 0.0001-0.1%的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5%的次要成分(例如，200880015125.4 10) 水性液体洗涤剂组合物，包括约15%至约23%的线性烷基笨璜酸 盐(按酸计算)；约8%至约15%的醇乙氧基硫酸盐(例如C12_15醇，2-3 EO); 约3%至约9。/。的醇乙lL&化物(例如<:12_15醇，7 EO或<:12-15醇，5 EO); 0% 至约3%的皂如脂肪酸(例如月桂酸)；约1%至约5%的氨基乙醇；约5% 至约10%的柠檬酸钠；约2%至约6%的助水溶物(例如甲笨璜酸钠)；0% 至约2%的硼酸盐(例如B407); 0%至约1%的羧甲基纤维素；约1%至约 3%的乙醇；约2%至约5%的丙二醇；0.0001-0.1%的酶(按纯酶蛋白质计 算)；和0-5%的次要成分(例如聚合物、M剂、香料、荧光增白剂)。
11) 水性液体洗涤剂组合物，包括约20%至约32%的线性烷基笨璜酸 盐(按酸计算)；6-12%的醇乙氧基化物(例如<:12.15醇，7 EO或C,w5醇，5 EO);约2%至约6%的氨基乙醇；约8%至约14%的柠檬酸；约1%至约 3%的硼酸盐(例如B407); 0%至约3%的聚合物(例如马来^/丙烯酸共聚 物，锚定聚合物例如曱基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物)；约3%至约8%的 甘油；0.0001-0.1%的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5%的次要成分(例如助 水溶物、*剂、香料、荧光增白剂)。
12) 具有体积密度为至少600 g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包 括约25%至约40%的阴离子表面活性剂(线性烷基苯磺酸盐、烷基硫酸盐、 a一烯烃磺酸盐、a-磺基脂肪酸甲酯、烷基磺酸盐、皂)；约1%至约10%的 非离子表面活性剂(例如醇乙氧基化物)；约8%至约25%的碳酸钠(例如 Na2C03);约5%至约15%的可溶性硅酸盐(例如Na20， 2Si02); 0%至约 5。/。的硫酸钠(例如Na;jS04);约15%至约28。/。的沸石(NaAlSi04); 0%至约 20%的过硼酸钠(例如NaB03.4H20);约0%至约5%的漂白活性剂(TAED 或NOBS); 0.0001-0.1%的酶(按纯酶蛋白质计算)；0-3%的次要成分(例如 香料、荧光增白剂)。
13) 如上面組合物1)-12)所述的洗涤剂组合物，其中所有或者部分的
线性烷基^酸盐被(<:12-<:18)烷基硫酸盐代替。
14) 具有体积密度为至少600 g/L的颗粒剂形式的洗涤剂組合物，包括约9%至约15%的(<:12.(:18)烷基琉酸盐；约3%至约6%的醇乙氧基化物； 约1%至约5%的多羟基烷基脂肪酸酰胺；约10%至约20%的沸石(例如 NaAlSiO。；约10°/。至约20%的层状焦珪酸盐(例如来自Hoechst的SK56); 约3%至约12%的碳酸钠(例如Na2C03); 0%至约6%的可溶性珪酸盐(例 如Na20， 2Si02);约4%至约8%的梓檬酸钠；约13%至约22%的过碳酸 钠；约3%至约8%的TAED; 0%至约5%的聚合物(例如聚羧酸酯和PVP); 0.0001-0.1%的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5%的次要成分(例如荧光增白 剂、光漂白剂、香料、抑泡剂)。
15) 具有体积密度为至少600 g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包 括约4%至约8%的(<:12_<:18)烷基硫酸盐；约11%至约15%的醇乙氧基化 物；约1%至约4%的急；约35%至约45%的沸石MAP或沸石A;约2% 至约8%的碳酸钠(如Na2C03); 0%至约4%的可溶性硅酸盐(例如Na20， 2Si02);约13%至约22%的过碳酸钠；1-8%的TAED; 0%至约3%的羧 甲基纤维素(CMC); 0%至约3%的聚合物(例如聚羧酸酯和PVP); 0.0001-0.1%的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-3%的次要成分(例如荧光增白 剂、膦酸盐、香料)。
16) 上面1)-15)所述的洗涤剂制剂，其含有被稳定化的或嚢化的过酸 作为额外组分或者作为已经述及的漂白体系的替代物。
17) 上面1)、 3)、 7)、 9)和12)所述的洗涤剂组合物，其中过硼酸盐被 过碳酸盐代替。
18) 上文1)、 3)、 7)、 9)、 12)、 14)和15)所述的洗涤剂组合物，还含 有锰催化剂。锰催化剂是例如"Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching," A^"re 369: 637-639 (1994)中所述的化合物之
19) 配制成非水性洗涤剂液体的洗涤剂组合物，包括液态非离子表面 活性剂，例如，线性烷氧基化伯醇、助洗剂体系(例如磷酸盐)、酶和碱。 该洗涤剂也可包括阴离子表面活性剂和/或漂白体系。
20) 水性液体洗衣洗涤剂组合物，包括A)选自阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、两性离子表面活性剂、兼性表面活性剂及其组合的至
少一种表面活性剂；B)聚硅氧烷材料掺合物小滴，所述掺合物包括i)含 胺或铵基团的官能化聚硅氧烷材料，其a)已通过这样的方法制备，所述 方法固有地在所产生的官能化聚硅氧烷材料中留下可固化的/反应性的基 团；b)具有低于约30%的含可固化/反应性基团的硅原子与不含可固化/ 反应性基团的末端硅原子的摩尔比；c)具有的氮含量以重量计约0.05%至 约0.30%;和d)20。C具有约0.00002 m;2;/s至约0.2m;2;/s的粘度；和 ii)无氮的未官能化聚硅氧烷材料，具有粘度约0.01m;2;/s至约2.0m;2; /s，且以这样的量存在，从而在所述掺合物中官能化聚硅氧烷材料与未官 能化聚硅氧烷材料的重量比为约100:1至约1:100;和C)选自染料转移抑 制剂、荧光增白剂及其组合的至少 一种另外的非聚硅氧烷洗衣辅助剂。
芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体可以按常规采用的浓度掺入洗 涤剂中。目前i人为在洗涤剂组合物中可以按相当于每升洗液0.00001-1.0 mg (按纯酶蛋白质计算)酶的量加入芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变 体。
在另一实施方案中，可将2，6-p-D-果聚糖水解酶掺入洗涤剂组合物中 并用于家居物品和/或工业纺织品/衣物上存在的生物膜的去除/清洁。
例如，可以将洗涂剂组合物配制成手洗或机洗的洗衣洗涤剂组合物， 包括适于污染的织物预处理的洗衣添加剂组合物和漂洗添加的织物软化剂 组合物，或者配制成用于一般的家居硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或 者配制以用于手洗或机洗的餐具洗涤操作。
一个具体的方面，洗涤剂组合物还可以包括2，6-p-D-果聚糖水解酶， 芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体之外的一种或多种a-淀粉酶，和一 种或多种其它清洁酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、糖酶、纤维素酶、 果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、 漆酶和/或过氧化物酶和/或其组合。
通常，所选酶的特性应与选择的洗涤剂兼容(例如最适pH、与其他酶 和非酶成分的兼容性等)，且所述酶应以有效量存在。蛋白酶适宜的蛋白酶包括动物、植物或樣i生物来源的那些。包括经 化学修饰或蛋白质改造的突变体，以及天然加工的蛋白酶。蛋白酶可以是 丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，例如碱性微生物蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶 或糜蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶(subtilisin), 尤其是源自芽孢杆菌属的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白 酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白 酶168 (参见例如，WO 89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例 如源于猪或牛)和镰孢霉属蛋白酶(参见例如，WO 89/06270和WO 94/25583)。有用的蛋白酶的实例也包括但不限于WO 92/19729、 WO 98/20115、 WO 98/20116和WO 98/34946中所述的变体。示例性市售可得 的蛋白酵包括Alcalase 、 Savinase 、 PrimaseTM、 DuralaseTM、 Esperase 和KannaseTM (Novo Nordisk A/S); Maxatase⑧、MaxacalTM、 MaxapemTM、 Properase 、 Purafect 、 Purafect OxPTM、 FN2预和FN3TM (Ge醒cor International, Inc.)。
脂肪酶适宜的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰、 蛋白水解修饰或蛋白质改造的突变体。有用的脂肪酶的实例包括但不限于 来自腐质霉属(与嗜热丝孢菌属同义)的脂肪酶，例如来自疏毛腐质霉(i/. /做"g/"we)(疏棉状嗜热丝孢菌(7: /"""g/mw"匀)(参见例如，EP 258068和 EP 305216)、来自特异腐质霉(参见例如，WO 96/13580);假单胞菌属 (」P^"甴wowas)脂肪酶(例如来自产碱假单胞菌(尸.fl/c"/^ew")或类产碱假 单胞菌(尸./7^"^"/c"//gew^);参见例如EP 218 272),洋葱假单胞菌(尸. c印""'")(参见例如EP 331 376)、斯氏假单胞菌(尸.W"&eW)(参见例如GB 1，372，034)、荧光假单胞菌(尸.yZ柳"sce附)、假单胞菌属物种菌林SD 705 (参 见例如，WO 95/06720和WO 96/27002)、 P> n^sco附,Vie附/s (参见例如WO 96/12012)的脂肪酶；芽孢杆菌属脂肪酶(例如来自枯草芽孢杆菌；参见例如 Dartois等人，肠cA麵ca "肠/ /i戸ca勿"，1131 : 253-360 (1993))，嗜热 脂肪芽孢杆菌(参见例如JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(及/;"iw7"s)(参见例 如WO 91/16422)的脂肪酶。考虑在制剂中使用的其它脂肪酶变体包括例如在WO 92/05249、 WO 94/01541、 WO 95/35381、 WO 96/00292、 WO 95/30744、 WO 94/25578、 WO 95/14783、 WO 95/22615、 WO 97/04079、 WO 97/07202、 EP 407225和EP 260105中描述的那些。 一些市售可得的 脂肪酶包括Lipolase⑧和Lipolase UltraTM (Novo Nordisk A/S)。
聚酯酶组合物中可以包括适宜的聚酯酶，适宜的聚酯酶包括例如在 WO 01/34899和WO 01/14629中描述的那些。
淀粉酶组合物可以与其它a-淀粉酶组合，例如非产量提高型的a-淀粉酶。这些可以包括市售可得的淀粉酶，例如但不限于Duramy條、 Termamyl 、 Fungamyl 和BAN (Novo Nordisk A/S); Rapidase⑧和 Purastar (来自Genencor International, Inc.)。
纤维素酶可以向組合物中加入纤维素酶。适宜的纤维素酶包括细菌 或真菌来源的那些。包括经化学修饰的或蛋白质改造的突变体。适宜的纤 维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢霉属、梭孢壳 属(77i/e/av/")、枝顶孢属(Jcre/m rt/"/w)的纤维素酶，例如如美国专利No. 4,435,307; 5,648,263; 5，691，178和5,776,757及国际PCT WO 89/09259公
开的自特异腐质霉、嗜热毁丝霉(A^C^I'0/7/l^W"狄M附0/7/l"")和尖镰孢产生 的真菌纤维素酶。考虑-使用的示例性纤维素酶为对于纺织品具有颜色护理
益处的那些。此类纤维素酶的实例是例如EP 0495257、 EP 0531372、 WO 96/11262、 WO 96/29397和WO 98/08940中描述的纤维素酶。其它实例是 纤维素酶变体，例如WO 94/07998; WO 98/12307; WO 95/24471; PCT/DK98/00299; EP 531315;美国专利No. 5,457,046; 5,686,593和 5,763,254中描述的那些。市售可得的纤维素酶包括Celluzyme⑧和 Carezyme (Novo Nordisk A/S); ClazinaseTM和Puradax HA (Genencor International, Inc.);以及KAC-500(B)TM (Kao Corporation)。
过氧化物酶/氧化酶考虑用于组合物的适宜过氧化物酶/氧化酶包括 植物、细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰的或蛋白质改造的突变体。 示例性过氧化物酶包括来自鬼伞属(0^nVi附)，例如来自灰盖鬼伞(C. c/"e"ws)的过氧化物酶，及其变体，如在WO 93/24618、 WO 95/10602和
55WO 98/15257中所述的那些。市售可得的过氧化物酶包括例如 GuardzymeTM (Novo Nordisk A/S)。
可通过添加含有一种或多种酶的分开的添加剂，或通过添加包括所有 这些酶的组合的添加剂而在洗涤剂组合物中包括洗涤剂酶。可以将洗涤剂 添加剂，即分开的添加剂或组合的添加剂，配制成例如颗粒、液体、浆液 等。示例性的洗涤剂添加剂剂型包括但不限于颗粒，特别是无粉尘颗粒； 液体，特别是稳定的液体，或浆液。
可例如按照美国专利No. 4,106,991和4,661,452所公开来生产无粉尘 颗粒，并且可任选地用本领域已知的方法进行包衣。蜡质包衣材料的实例 是平均分子量为1,000至20,000的聚环氧乙烷产物(如聚乙二醇，PEG); 具有16-50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇 含有12-20个碳原子且其中有15-80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸； 以及脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯及甘油三酯。例如GB 1483591给出了 适于通过流化床^L术应用的成膜包衣材料的实例。可例如通过加入多元醇 诸如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸，按照已建立的方法来稳定液态酶制 品。可按照如EP 238,216公开的方法来制备受保护的酶。
通常，洗涤剂组合物可以是任何便利的形式，例如棒、片、粉末、颗 粒、糊或液体。液体洗涤剂可以是水性的，通常含有高达约70%的水，和 0%至约30%的有机溶剂。也可以考虑含有约30%或更少水的压缩 (compact)洗涂剂凝胶。
洗涤剂组合物可以包括一种或多种表面活性剂，该表面活性剂可以是 非离子型，包括半极性和/或阴离子型和/或阳离子型和/或两性离子型。表 面活性剂一般按以重量计约0.1%-60%的宽范围存在。
当包括在洗涤剂中时，洗涤剂典型地将含有约1%至约40%的阴离子 表面活性剂，例如线性烷基苯磺酸盐、ot-烯烃磺酸盐、烷基^l酸盐(脂肪醇 硫酸盐)、醇乙氧基硫酸盐、仲烷基磺酸盐、a-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或 烯基琥珀酸、或皂。
当包括在洗涤剂中时，洗涤剂通常将含有约0.2%至约40%的非离子表面活性剂，如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二曱 基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷
基脂肪酸酰胺、或葡糖胺的N-酰基-N-烷基衍生物("葡糖酰胺")。
洗涤剂可含有0%至约65。/。的洗涤剂助剂或络合剂(complexing agent),例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、 次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、 二亚乙基三胺五乙酸、烷基-或烯 基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)。
洗涤剂可包括一种或多种聚合物。实例有羧曱基纤维素(CMC)、聚乙 烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚(乙烯基吡啶國N陽 氧化物)、聚乙烯基咪唑、聚羧酸酯(如聚丙烯酸酯、马来^/丙烯酸共聚物) 和曱基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
洗涤剂可含有漂白体系，这可包括11202来源(例如过硼酸盐或过碳酸 盐)，其可以与形成过酸的漂白活性剂(如四乙酰基乙二胺或壬酰基氧基苯
磺酸盐)联用。或者，漂白体系可包括过氧酸(例如酰胺、亚胺或砜类过氧 酸)。漂白体系也可以是SI^漂白体系。
可使用常规的稳定剂来稳定洗涤剂组合物中的酶，稳定剂例如多元 醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(例如，硼酸芳
族酯)、或苯基硼酸衍生物(例如4-曱酰基苯基硼酸)。可按照WO 92/19709
和WO 92/19708所述配制组合物。
洗涤剂也可含有其它常规洗涤剂成分，例如织物调理剂，包括粘土、 增泡剂、抑泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、抗污垢再沉积剂、染料、杀细菌剂、 荧光增白剂、助水溶物、晦暗抑制剂或香料。
目前认为在洗涤剂组合物中，尤其是芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或 其变体，可以按相当于每升洗液约0.01至约100 mg酶蛋白质(例如每升洗 液约0.05至约5.0 mg酶蛋白质，或每升洗液约0.1至约1.0 mg酶蛋白质) 的量力口入。
7.方法
577.1滤膜筛选测定
下文所讨论的测定法可用于篩选与亲本a-淀粉酶相比，在高或低pH 和/或在Ca^耗竭条件下具有改变的稳定性的Amy707 a-淀粉酶变体。
7.2高PH滤膜测定
将芽孢杆菌文库涂布在具有10 jig/ml卡那霉素的TY琼脂板上的醋酸 纤维素(OE 67， Schleicher & Schuell, Dassel， Germany)和硝化纤维素滤膜 (Protran-Ba 85， Schleicher & Schuell, Dassel, Germany)夹层上，37。C至少 21小时。醋酸纤维素层位于TY琼脂板上。
在涂板之后但是在孵育之前，用针对各滤膜夹层作出明确标记，以便 能够定位滤膜上的阳性变体，将带有结合的变体的硝化纤维素滤膜转移到 含有甘氨酸-NaOH緩冲液，pH 8.6-10.6的容器中，并在室温(可在10-60。C 变动)孵育15分钟。带有菌落的醋酸纤维素滤膜室温储存在TY板上备用。 孵育后，在含有1%琼脂糖、0.2。/。淀粉的板上于甘氨酸-NaOH緩冲液，pH 8.6-10.6中检测残留活性。具有硝化纤维素滤膜的测定板与滤膜夹层以相 同方式标记，并在室温孵育2小时。在取出滤膜之后，测定板用10% Lugol 液染色。淀粉降解变体检测为深蓝背景上的白斑，随之在储存板上鉴定之。 阳性变体在与第一次筛选相同的条件下复筛两次。
7.3低4丐滤膜测定
将芽孢杆菌文库涂布在具有相应抗生素(例如卡那霉素或氯霉素)的 TY琼脂板上的醋酸纤维素(OE 67， Schleicher & Schuell, Dassd， Germany) 和硝化纤维素滤膜(Protran-Ba 85， Schleicher & Schuell， Dassel, Germany) 夹层上，37。C至少21小时。醋酸纤维素层位于TY琼脂板上。
在涂板之后但是在孵育之前，用针对各滤膜夹层作出明确标记，以便 能够定位滤膜上的阳性变体，将带有结合的变体的硝化纤维素滤膜转移到 含有pH 8.5-10碳酸盐/重碳酸盐緩沖液和不同浓度EDTA (0.001 mM-100 mM)的容器中。滤膜在室温孵育l小时。带有菌落的醋酸纤维素滤膜室温储存在TY板上备用。孵育后，在含有1%琼脂糖、0.2。/。淀粉的板上于pH 8.5-10碳酸盐/重碳酸盐緩冲液中检测残留活性。具有硝化纤维素滤膜的测 定板与滤膜夹层以相同方式标记，并在室温孵育2小时。在取出滤膜之后， 测定板用10。/。Lugol液染色。淀粉降解变体检测为深蓝背景上的白斑，随 之在储存板上鉴定之。阳性变体在与第 一次筛选相同的条件下复筛两次。
7.4低pH滤膜测定
将芽孢杆菌文库涂布在具有10 ng/ml氯霉素的TY琼脂板上的醋酸纤 维素(OE 67, Schleicher & Schuell， Dassel， Germany)和硝化纤维素滤膜 (Protran-Ba 85， Schleicher & Schuell， Dassel， Germany)夹层上，37。C至少 21小时。醋酸纤维素层位于TY琼脂板上。
在涂板之后但是在孵育之前，用针对各滤膜夹层作出明确标记，以便 能够定位滤膜上的阳性变体，将带有结合的变体的硝化纤维素滤膜转移到 含有pH 4.5柠檬酸盐緩冲液的容器中，并在8(TC孵育20分钟(当筛选野生 型骨架的变体时)或在85。C孵育60分钟(当筛选亲本a-淀粉酶的变体时)。 带有菌落的醋酸纤维素滤膜室温储存在TY板上备用。孵育后，在含有1% 琼脂糖、0.2%淀粉的测定板上于pH 6.0柠檬酸盐緩冲液中检测残留活性。 具有硝化纤维素滤膜的测定板与滤膜夹层以相同方式标记，并在50。C孵育 2小时。在取出滤膜之后，测定板用10。/。Lugol液染色。淀粉降解变体检 测为深蓝背景上的白斑，随之在储存板上鉴定之。阳性变体在与第一次筛 选相同的条件下复筛两次。
7.5 二次筛选
从储存板上挑取复筛后的阳性转化株，进行二次板测定试验。阳性转 化林在37。C在5ml LB+氯霉素中生长22小时。在pH 4,5的柠檬酸盐緩沖 液中于卯。C孵育各阳性转化林的芽孢杆菌培养物，以及作为对照表达相应 骨架的克隆，并在0、 10、 20、 30、 40、 60和80分钟取样。将3 pl样品 点种在测定板上。测定板用10。/。Lugol液染色。改进的变体被视为比骨架
59具有更高残留活性(以测定板上的晕圈检观'J)的变体。通过核苷酸测序对改 进的变体予以确定。
7.6未纯化变体的稳定性测定
变体的稳定性可测定如下表达欲分析的变体的芽孢杆菌培养物在10 mlLB+氯霉素中于37。C生长21小时。将800 pl培养物与pH 4.5的200 pl 柠檬酸盐緩冲液混合。在PCR管中制备对应于取样时间点数的多个70 nl 等分试样，并在PCR仪中于7(TC或卯。C孵育不同时间点(一般5、 10、 15、 20、 25和30分钟)。O分钟的样品不在高温孵育。样品中的活性通过将20 pl转移到200 pi a-淀粉酶PNP-G7底物MPR3 ((Boehringer Mannheim Cat. no. 1660730)中进行测量，如下文"a-淀粉酶活性测定"所述。结果绘图为相 对于时间的活性百分比(相对于0时间点)，或表述为孵育一定时间段后的 残留活性百分比。
7,7 a-淀粉酶变体的发酵和纯化
持有相关表达质粒的枯草芽孢杆菌菌抹可如下发酵和纯化菌株自 -80。C的母板划线到具有10照/ml卡那霉素的LB琼脂板上，并在37。C过 夜生长。将菌落转移到500 ml摇瓶中补加有10照/ml氟*素的100 ml PS-1 培养基中。
PS-1培养基的组成
珍^MI ( pearl sugar) 100 g/1
大豆豆粕 40 g/1
Na2HP04， 12 H20 10 g/1
PluronicTM PE 6100 0.1 g/1
CaC03 5 g/1
培养物在37。C以270 rpm振荡5天。通过4500 rpm离心20-25分钟从发酵肉汤中除去细胞和细胞碎片。然 后过滤上清液，以获得完全清亮的溶液。滤液在UF-滤膜(10000截断膜) 上浓缩和洗涤，并将緩冲液更换为pH 5.5的20 mM乙酸盐。将UF-滤液 上样到S-sepharose F.F.柱，通过用0.2 M NaCl在相同緩冲液中逐步洗脱 来进行洗脱。洗脱物以pH 9.0的10 mM Tris进行透析，上样到Q-sepharose F.F.柱上，并用0-0.3 M NaCl线性梯度经6倍柱体积进行洗脱。合并包含 活性(通过Phadebas测定来测量)的级分，调整pH至pH 7.5，并通过用0.5% 重量体积比的活性炭处理5分钟来除去余色。
7.8比活确定
比活利用Phadebas⑧测定(Pharmacia)确定为活性/mg酶。遵循生产商 的说明(还请参见下文"a-淀粉酶活性测定")。
7.9等电点的确定
pl通过等点聚焦(ex: Pharmacia, Ampholine， pH 3.5-9.3)来确定。 7.10加速稳定性测定
在50 ml丙烯管中加入IO ml目的洗涤剂。对Amy707t和Amy707tARS 均进行适当的稀释，从而各以吸头移取180 ppm至含洗涤剂的独立管中进 行测量。各突变酶与洗涤剂一起涡旋30秒，然后置于RotaMix (ATR RKVS 型)上10分钟。用吸头取IOO nl具有突变酶的洗涤剂并进行1:651稀释。 利用封闭的对硝基苯麦芽七糖(P-Nitro-Phenyl-Maltoheptaose，封闭的 PBNPG7)底物在20XT型Konelab上测定突变体的初始活性。洗涤剂样品 随之在设置为37。C的恒温温箱中孵育。在l、 2、 4、 7和17天取样，并测 定酶活。
7.11 a-淀粉酶活性测定 7.11.1 Phadebas测定
61a-淀粉酶活性通过采用Phadebas⑧片作为底物的方法来确定。 Phadebas片(Phadebas⑥淀粉酶试验,由Pharmacia Diagnostic供应)含有 交联的不溶性蓝色淀粉聚合物，其已与牛血清白蛋白和緩冲物质混合并压 制成片。
对于每一单个的测量，将一片悬浮在含5 ml 50 mM Britton-Robinson 緩冲液(50 mM乙酸，50 mM磷酸，50 mM硼酸，0.1 mM CaCl2， pH用 NaOH调整至目的值)的管中。试验在水浴中于目的温度进行。待测的a-淀粉酶在x ml 50 mM Britton-Robinson緩冲液中稀释。将1 ml此a-淀粉 酶溶液添加到上述5 ml 50 mM Britton-Robinson緩冲液中。淀粉4皮a-淀粉 酶水解产生可溶性蓝色片段。所得蓝色溶液的吸光度在620 nm通过分光 光度法测量，为a-淀粉酶活性的函数。
重要的是在10或15分钟孵育(试验时间)后所测量的620 nm吸光度处 于620 nm的0.2-2.0个吸光度单位的范围。在此吸光度范围内，活性和吸 光度之间存在线性关系(Lambert-Beer定律)。因此必须调整酶的稀释度以 符合此准则。在规定的一组条件(温度、pH、反应时间、緩冲条件)下，lmg 给定的a-淀粉膝会水解确定量的底物，并会生成蓝颜色。颜色强度在620 nm测量。在给定的该组条件下，所测的吸光度与所讨论a-淀粉酶的比活(活 性/mg纯ot-淀粉酶蛋白)成正比。
7.11.2可选方法
a-淀粉酶活性可以通过采用PNP-G7底物的方法来确定。PNP-G7为对 硝基笨-a-D-麦芽七糖苷的缩写，为封闭的寡糖，可被内切淀粉酶切割。在 切割后，试剂盒中所包括的a-葡萄糖苷酶消化底物，释方文游离的、带黄颜 色的PNP分子，因此可在3i=405 nm (400-420 nm)处通过可见光分光光度 法来测量。含有PNP-G7底物和a-葡萄糖苷酶的试剂盒由 Boehringer-Mannheim (货号1054635)生产。
为制备试剂溶液，按照生产商的建议，将10ml底物/緩冲溶液添加到 50 ml酶/緩冲溶液中。通过将20 nl样品转移到96孔孩t滴定板中并在25°C孵育，来进行测定。加入在25。C预平衡的200fU试剂溶液。混合溶液，预 孵育1分钟，然后在ELISA读板器中每30秒钟测量OD 405 nm的吸光度 一次，为时4分4中。
在给定设置条件下，时间依赖性吸光度曲线的斜率与所讨论cx-淀粉酶 的活性成正比。
7.12洗涤剂组合物中酶性能的确定 7.12.1美国条件
应用Terg-o-to meter, United States Testing, Hoboken， N.J.-为模
拟美国洗涂条件下的洗涤试验，使用标准洗涤剂，如不含荧光增白剂的液 体AATCC 2003和/或粉末AATCC 1993 (美国纺织品化学家和配色师协会， American Association of Textile Chemists and Colorists)，在20。C进行目的 突变酶的剂效曲线(DEC)。然后进行比较性a-淀粉酶的对应DEC,以比较 本发明突变酶的污渍去除性能。在40。C重复此方法。 一般，将4个CS-28 稻淀粉污渍样片(swatch)(荷兰的CFT)置于Terg-o-tometer的钢容器中， 其中装有lL去离子水和1.5g液体AATCC。当使用粉末AATCC时，在 分才斤天平(PM4800型，Mettler Instrument Corp" Highstown， NJ. 08520)上 称重1.5 g洗涤剂粉末，并添加到Terg-o-tometer中。同时进行两份重复。 除非另有说明，试验进行12分钟，并漂洗3分钟。洗涤后，样片风干，并 用Konica Minolta生产的CR-410型Chroma Meter来测量试验样片的反 射率。收集的数据用适当的统计学分析进行处理。
7.12.2欧洲条件
应用Atlas Company, Atlanta, Georgia生产的Launder-O調meter-
为;f莫拟欧洲洗涤条件下的洗涤试验，^使用标准欧洲试验洗涤剂，即IECA 以及IEC A带漂白剂(TAED-四乙酰基乙二胺醋酸盐)和过硼酸钠，在40°C 进行目的突变酶的剂效曲线(DEC)。然后进行比较性突变酶的对应DEC曲 线，以比较本发明突变酶的污溃去除性能。如果期望的话，在更高的洗涤温度重复此方法。 一般，将4个EMPA 161玉米淀粉样片(EMPA，瑞士) 置于装有250 ml去离子水、含6.8 g/L IEC A洗涤剂或8.0 g/L带漂白剂的 IECA的钢容器中。同时进行两份重复。除非另有说明，试验进行45分钟， 并漂洗5分钟。洗涤后，样片风干，并用CR-410型Chroma Meter来测 量试验样片的反射率。收集的数据用适当的统计学分析进行处理。
7.12.3评估洗涤剂组合物的微样片法
存在众多a-淀粉酶清洁测定法。检测清洁的示例性描述包括如下。 "样片"是其上施有污渍的一块材料，诸如织物。该材料可以是例如由 棉、聚酯或天然和合成纤维的混合物制成的织物。样片还可以是纸，例如 滤纸或硝化纤维素，或者是一块硬材料，例如陶瓷、金属或玻璃。对于淀 粉酶，污渍是基于淀粉的，但是也可以包括血液、乳、墨、草、茶、酒、 菠菜、肉汁、巧克力、蛋、奶酪、粘土、色素、油或这些化合物的混合物。 "小样片"是自样片上用单孔穿孔装置切下的部分，或者用定制的96 孔穿孔装置(该多孔穿孔模式与标准96孔微滴定板匹配)切下的部分，或者 是以其它方式自样片上取下的部分。样片可以是纺织品、纸、金属或其他 适宜的材料。小样片可以在放入24孔、48孔或96孔樣b'离定板孔之前或之 后被污物固着。"小样片，，也可以通过向小块材料施加污物而制成。例如， 小样片可以是直径为5/8"或0.25"的污染的织物片。设计定制的穿孔机， 从而同时将96个样片递送至96孔板的所有孔中。该装置通过简单地向同 一96孔板多次上样，而允许向每孔递送一个以上的样片。可以想到将多孔 穿孔装置用于向任何格式的板(包括但不限于24孔、48孔和96孔板)同时 递送多个样片。另一可想到的方法中，污染的测试平台可以是由被污物载 污体所包覆的金属、塑料、玻璃、陶瓷，或其他适宜材料形成的珠，用于 检验在纺织品以外的材料上使用的清洁组合物。然后将一个或多个污物包 覆的珠it^含有适宜緩冲液和酶的96孑L、 48孔或24孔板的孔中或更大格 式的板的孔中。这种情况下，可以通过直接吸光度测量或在二级生色反应 后检测上清液中释放的污染物。也可以通过质谱分析来进行释放的污染物
64的分析。另 一微量篩选试验可以将样片(例如锭蓝染色的粗斜棉布)递送并 固定到多孔板的孔中，加入颗粒诸如沙或更大的颗粒(例如经过篩滤以包括
6-8或9号(gauge)颗粒的石榴石)，并搅动多孔板以便由加入的颗粒造成样 片磨损。这种测定可用于在石洗应用中评估纤维素酶。可以通过释放到反 应緩冲液中的颜色(例如，释放的散蓝溶解到二甲基亚砜中并测量A鍋nm 的吸光度)或通过对磨损的样片测量反射率来判断酶的效力。
例如，当在无漂白剂的洗涤剂中洗涤未处理的BMI (血'^/乳/墨)样片 时，即使不借助于蛋白酶也释放出大部分的墨。加入蛋白酶导致墨水释放 的小量增加，这在大背景下可能难于量化。 一方面提供了允许人们控制污 渍固着程度的处理方法。结果是，可以产生例如当在不存在被检测的酶的 情况下进^f亍洗涤时能释;^文出变化量的污渍的样片。污渍固着的样片的使用 导致在洗涤测定中信噪比的显著提高。此外，通过改变固着程度，可以产 生在不同清洁条件下给出最佳结果的污溃。
在多种材料类型上具有已知"强度"的污渍的样片是市售可得的 (EMPA， St. Gallen,瑞士； wfk—Testgewebe GmbH， Krefeld德国；或 Center for Test Materials, Vlaardingen，荷兰)，和/或可以由从业者制得 (Morris和Prato， /ow""/ 52(4): 280 286 (1982))。其他试
验样片包括但不限于含棉织物上的血、^/乳/墨水(BMI)污渍、含棉织物上 的菠菜污渍、或含棉织物上的草、以及含棉织物上的巧克力/乳/烟灰。
可用0.0003。/。-0,3。/。的过氧化氢将BMI污渍固着在棉上。其他组合包 括用0.001%-1%戊二醛固着的草或菠菜、用0.001%-1%戊二醛固着的明 胶和考马斯亮兰污渍、或用0.001%-1%戊二醛固着的巧克力、乳和烟灰。
也可以在与酶和/或洗涤剂制剂孵育期间搅拌样片。洗涤性能数据取决 于孔中，尤其是在96孔板中的样片的取向(水平对垂直)。这表明在孵育期 间混合是不充分的。尽管存在许多方式来保证孵育期间充分的搅拌，但可 以构建将微滴定板夹在两个铝板之间的板夹。这可以简单地例如在孔上放 置粘性板密封物，然后用任何类型的适合的、市售可得的夹子将两个铝板 与96孔板加紧而实现。然后可以将它放到商品化的孵育摇床中。将摇床设定为约400rpm将产生非常有效的混合，而板夹有效地阻止了泄漏或交叉 污染。
可以使用三硝基苯磺酸(TNBS)来量化洗液中的氨基基团浓度。这可以 用作从样片中去除的蛋白质量的量度(参见例如Cayot和Tainturier， 祝oc/^w. 249: 184-200 (1997))。然而，如果洗涤剂或酶样品导致形成异乎 寻常小的肽片段(例如，因样品中存在肽酶所致)，那么将会得到较大的 TNBS信号，即更多"噪音"。
另 一用于测量对血液/乳/墨水或其它污渍的洗涤性能的手段是基于墨 水的释放。样片上蛋白质的蛋白质水解导致墨水颗粒的释放，这可以通过 测量洗液的吸光度而量化。可以在350和800 nm之间的〗壬何波长测量吸 光度。可以在410nm或620nm处测量波长。也可以检查洗液以确定对于 含有草、菠菜、明胶或考马斯亮兰染料的污渍的洗潦性能。对于这些污渍， 示例性的波长包括针对菠菜或草的670 nm和针对明胶或考马斯染料的620 nm。例如，取出等份的洗液(例如，通常来自96孔微板的100-150 pL)并 放到小杯或多孔賴L板中。然后放到分光光度计中并在适当的波长读取吸光 度。
也可以使用该体系，例如通过使用在诸如布、塑料或陶瓷的适宜载污 体上的血液/乳/墨水污渍，来测定用于餐具洗涤的增强的酶和/或洗涤剂組 合物。
一方面，通过在25。C将0.3%过氧化氢施加到BMI/棉样片上30分钟 或通过在60。C将0.03%过氧化氢施加到BMI/棉样片上30分钟，来固着 BMI污渍。从BMI/棉样片上切下约0.25'，的小样片并;^ 96孔孩"离定板 的孔中。向各孔中i文入已知的洗涤剂组合物和酶如变体蛋白质的混合物。
向微滴定板顶部放置粘性板密封物后，将微滴定板与铝板夹在一起，并在 定轨摇床上以约250 rpm搅拌约10-60分钟。这个时间结束后，将上清液 转移到新的微滴定板的孔中并测量620 nm的墨水吸光度。这可以类似地 用通过在25。C向菠菜/棉样片或草/棉样片施加0.01%戊二醛30分钟而固着 在棉上的菠菜污渍或草污渍来进行检测。这也可以用巧克力、乳和/或烟灰
66污渍完成。其他血液/乳/墨水测定和条件在美国专利No. 7，122，334 (Genencor International, Inc.)中提供。
7.13 LAS敏感性的确定
变体与不同浓度的LAS (线性烷基笨璜酸盐；Nansa 1169/P)在40。C孵 育10分钟。
残留活性利用Phadebas⑧测定法或采用PNP-G7底物的可选方法来确定。
LAS在pH 7.5的0.1 M磷酸盐緩冲液中稀释。
使用如下浓度500 ppm、 250 ppm、 100 ppm、 50 ppm、 25 ppm和 10ppm,或无LAS。
变体在总体积10 ml中于不同LAS緩沖液中稀释至0.01-5 mg/1的浓 度，并在温度控制的水浴中孵育IO分钟。通过将小份试样转移到冷测定緩 冲液中终止孵育。为了不影响活性测量，重要的是在活性测量期间，LAS 浓度低于1 ppm。
然后利用上述Phadebas⑧测定或可选方法一式两份来确定残留活性。 扣除空白后来度量活性。无LAS的活性为100%。
8.生物膜去除组合物及用途
組合物可以包括芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体作为主要的酶 组分，例如单组分组合物，用于去除生物膜。或者，组合物可以包括多种 酶活性，例如多种淀粉酶，或包括如下任意組合的酶混合物氨肽酶、淀 粉酶(p-或a-或葡糖-淀粉酶)、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几 丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖 苷酶、p-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡萄糖苷酶、p-葡萄糖苷酶、卣代 过氧化物酶(hal叩eroxidase)、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化 酶、果胶裂解(pectinolytic)酶、肽基谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、过 氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶和/或木聚糖酶，或其任意组合，用于去除生物膜。这些其他酶可通过属 于曲霉属、木霉属、腐质霉属(例如特异腐质霉)及镰孢霉属的微生物生产。 示例性曲霉属成员包括棘孢曲霉、泡盛曲霉、黑曲霉或米曲霉。示例性镰
孢霉属成员包括杆孢状镰孢、F. cweato、 F. C7^ A:M^//e"se、大刀镰孢、禾 本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红 镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、硫色镰孢、F.麵/仍画、拟丝孢镰孢和
包括芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体的组合物可以按照本领域 已知的方法制备，并且可以是液体或干组合物的形式。例如，含芽孢杆菌 属物种707 a-淀粉酶或其变体的组合物可以是颗粒或微颗粒的形式。包括 在组合物中的多肽可以按照本领域已知的方法稳定化。
下文给出了多肽组合物用途的实例。含芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶 或其变体的组合物的用量及组合物使用的其他条件可以基于本领域已知的 方法来确定。
还考虑芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体与2，6-p-D-果聚糖水解
酶或其变体一起用在组合物中。
另一方面考虑瓦解和/或去除生物膜的组合物。如本文所用的术语"瓦 解"应理解为水解生物膜基质中将生物膜中的个体微生物细胞连接并结合 在一起的多糖，从而所述微生物细胞能够从生物膜中释放并去除。生物膜 一般存在于表面，故生物膜的瓦解通过使表面接触(例如通过浸没、覆盖或 喷洒表面)含有芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体或一种或多种其他 负责降解生物膜的酶(例如但不限于2，6-P-D-果聚糖水解酶)的水性介质而 实现。组合物可用于水解例如纸浆业和纸业白水中的腐浆(slime)。
芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体的存在量可以是0.0001-10000 mg/L; 0.001-1000 mg/L; 0.01-100 mg/L或0.1-10 mg/L。其他酶及酶变体 可以以相似或更〗氐的量存在。
该方法可以适宜地在室温至约70。C的温度进行。示例性的温度范围包 括约30'C至约6(TC，例如约40。C至约50'C。
68用于水解生物膜的适宜pH处在约3.5至约8.5的范围。示例性的范围 包括pH约5.5至约8，例如约6.5至约7.5。用于酶有效去除生物膜的接 触时间或反应时间可以变化相当大，这取决于生物膜的特性以及用酶单独 或组合其他生物膜降解酶如2，6-p-D-果聚糖水解酶处理表面的频率。示例 性反应时间可包括约0.25至约25小时，例如约1至约10小时，例如约2 小时。
可与芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体和2，6-(5-D-果聚糖水解酶 组合的其他生物膜降解酶包括但不限于纤维素酶，半纤维素酶，木聚糖 酶，其他淀粉酶，包括其他a-淀粉酶，脂肪酶，蛋白酶和/或果胶酶。
芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体还可以与抗微生物剂组合，例 如酶或非酶的生物杀灭剂。酶生物杀灭剂可以是例如包括氧化还原酶(例如 漆酶)或过氧化物酶(尤其是卣代过氧化物酶)和任选的增强剂(例如丁香酸 烷基酯)的组合物，例如国际PCT申请WO 97/42825和DK 97/1273中所 描述的那样。
可以将生物膜自上去除和/或清除的表面例如是硬表面，其定义涉M 本上微生物不能透过的任何表面。表面的实例是由金属例如不锈钢合金、 塑料/合成聚合物、橡胶、板材、玻璃、木材、纸、纺织品、混凝土、岩石、 大理石、石膏及陶资材料制成的表面，其任选地以例如油漆、珐琅、聚合 物等包覆。从而，表面可以是容纳、运输、处理或接触水性溶液的系统(如 供水系统、食品处理系统、冷却系统、化学品处理系统或药物处理系统) 的构件。提供了组合物和使用该组合物在木材加工业如纸浆和/或纸业去除 生物膜的方法。因此，酶变体和含有酶变体的组合物可用于常规的就地清 洗(C-I-P)系统。表面可以是系统单元(如管道、罐、泵、膜、滤器、热交换 器、离心机、蒸发器、混合器、喷雾塔、阀门和反应器)的一部分。表面也 可以是医学科学和工业所用的器具(如污染的内窥镜、假体装置或医学内植 物)或其部分。
用于生物膜去除的组合物也可以考虑用于防止当金属表面例如管道受 微生物生物膜攻击时发生的所谓生物腐蚀，即通过瓦解生物膜，由此防止生物膜中的微生物细胞建立起腐蚀其所附着的金属表面的生物膜环境。
抗生物膜组合物的另一应用是口腔护理。不过，表面还可以是生物来
源的，如粘膜、皮肤、牙齿、毛发、指曱等。
具有牙菌斑的牙齿(例如通过将酶变体掺入牙骨中)以及污染的隐形眼
镜包括在表面内。因此，芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体可用在组 合物和方法中用于制备瓦解人或动物牙齿上的菌斑的药物。另一用途是自 粘膜上瓦解生物膜，例如患有嚢性纤维化的患者肺中的生物膜。
因此，又另一方面涉及口腔护理组合物，包括重组酶，例如纯化的基 本上不含任何活性污染物的酶。口腔护理组合物可以适宜地包括一定量的 重组酶。
用于口腔护理组合物的其他生物膜降解酶包括但不限于口腔护理组合 物中的2，6-P-D-果聚糖水解酶活性。所考虑的酶活性包括选自如下的酶的 活性葡聚糖酶；齿斑葡聚糖酶(mutanase);氧化酶，例如葡糖氧化酶， L-氨基酸氧化酶，过氧化物酶，例如WO 95/10602中所述的鬼伞属物种 (Coprinus sp.)过氧化物酶，或乳过氧化物酶，卣代过氧化物酶，特别是可 以来源于弯孢霉属(CWT"/flWas/7.)、特别是糙壁弯孢(C. vmm""/osfl)和不等 弯孢(C./m^《M"他)的卣代过氧化物酶；漆酶；蛋白酶例如木瓜蛋白酶，酸 性蛋白酶(例如WO 95/02044中所述的酸性蛋白酶)，内切糖苷酶，脂肪酶， 淀粉酶，包括淀粉葡糖苷酶，如AMG (来自Novo Nordisk A/S);抗微生 物酶，以及它们的混合物。
口腔护理组合物可以具有任何适宜的物理形式(即，粉末、糊剂、凝胶 剂、液体、膏剂、片剂等)。"口腔护理组合物"包括可用于维持或改善人和 动物口中口腔卫生的组合物，预防龋齿、预防牙菌斑和牙垢形成、去除牙
菌斑和牙垢、预防和/或治疗牙科疾病等。至少在该情况下，口腔护理组合 物的确也包括用于清洁假牙、人工牙齿等的产品。此类口腔护理组合物的 实例包括牙膏、牙霜、凝胶或牙粉、漱牙漱口水、刷牙前后的嗽洗制剂、 口香糖、锭剂和糖果。牙膏和牙凝胶一般包括磨擦抛光材料、发泡剂、矫 味剂、保湿剂、粘合剂、增稠剂、甜味剂、增白剂/漂白剂/去渍剂、水和
70任选地其它酶及酶组合。
嗽口水，包括菌斑去除液体， 一般包括7]C/醇溶液、香料、保湿剂、增 甜剂、发泡剂、着色剂和任选地其它酶或酶组合。
磨擦抛光材料也可以掺入到口腔护理组合物如牙粉(骨)中。
从而，磨擦抛光材料可以包括铝及其水合物，例如三7JC合a-氧化铝 (alpha alumina trihydrate);三硅酸镁；碳酸镁；高岭土；铝硅酸盐，例如 煅烧硅酸铝和硅酸铝；碳酸锔；硅酸锆；还有粉状塑料，例如聚氯乙烯； 聚酰胺；聚甲基丙烯酸甲酯；聚苯乙烯；苯酚甲醛树脂；蜜胺甲醛树脂； 脲甲醛树脂；环氧树脂；粉状聚乙烯；氧化硅干凝胶；水凝胶和气凝胶等。 同样适合作为磨料的有焦磷酸钾；水不溶性碱性偏磷酸盐；磷酸二钙和/ 或其二水合物，正磷酸二钓；磷酸三钩；羟基磷灰石颗粒等。还可以采用 这些物质的混合物。
根据口腔护理组合物的不同，磨擦产品可以以重量计约0%至约70%， 或约1%至约70%存在。对于牙膏，磨料含量一般处于以最终牙骨重量计 10%-70%的范围内。
可以采用保湿剂以防止例如牙膏的水分流失。适合用于口腔护理组合
物的保湿剂包括如下化合物及其混合物甘油；多元醇；山梨糖醇；聚乙 二醇(PEG);丙二醇；1，3-丙二醇；1，4-丁二醇；氢化的部分水解多糖等。 保湿剂一般以重量计0%至约80%,或约5%至约70%存在于牙骨中。
二氧化硅、淀粉、黄芪胶、黄原胶、爱尔兰苔(Irishmoss)提取物、藻 酸盐、果胶、纤维素衍生物如羟乙基纤维素、羧甲基纤维素钠和羟丙基纤 维素钠；聚丙烯酸及其盐、聚乙烯吡咯烷酮，可提及作为适宜增稠剂和粘 合剂的实例，它们有助于稳定牙粉(骨)产品。增稠剂在牙骨乳剂和凝胶中 的存在量可以是以终产品重量计约0.1%至约20%，而粘合剂达到约0.01 至约10%的程度。
可以使用阴离子、阳离子、非离子、兼性和/或两性离子表面活性剂作 为发泡剂皂。这些可以以终产品重量计0%至约15%、约0.1至约13%或 约0.25%至约10%的水平存在。表面活性剂仅在其不对芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体施加失 活效应的程度上是适宜的。表面活性剂包括脂肪醇硫酸盐，磺化甘油单酯 或具10-20个碳原子的脂肪酸的盐，脂肪酸-白蛋白缩合产物，脂肪酸酰胺 和牛磺酸的盐和/或脂肪酸羟乙基磺酸酯的盐。
适宜的增甜剂包括制剂用糖精。
香料例如留兰香通常以低含量存在，例如以重量计约0.01%至约5%， 尤其是约0.1%至约5%。增白剂/漂白剂包括11202，且可以以终产品重量 计低于约5%,或约0.25%至约4%的量添加。增白剂/漂白剂可以是酶， 例如氧化还原酶。适宜的牙齿漂白酶的实例为例如WO 97/06775中描述的 那些。
水通常以赋予例如牙膏可流动形式的量添加。
也可以包括其它水溶性抗菌剂，例如二葡萄糖酸氯己定，氨己嘧啶 (hexetidine)，双胍咬(alexidine)，三氯生(Triclosan⑧)，季铵抗菌化合物， 以及水溶性的某些金属离子源，例如锌、铜、银和锡源(例如，氯化锌、氯 化铜和氯化亚锡，以及硝酸银)。
也可以考虑添加能够用作为氟化物源的化合物、色素/着色剂、防腐剂、 维生素、pH调节剂、防龋剂、脱敏剂等。
当生物膜降解酶用于清洁口腔时可提供若干益处。蛋白酶降解唾液蛋 白质，这些蛋白质吸附在牙齿表面并形成薄膜(pdlide)，即所致菌斑的第 一层。蛋白酶连同脂肪酶一起通过裂解构成细菌细胞壁和膜的结构組分的 蛋白质和脂质而^f皮坏细菌。
葡聚糖酶及其他糖酶如2，6-P-D-果聚糖水解酶可以降解细菌所产生 的、形成细菌粘附基质的有机骨架结构。蛋白酶和淀粉酶不仅防止牙菌斑 形成，而且还可以通过降解结合4丐的糖-蛋白质复合物防止矿化，从而阻止
牙垢发展。
牙骨一般可以包括如下成分(以最终牙骨组合物的重量百分比计)磨 料至约70%;保湿剂0%至约80%;增稠剂约0.1%至约20%;粘合 剂约0,01%至约10%;增甜剂约0.1%至约5%;发泡剂0%至约15%;增白剂0%至约5%;和酶约0.0001%至约20%。
在一个具体实施方案中，牙骨具有在约6.0至约8.0范围内的pH，且 包括a)约10%至约70%的磨料；b) 0%至约80%的保湿剂；c)0.1。/o至约 20%的增稠剂；d)0.01。/o至约10%的粘合剂；e)约0.1%至约5%的增甜剂； f) 0%至约15%的发泡剂；g) 0%至约5%的增白剂；i)约0.0001%至约20% 的酶。
i)中所M的酶包括芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体，单独或组 合其他生物降解酶如2，6-(3-D-果聚糖水解酶，和任选的已知用于牙骨中的 上述其他类型的酶等。
漱口剂 一般可以包括如下成分(以最终漱口剂组合物的重量百分比 计)0%至约20%的保湿剂；0%至约2%的表面活性剂；0%至约5%的 酶；0%至约20%的乙醇；0%至约2%的其他成分(例如香料，增甜剂活性 成分，如氟化物)。组合物还可以含有约0%至约70%的水。
漱口剂组合物可以用适当的緩冲剂进行緩冲，例如pH约6.0至约7.5 的柠檬酸钠或磷酸钠。漱口剂可以是非稀释的形式(即，用前必须稀释)。
口腔护理組合物可以利用任何口腔护理领域已知的常规方法来生产。
9.淀粉加工組合物及用途
另一方面，可利用具有所公开的芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变 体的组合物进行淀粉液化或糖化。
一方面考虑由淀粉生产增甜剂的組合物及組合物的用途。将淀粉转换 为果糖糖浆的"传统，，方法通常包括三个连续的酶促步骤，即，液化步骤， 接着是糖化步骤，以及异构化步骤。在液化步骤中，在约5.5至约6,2的 pH值、约95。C至约160。C的温度，通过为期约2个小时的芽孢杆菌属物 种707 a-淀粉酶或其变体的作用，使淀粉降解为糊精。为确保这些条件下 的最佳酶稳定性，可以添加1 mM的钙(40 ppm游离钙离子)。淀粉加工可 用于生产醇(例如，谷物液化用于燃料和饮用酒、酒类酿造)、淀粉液化用 于增甜剂生产、蔗糖加工及其他食品相关的淀粉加工目的。对于不同的芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体，可应用其他条件。
液化步骤后，可以通过添加葡糖淀粉酶(例如AMGT^)和脱支酶(如异 淀粉酶或普鲁兰酶(例如Promozyme⑧))，将糊精转换为葡萄糖。在此步骤 之前，将pH降至低于约4.5的值，维持高温(高于95。C)，并变性液化芽孢 杆菌属物种707a-淀粉酶或其变体的的活性。使温度降至60。C，可以加入 葡糖淀粉酶和脱支酶。糖化过程通常进行约24至约72小时。
糖化步骤之后，将pH升至处于约6.0至约8.0范围的值(例如pH 7.5)， 并通过离子交换除去钾。然后利用例如固定化的葡萄糖异构酶(如 Sweetzyme⑧)将葡萄糖浆转化为高果糖糖浆。
此过程可以进行至少一种降&改进降低液化芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体的的钙依赖性。为了确保芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或 其变体的足够高的稳定性，需要添加游离的钙，但是游离的钙强烈抑制葡 萄糖异构酶的活性，故而需要通过昂贵的单元操作去除，达到游离钙的水 平降至低于3-5ppm的程度。如果能够避免这样的操作，且液化过程无需 添加游离钓离子即能进^f亍，则可以获得费用的节约。
例如，可在组合物和操作中利用钙依赖性较小的酶，其在低浓度游离 钩(<40 ppm)时稳定且具有高活性。这样的芽孢杆菌属物种7(V7 a-淀粉酶或 其变体应当具有位于pH范围约4.5至约6,5或者约4.5至约5.5中的最适 pH。
可利用芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体在实验室及工业设置中 水解淀粉或任何含麦芽糖糊精的化合物以用于多种目的。这些芽孢杆菌属 物种707 a-淀粉酶或其变体可以单独使用以提供特异性水解，或者可以与 其他淀粉酶组合以提供具有广谱活性的"混合物"。示例用途包括从生物学、 食品、动物饲料、药学或工业样品中去除或部分或完全水解淀粉或任何含 麦芽糖糊精的化合物。
另一方面考虑组合物和在发酵方法中使用该组合物的方法，在该发酵 方法中淀粉底物在芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体的存在下被液化 和/或糖化以产生葡萄糖和/或麦芽糖，其适于由发酵生物如酵母转换为发酵产品。此类发酵方法包括用于生产燃料乙醇或饮用乙醇(饮用酒)的方法， 生产饮料的方法，生产期望有机化合物(例如柠檬酸、衣康酸、乳酸、葡糖 酸、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钩、葡萄糖酸钾、葡萄糖酸8内酯或异抗坏血 酸钠)、酮、氨基酸(例如谷氨酸、单谷氨酸钠)、以及更为复杂的化合物(例
如抗生素，如青霉素、四环素)、酶、维生素(例如核黄素、维生素B12、 p-胡罗卜素)和激素(它们难于合成生产)的方法。
待加工的淀粉可以具有高度精制的淀粉质量，例如至少卯％、至少 95%、至少97%或至少99.5%纯。或者，淀粉可以是较为粗制的含淀粉材 料，包括经碾磨的整个谷粒(包括非淀粉级分如胚残留物和纤维)。碾磨原 料如整个谷粒的目的是打开其结构，从而允许进一步加工。可以使用两种 碾磨方法湿磨法和干磨法。此外，可以^使用玉米渣例如碾磨过的玉米渣。
千磨的谷粒除淀粉外还将包含显著量的非淀粉糖类化合物。当通过喷 射蒸煮加工这样的异质原料时，往往仅能实现淀粉的部分糊化。由于芽孢
杆菌属物种707 (x-淀粉酶或其变体对未糊化的淀粉具有高活性，故该酶可 以有利地应用在包括液化和/或糖化喷射蒸煮干磨淀粉的方法中。
此外，由于芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体优越的水解活性， 极大地降低了糖化步骤期间对葡糖淀粉酶的需求。这允许糖化作用在极低 水平葡糖淀粉酶活性下进行，葡糖淀粉酶活性或者不存在，或者如果存在 的话，其存在量仅仅是或者甚至低于0.5 AGU/g DS;或者仅仅是或者甚至 低于0.4 AGU/g DS;或者仅仅是或者甚至低于约0.3 AGU/g DS;或者低 于0.1 AGU，例如仅仅是或者甚至低于约0.05 AGU/g DS的淀粉底物。"DS" 是每克干固形物底物加入的酶单位。以mg酶蛋白质表达，具有葡糖淀粉 酶活性的酶或者不存在，或者其存在量仅仅是或者甚至低于约0.5 mg EP/g DS;或者仅仅是或者甚至低于约0.4mgEP/gDS;或者仅仅是或者甚至低 于约0.3mgEP/gDS;或者仅仅是或者甚至低于约0.1 mg EP/g DS，例如 仅仅是或者甚至低于约0.05 mg EP/g DS,或者仅仅是或者甚至低于0.02 mg EP/g DS的淀粉底物。葡糖淀粉酶可以源自曲霉属、篮状菌属 (7Vi/"ay 附j^^ sp.)、尸"c/^^^wpow sp.或栓菌属(rmwetes sp.)的菌林，其中
75示例性的实例为黑曲霉、埃默森篮状菌(rfl/"fw^c^e/wefww//)、瓣环栓菌
该方法可以包括a)使淀粉底物与包含具a-淀粉酶活性的催化模块和碳 水化合物结合模块的芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体(例如第一方 面的多肽)接触；b)使所述淀粉底物与所述酶在足以实现至少90%或至少 92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、 至少99.5% w/w所述淀粉底物转换为可发酵糖的温度和一段时间内 一起孵 育；c)发酵以生产发酵产品；和d)任选地回M酵产品。在方法步骤b)和 /或c)期间，具有葡糖淀粉酶活性的酶不存在，或者其存在量为0.001-2.0 AGU/gDS、 0.01-1.5 AGU/gDS、 0.05-1.0 AGU/g DS、 0.01-0.5 AGU/g DS。 具有葡糖淀粉酶活性的酶可以不存在，或者其存在量仅仅是或者甚至低于 0.5 AGU/g DS;或者仅仅是或者甚至低于0.4 AGU/g DS;或者仅仅是或者 甚至低于0.3 AGU/g DS;或者仅仅是或者甚至低于0.1 AGU/g DS，例如 仅仅是或者甚至低于0.05 AGU/gDS淀粉底物。以mg酶蛋白质表达，具 有葡糖淀粉酶活性的酶或者不存在，或者其存在量仅仅是或者甚至低于0.5 mgEP/gDS;或者仅仅是或者甚至低于0.4 mg EP/g DS;或者仅仅是或者 甚至低于0.3 mg EP/g DS;或者仅仅是或者甚至低于0.1 mg EP/g DS，例 如仅仅是或者甚至低于0.05 mg EP/g DS，或者仅仅是或者甚至低于0.02 mgEP/gDS淀粉底物。方法步骤a)、 b)、 c)和/或d)可以分开或同时进行。
另一方面，方法可以包括a)使淀粉底物与经转化以表达包含具a-淀 粉酶活性的催化模块和碳水化合物结合模块的芽孢杆菌属物种707 (x-淀粉 酶或其变体的酵母细胞接触；b)使所述淀粉底物与所述酵母在足以实现至 少90% w/w所述淀粉底物转换为可发酵糖的温度和一段时间内一起孵育； c)发酵以生产乙醇；和d)任选地回收乙醇。步骤a)、 b)和c)可以分开或同 时进行。
再另一方面，方法包括水解糊化的淀粉或颗粒淀粉的浆液，特别是在 物。除了与包含具a-淀粉酶活性的催化模块和碳水化合物结合模块的多肽接触，淀粉还可以与如下之任一种或多种接触真菌a-淀粉酶(EC 3,2.1.1) 以及一种或多种如下酶p-淀粉酶(EC 3.2.1.2)和葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)。 再一方面，可向芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体中添加其他淀粉水 解酶或脱支酶，例如异淀粉酶(EC 3.2.1.68)或普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)。
在一实施方案中，所述方法在低于初始糊化温度的温度实施。此类方 法时常在至少30。C、至少31。C、至少32。C、至少33。C、至少34。C、至少 35。C、至少36。C、至少37。C、至少38°C、至少39°C、至少40°C、至少41。C、 至少42。C、至少43。C、至少44。C、至少45。C、至少46。C、至少47。C、至 少48。C、至少49。C、至少50。C、至少51。C、至少52。C、至少53""C、至少 54°C、至少55°C、至少56°C、至少57°C、至少58°C、至少59。C或至少60°C 实施。实施所述方法的pH可以处于约3.0至约7.0、或约3.5至约6.0、或 约4.0至约5.0的范围。 一方面考虑包括发酵的方法，例如，在32。C左右(例 如30-35。C)的温度，例如利用酵母生产乙醇。
另一方面，所述方法包括同时进行的糖化和发酵，例如，在30-35。C(例 如32。C左右)的温度，例如利用酵母生产乙醇或者利用其他适宜的发酵生 物生产期望的有机化合物。
在上述发酵方法中，乙醇含量达到至少约7%、至少约8%、至少约 9%、至少约10%、至少约11%、至少约12%、至少约13%、至少约14%、 至少约15%，例如至少约16。/。乙醇。
在上述任何方面中使用的淀粉浆可以具有约20%至约55%的干固形 物颗粒淀粉，或约25%至约40%的干固形物颗粒淀粉，或约30%至约35% 的千固形物颗粒淀粉。在与芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体接触之 后，酶将颗粒淀粉中的可溶性淀粉以至少85%、至少86%、至少87%、 至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至 少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的量转 化成可溶性淀粉水解物。
在另一实施方案中，在用于液化、糖化糊化的淀粉(例如但不限于通过 喷射蒸煮进行的糊化)的方法中使用包含具a-淀粉酶活性的催化模块和碳水化合物结合模块的芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体(例如第一方 面的多肽)。所述方法可以包括发酵以生产发酵产物例如乙醇。通过发酵由 含淀粉原料生产乙醇的此类方法包括(i)用包含具cx-淀粉酶活性的催化模 块和碳水化合物结合模块的多肽(例如第一方面的多肽)来液化所述含淀粉 原料；(ii)糖化所得的液化醪；和(iii)在发酵生物的存在下发酵步骤(ii)所得 的物质。任选所述方法还包括回收乙醇。所述糖化和发酵的方法可以以同 时糖化和发酵法(SSF法)实施。发酵期间，乙醇含量达到至少约7%、至少 约8%、至少约9%、至少约10%，例如至少约11%、至少约12%、至少 约13%、至少约14%、至少15%,例如至少16%乙醇。
在上述方面的方法中待加工的淀粉可以特别地来自块茎、根、茎、豆 类、谷物或整个谷粒。更具体地，颗粒淀粉可以获自玉米、玉米芯、小麦、 大麦、黑麦、买罗高梁、西米、木薯、木薯粉、高粱、稻、豌豆、豆、香 蕉或马铃薯。也考虑蜡质及非蜡质类型的玉米和大麦。
上文所述的组合物可用于液化和/或糖化糊化的或颗粒淀粉以及部分 糊化的淀粉。部分糊化的淀粉是在某种程度上糊化的淀粉，即，其中部分 淀粉已经不可逆地溶胀和糊化，而部分淀粉仍以颗粒状态存在。
上文所述的组合物可以包括以0.01-10.0 AFAU/g DS、或0.1-5.0 AFAU/g DS、或0.5-3.0 AFAU/AGU或0.3-2.0 AFAU/g DS的量存在的酸 性a-淀粉酶变体。所述组合物可以应用于任^可上文所述的淀粉加工方法 中。
如本文所用，名词或动词形式的术语"液化"表示将淀粉转化为链长较 短且粘性较小的糊精的过程。通常，此过程包括淀粉的糊化，同时或之后 添加芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体。也可以添加其他液化诱导酶。
如本文所用，术语"初次液化(primary liquefaction)"是指浆液温度升至 或接近其糊化温度时的液化步骤。继温度升高之后，4吏浆液传送通过热交 换器或喷射蒸煮器达到温度200-300下，例如220-235下。继应用热交换器 或喷射器温度之后，使浆液在该温度保持为期3-10分钟。这种保持浆液处 于200-300下的步骤为初次液化。
78如本文所用，术语"二次液化，，是指继初次液化(加热至200-300下)之 后，当浆液被允许冷却至室温时的液化步骤。此冷却步骤可以是30分钟至 180分钟(3小时)，例如90分钟至120分钟(2小时)。
如本文所用，术语"二次液化的分钟数"是指自二次液化开始时起所过 去的时间，即测量DE的时间。
另一方面考虑在包含芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体的组合物 中额外应用P-淀粉酶，p-淀粉酶(EC3.2.1.2)是外切产麦芽糖淀粉酶，其催 化直链淀粉、支链淀粉以及相关的葡萄糖聚合物中的1，4-a-糖苷键水解， 由此释放麦芽糖。
已经从多种植物和微生物中分离到p-淀粉酶(W. M. Fogarty和C. T. Kelly, PROGRESS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, 15巻，112-115 页，1979)。这些p-淀粉酶的特征在于具有处于40。C至65。C范围内的最适温 度，以及处于约4.5至约7.0范围内的最适pH。考虑的p-淀粉酶包括但不 限于来自大麦的p-淀粉酶Spezyme BBA 1500、 Spezyme DBA, Optimalt ME、 Optimalt BBA (Genencor International, Inc.); 以及 NovozymTM WBA (Novozymes AJS)。
考虑应用在组合物中的另一种酶是葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)。葡糖淀粉 酶来源于孩i生物或植物。示例性葡糖淀粉酶为真菌或细菌来源。示例性细 菌葡糖淀粉酶有曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉Gl或G2葡糖淀粉酶 (Bod等人，EMBO J. 3(5): 1097-1102 (1984))或其变体，例如WO 92/00381 和WO 00/04136中所^&开的；泡盛曲霉葡糖淀粉酶(WO 84/02921);米曲 霉葡糖淀粉酶(Agric. Biol. Chem. 55(4): 941-949 (1991))或其变体或片段。
其他考虑的曲霉属葡糖淀粉酶变体包括增强热稳定性的变体GIVA 和G139A (Chen等人(1996)， TV".9: 499-505); D257E和D293E/Q (Chen等人(1995)， 8: 575-582); N182 (Chen等人(1994)，
J /oc/ie附./. 301 : 275-281); 二硫键A246C (Fierobe等人(1996)， B"d^鹏'^j， 35: 8698-8704);以及在A435和S436位置中引入Pro残基(Li 等人(1997) Pn te/"10: 1199-1204)。其他考虑的葡糖淀粉酶包括篮状
79菌属葡糖淀粉酶，特别是来源于埃默森篮状菌(WO 99/28448)、 ra/fliw^c^ /^cert"w"s (美国专利No. RE 32,153)、杜邦篮状菌(7Wflfw^ces ^i/w/iri)、 嗜热篮状菌(r"/" 附F^幼w附o/7/^7/a)(美国专利No. 4,587,215)。考虑的 细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(C7oWnVZ/"柳)，特别是C. 狄er附oa附y/o(v,/cw附 (EP 135138)和 C 狄e簡o/^/msw^ii".cw附 (WO 86/01831)的葡糖淀粉酶。示例性葡糖淀粉酶包括来源于米曲霉的葡糖淀粉 酶。还考虑商业葡糖淀粉酶，例如AMG 200L; AMG 300 L; SAN1^ SUPER 和AMGTM E (来自Novozymes); OPTIDEX 300 (来自Genencor International, Inc.); AMIGASE⑧和AMIGASE PLUS (来自DSM); G-ZYME G900 (来自Enzyme Bio-Systems); G-ZYME G990 ZR (黑曲 霉葡糖淀粉酶且低蛋白酶含量)。
可按0.02-2.0 AGU/gDS，或者0.1-1.0 AGU/g DS，例如0，2AGU/gDS
的量添加葡糖淀粉酶。
也可以考虑在组合物中包括其他酶和酶变体。除了芽孢杆菌属物种 707 a-淀粉酶或其变体外，还可以使用一种或多种a-淀粉酶，或者还可以 包括本文中讨论的其它酶。
可以任选加入的另一种酶是脱支酶，例如异淀粉酶(EC 3.2丄68)或普 鲁兰酶(EC 3.2.1.41)。异淀粉酶水解支链淀粉和P-极限糊精中的a-l，6-D-糖苷分支键，并且通过异淀粉酶不能攻击普鲁兰及其对a-极限糊精的有限 作用而能够与普鲁兰酶区别开来。可以按本领域4支术人员熟知的有效量加 入脱支酶。
所述方法的产物的确切組成取决于所应用的酶组合以及所加工的颗粒 淀粉的类型。例如，可溶水解产物可以是纯度为至少约85%、至少约90%、 至少约95.0% 、至少约95,5% 、至少约96.0% 、至少约96.5% 、至少约97.0% 、 至少约97.5%、至少约98.0%、至少约98.5、至少约99.0%或至少约99.5% 的麦芽糖。或者，可溶淀粉水解产物可以是葡萄糖，或者淀粉水解物具有 至少94.5%、至少95.0%、至少95.5%、至少96.0%、至少96.5%、至少 97.0%、至少97.5%、至少98.0%、至少98.5、至少99.0%或至少99.5%
80的DX (葡萄糖占总溶解的干固形物的百分比)。该方法可以包括为特制糖 浆的产物，例如含有葡萄糖、麦芽糖、DP3和DPn的混合物的、用于生产 冰激凌、蛋糕、糖果、罐头水果的特制糖浆。
两种碾磨方法是湿磨法和干磨法。在干磨法中，碾磨和使用整个谷 粒。湿磨法提供胚芽和粗磨粉(淀粉颗粒和蛋白质)的良好分离，且除少数 例外情况， 一般应用在淀粉水解产物用于生产糖浆的场所。干磨法和湿磨 法均为淀粉加工领域公知，且同等地考虑与所公开的组合物和方法一起使 用。所述方法可在超滤体系中进行，其中保留物在酶、生淀粉和水的存在 下保持再循环，且其中透过物为可溶淀粉水解产物。同等考虑的是在具有 超滤膜的连续膜反应器中进行的方法，其中保留物在酶、生淀粉和水的存 在下保持再循环，且其中透过物为可溶淀粉水解产物。同样考虑的是在具 有微过滤膜的连续膜反应器中进行的方法，其中保留物在酶、生淀粉和水 的存在下保持再循环，且其中透过物为可溶淀粉水解产物。
一方面，将该方法的可溶淀粉水解产物转化为基于淀粉的高果糖糖浆 (HFSS)，例如高果糖玉米糖浆(HFCS)。这种转化可利用葡萄糖异构酶(例 如固定在固相支持物上的葡萄糖异构酶)实现。所考虑的异构酶包括商品 Sweetzyme , IT (Novozymes AJS); G-zyme IMGI和G-zyme G993 ， KetomaxTM， G-zyme G993 (Rhodia)， G-zyme G993液体和GenSweet IGI (Genencor International, Inc,)。
另 一方面，通过这些方法所生产的可溶淀粉水解产物可以用于生产燃 料或饮用乙醇。在第三方面的方法中，发酵可以与颗粒淀粉浆的水解同时 或分开/相继进行。当发酵与水解同时进行时，温度可以是30°C-35°C，或 31°C-34°C。该方法可以在超滤体系中进行，其中保留物在酶、粗淀粉、酵 母、酵母营养物和水的存在下保持再循环，且其中透过物为含乙醇的液体。
同等考虑的是在具有超滤膜的连续膜反应器中进行的方法，其中保留物在 酶、粗淀粉、酵母、酵母营养物和水的存在下保持再循环，且其中透过物 为含乙醇的液体。
所述方法的可溶淀粉水解产物也可以用于发酵产品的生产，包括将所处理的淀粉发酵成发酵产品，例如柠檬酸、谷氨酸单钠、葡糖酸、葡萄糖 酸钠、葡萄糖酸钾、葡萄糖酸钾、葡萄糖酸S内酯或异抗坏血酸钠。
芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体的淀粉水解活性可以利用马铃 薯淀粉作为底物来测定。此方法基于该酶对改性马铃薯淀粉的降解，且反 应后接着将淀粉/酶溶液样品与碘溶液混合。最初形成黑蓝色，但是在淀粉 降解期间，蓝色变弱，逐渐变成红棕色，将其与有色玻璃标准进行比较。
10.用于纺织品退浆的组合物及方法
还考虑使用一种或多种芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体处理织 物(例如，使纺织品退浆)的组合物和方法。该酶可以用于本领域众所周知 的任何织物处理方法中，参见例如美国专利No. 6,077,316。例如， 一方面， 可以通过包括将织物与芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体溶液接触的 方法，改善该织物的触感和外观。 一方面，该织物可以用该溶液在压力下 处理。
一方面，可以在纺织品纺织期间或之后、或在退浆阶段或者一个或多 个其他织物加工步骤的过程中施加酶。在纺织品纺织期间，纺线暴露于相 当大的机械张力。在机械织机上纺织之前，径纱通常涂上淀粉或淀粉衍生 物浆料，以增加其抗张强度并防止断裂。可以施加酶以除去这些淀粉或淀 粉衍生物浆料。在纺织品织成之后，织物可以ii^退浆阶段。这之后可接 着一个或多个其他织物加工步骤。退浆是从纺织品中除去浆料的行为。纺 织后必须除去浆料涂层，之后再进一步加工织物，以确保均一和耐洗效果。 本文还提供了包括通过芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体的作用来酶 促水解上浆料的退浆方法。
该酶可以单独或与其他退浆化学试剂和/或退浆酶一起用作为洗涤剂 添加剂，在例如水性组合物中，使织物(包括含棉织物)退浆。芽孢杆菌属 物种707 a-淀粉酶或其变体也可用于在龍蓝染色的粗斜棉布织物和衣服上 产生石洗外观的组合物和方法中。为生产衣服，织物可以剪裁并缝纫成衣 服或衣物，之后进行整理(finish)。特别是，为生产粗斜棉布牛仔服，已研发了不同的酶促整理方法。粗斜棉布衣服的整理通常始于酶促退浆步骤， 在此期间淀粉分解酶作用于衣服，以使织物柔软，并使该棉布更易于接受 随后的酶促整理步骤。本发明酶可用于整理粗斜棉布衣服(例如"生物打磨
法"(bio-stoning))、酶促退浆及为织物提供柔软度，和/或整理的方法中。 淀粉酶的剂量根据方法类型而有所变动。较小的剂量将比相同酶的较大剂 量需要更多的时间。然而，除了受限于溶液的物理约束之外，对退浆淀粉 酶的存在量并无上限要求。因此，酶的极限值可以是能够在溶液中溶解的 量。 一般，退浆酶如a-淀粉酶按织物重量计以约0.00001。/。至约2。/。酶蛋白 质的量掺入处理组合物之中；或按织物重量计约0.0001%至约1%酶蛋白 质；或按织物重量计约0.001%至约0.5%酶蛋白质；而在另一实例中，是 按织物重量计约0.01%至约0.2%酶蛋白质。
11.用于烘焙和食品制备的组合物及方法
对于面粉在烘焙和食品生产中的商用和家用而言，重要的是维持面粉 中适当水平的a-淀粉酶活性。太高的活性水平可能产生粘性和/或面团似的 滞销产品；但是a-淀粉酶活性不足的面粉可能不含足够的糖用于正常酵母 功能，导致不甜的易碎的面包。为增加面粉中的内源a-淀粉酶活性，可向 面粉中添加芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体形式的a-淀粉酶。因此， 确定面粉样品中内源(天然)和真菌a-淀粉酶或其他a-淀粉酶活性水平的能 力，将会有益于食品生产过程，并促进在食品生产中更有效地应用面粉。
除了在烘焙中应用谷物及其他植物产品外，诸如大麦、燕麦、小麦等 谷物以及诸如玉米、哗酒花和稻等植物成分还应用于工业酿造以及家庭酿 造。酉Hit中所用的成分可以是未制芽或是制芽的，这意味着部分发芽，从 而导致包括a-淀粉酶在内的酶水平增加。为成功酉l^，充足水平的a-淀粉 酶酶活是必要的，以确保有适当水平的糖进行发酵。
如本文所用，术语"面粉，，指研磨或磨碎的粮谷。术语"面粉"还可以表 示已经磨碎或捣碎的西米或块茎产品。在一些实施方案中，面粉还可以含 有除研磨或捣碎的谷类或植物材料之外的成分。其他成分的一个实例^
83松剂，不过并非旨在限制。#包括小麦、燕麦、黑麦和大麦。块茎产 品可包括木薯淀粉(tapioca flour)、 木薯粉(cassava flour)和eustard powder。术语"面粉，，还fe括磨碎的玉米粉、玉米面、米粉(rice flour)、粗 面粉、自发粉(self-rising flour)、木薯淀粉(tapioca flour)、木薯粉(cassava flour)、 米粉(ground rice)、 强化面粉和custard powder。
如本文所用，术语"原材料"表示粉碎或破碎的谷类和植物成分。例如， 啤酒生产中所用的大麦是已经被粗磨或粉碎的谷类，以便提供适于产生发 酵醪的粘稠度。如本文所用，术语"原材料"包括任何前迷类型的粉碎或粗 磨形式的植物和谷类。本文所述的方法可用于确定面粉以及原材料(其包括 已经粉碎的前述类型的谷类、块茎及其他植物产品)中的a-淀粉酶活性水 平。
还公开了测量面粉、谷类或块茎产品及原材料中a-淀粉酶活性的方 法，如本文所用，术语"a-淀粉酶，，指内源a-淀粉酶(存在于面粉或原材料之 中)或已经加入到面粉或原材料之中的芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其 变体。
可单独地或与其他淀粉酶组合添加芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其 变体以防止陈化。所用的抗陈化淀粉酶可以是任何有效延迟烘焙产品变陈 (面色瓤变硬)的淀粉酶。
在淀粉的存在下，淀粉酶可具有处于范围例如30-卯。C、 50-80°C、 55-75。C、 60-70。C中的最适温度。最适温度可在pH 5.5的1%可溶淀粉溶 液中测量。
可与芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶组合使用的其他抗陈化淀粉酶包括 内切淀粉酶，例如来自芽孢杆菌属的细菌内切淀粉酶。例如，其他淀粉酶 可以是产麦芽糖a-淀粉酶(EC 3.2.1.133)，例如来自芽孢杆菌属。Novamyl 是来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌林NCIB 11837的产麦芽糖a-淀粉酶，并描述 在C. Christophersen等人，1997 ^"/rA 50(1): 39-45中。
抗陈化内切淀粉酶的其他实例可包括其他细菌a-淀粉酶，源自例如芽 孢杆菌属，例如地衣芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌。
84抗陈化淀粉酶可以是外切淀粉酶，例如p-淀粉酶，例如来自植物(例如 大豆)，或来自微生物来源(例如芽孢杆菌属)。
芽孢杆菌属物种707的a-淀粉酶可单独地或与其他淀粉酶一起以有效 延迟烘焙产品变陈(抓变硬)的量添加。抗陈化淀粉酶的量一般处于0.01-10 mg酶蛋白质/kg面粉的范围，例如l-10mg/kg。
包括芽孢杆菌属物种707的a-淀粉酶的烘焙组合物还可以包括磷脂 酶。磷脂酶可具有Al或A2活性，以从磷脂中移去脂肪酸并形成溶血磷脂。 其可以具有或可以不具有脂肪酶活性，即对甘油三酸酯的活性。磷脂酶可 具有范围30-卯。C(例如30-WC)的最适温度。所添加的磷脂酶可以是动物 来源的，例如来自胰腺(例如牛或猪胰腺)、蛇毒液或蜂毒液。或者，磷脂 酶可以是^:生物来源的，例如来自丝状真菌、酵母或细菌，例如来自如下 属或种曲霉属，黑曲霉；网柄菌属(2)^0^对^//"柳)，盘基网柄菌(Z). ^foco/flfe画)；毛霉属，爪哇毛霉(My"vfl"/c"s),大毛霉(M.歸m/力，细孢 毛霉(M. sw6ft7/M/附ws);脉孢霉属(7Vewnw/wm)，粗糙脉孢霉(7V; cT"ssfl);根 毛霉属，微小根毛霉(兄/ ww7/船)；根霉属(及/i/zopws)，少根根霉(凡rwr/^"s)， 日；^艮霉(及.y'flp謂/c附)，旬枝根霉(i . sto/ow'y^r);核盘菌属(Sc/erW/"/")， 大豆核盘菌(51. /幼eW/ami);发癣菌属(7Wc/io/7/^to")，红色发癣菌(r. m6m附)；维氏核盘菌属(^7^^"/mVi), 『 sc/efC/orw附；芽孢杆菌属，巨 大芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌；柠檬酸细菌属(OM""w)，弗氏柠檬酸细菌 (C./"wi<///);肠杆菌属(五"te/^M"er)，产气肠杆菌(E "en gewes)，阴沟肠 杆菌(五.c/卯c"e);爱德华氏菌属(￡^/>^^/ >//")，迟钝爱德华氏菌(E ^y/"); 欧文氏菌属(￡>w/"/ ),草生欧文氏菌(E /^^Vo/fl);埃希氏菌属 (^sd^WcA/fl)，大肠杆菌(E 克雷伯氏菌属(/^6 >//"),肺炎克雷伯
氏菌(凡变形杆菌属(尸rofews)，普通变形杆菌(尸.vw/gfln's); 普罗威登斯菌属(/Vov/^w"fl)，斯氏普罗威登斯菌(户.W""Wi7);沙门氏菌属 (^"/附0"《//")，鼠伤寒沙门氏菌(51. (K/7/^附"r/"/m);沙雷氏菌属(Sermft'"),液 化沙雷氏菌(51. //^^/iwc/e"s),粘质沙雷氏菌0S.附flrc"ce附)；志贺氏菌属 0S7i/ge/to)，弗氏志贺氏菌(S./Ze;c"^/);链霉菌属C^^to附j;c")，紫红链霉菌OS. v/o/e"w"6w);耶尔森氏菌属(Jers/mVi)，小肠结肠炎耶尔森氏菌(K 镰孢霉属，尖镰孢(例如菌抹DSM2672)。
磷脂酶在烘焙后的初始阶段，特别是头24个小时，以改进面包柔软度 的量添加。磷脂酶的量一般处于0.01-10 mg酶蛋白质/kg面粉(例如，0.1-5 mg/kg)或200-5000 LEU/kg面粉(例如，500-2000 LEU/kg)的范围。具有脂 肪酶活性的磷脂酶通常以相当于20-1000 LU/kg面粉脂肪酶活性的量添 加，特别是50-500 LU/kg。 一LU(脂肪酶单位)定义为在30.0。C、 pH7.0、 以阿拉伯树胶作为乳化剂、以三丁酸甘油酯作为底物时，每分钟释放1 Hmol丁酸所需的酶量。
面团组成通常包括小麦面或小麦粉和/或其他类型的面、粉或淀粉，如 玉米粉、玉米淀粉、黑麦面、黑麦粉、燕麦粉、燕麦面、大豆粉、高粱面、 高粱粉、马铃薯面、马铃薯粉或马铃薯淀粉。面团可以是新鲜的、冷冻的 或是部分烘焙的。
面团通常是已膨发的面团或是待进行膨发的面团。面团可以以多种方 式进行膨发，例如通过添加化学膨;^剂(例如小苏打)或通过添加膨发面团 (发酵面团)。例如，面团可通过添加适宜的酵母培养物(例如酿酒酵母(面包 酵母)培养物，例如商购可得的酿酒酵母菌林)来膨发。
面团也可以包括其他常规的面团成分，例如蛋白质，如奶粉、面筋和 大豆；蛋(或为全蛋、蛋黄、或为蛋清)；氧化剂如抗坏血酸、溴酸钾、碘 酸钾、偶氮双甲酰胺(ADA)或过硫酸铵；氨基酸如L-半胱氨酸；糖；盐如 氯化钠、乙酸钩、硫酸钠或硫酸钾。
面团可以包括脂肪(甘油三酸酯)如颗粒状脂肪或起酥油。
面团可以还包括乳化剂，例如甘油单酸酯或甘油二酸酯、甘油单酸酯 或甘油二酸酯的双乙酰基酒石酸酯、脂肪酸的糖脂、脂肪酸的聚甘油酯、 甘油单酸酯的乳酸酯、甘油单酸酯的乙酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯 (polyoxyetliylene stearates)或溶血卵磷脂，但不添加乳化剂(除任选的鳞脂 外)而制备的面团也是适用的。
任选地，可与抗陈化淀粉酶和磷脂酶一起使用其他酶。其他酶可以是第二淀粉酶，如淀粉葡萄糖苷酶、p-淀粉酶、环糊精葡聚糖转移酶；或者 其他酶可以是肽酶，特别是外肽酶，转谷氨酰胺酶、脂肪酶、纤维素酶、 半纤维素酶，特别是戊聚糖酶如木聚糖酶，蛋白酶，蛋白质二硫键异构酶， 例如WO 95/00636中所公开的蛋白质二硫键异构酶，糖基转移酶，分支酶 (1 ，4-cx-葡聚糖分支酶)，4奮葡聚糖转移酶(糊精糖基转移酶)或氧化还原酶， 例如过氧化物酶、漆酶、葡萄糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、脂加氧酶、L-氨 基酸氧化酶或糖氧化酶。
其他酶可以是任何来源的，包括哺乳动物和植物来源，以及樣吏生物(细 菌、酵母或真菌)来源，并可通过本领域常规使用的技术获得。
木聚糖酶可为^:生物来源，例如源自细菌或真菌，例如曲霉属菌林， 特别是棘孢曲霉、黑曲霉(参见WO 91/19782)、泡盛曲霉(W0 91/18977)或 塔宾曲霉(WO 92/01793);源自木霉属菌林，例如里氏木霉，或源自腐质霉 属菌林，例如特异腐质霉(WO 92/17573)。 Pentopan⑧和Novozym 384@为 商购可得的由里氏木霉生产的木聚糖酶制品。
淀粉葡萄糖苷酶可以是黑曲霉淀粉葡萄糖苷酶(如AMG⑥)。其他有用 的淀粉酶产品包括Grindamyl A 1000或A 5000 (购自Grindsted Products,丹麦)及Amylase H或Amylase P (购自DSM Gist Brocades, 荷兰)。
葡萄糖氧化酶可以是真菌葡萄糖氧化酶，特别是黑曲霉葡萄糖氧化酶 Gluzyme )。示例'l"生蛋白酶有Neutrase (Novozymes)和Protex OxG (Genencor International, Inc.)。
示例性脂肪酶可来源于嗜热丝孢菌属(腐质霉属)、^^艮毛霉属、假丝酵 母菌属(Cflm/iW")、曲霉属、根霉属(/^/z印附)或假单胞菌属的菌林，特别 是来自疏棉状嗜热丝孢菌(疏毛腐质霉)、米黑根毛霉、南极洲假丝酵母 (Om^V/" "","r"/c")、黑曲霉、德氏根霉(及A/w/;附fife/e附"。或少根根霉 (/ /i/zo/^s tffr/r&"s)或洋葱假单胞菌CPs^/^wwwf"s ce/7ac/")。在具体实施方 案中，脂肪酶可以是如WO 88/02775中所述来自南极洲假丝酵母的脂肪酶 A或脂肪酶B，或者脂肪酶可以如EP 238,023中所述源自米黑根毛霉，或
87如EP 305,216中所述源自疏毛腐质霉，或如EP 214,761和WO 89/01032 中所述源自洋葱假单胞菌。
该方法可用于任何类型由面团制备的烘焙产品，无论是软的或是脆的， 无论是白面包型、酵母发酵的白面包型或是黑面包类型的。实例有面包(特 别是白面包、全麦面包或黑麦面包)， 一般为块或巻的形式，法式长棍型面 包、比塔饼、玉米粉圆饼、蛋糕、薄煎饼、饼干、曲奇饼、馅饼皮、酥面 包、馒头、比萨等等。
另一方面考虑在包括面粉连同抗陈化淀粉酶、磷脂酶和磷脂的预混物 中应用芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体。预混物可以含有其他改进 面团和/或改进面包的添加剂，例如4壬何添加剂，包括上文所述的酶。
另一方面提供了酶制品，包括抗陈化淀粉酶和磷脂酶，用作为烘焙添 加剂。酶制品可为颗粒或团聚的粉末的形式。其可具有窄的粒径分布，95% (以重量计)以上的颗粒处于25-500 nm的范围。
颗粒和团聚的粉末可通过常规方法制备，例如在流化床制粒机中通过 向载体上喷淀粉酶。载体可包括具有适宜粒径的粒核。载体可以是可溶或 不可溶的，例如盐(如NaCl或硫酸钠)、糖(如蔗糖或乳糖)、糖醇(如山梨糖 醇)、淀粉、稻、玉米渣或大豆。
另一方面考虑包封芽孢杆菌属物种707 (x-淀粉酶。为制备包封的a-淀 粉酶颗粒，使酶与下文进一步详述的食品级脂质以足以悬浮所有(X-淀粉酶 颗粒的量接触。
如本文所使用，食品级脂质可以是任何天然的不溶于7JC但溶于非极性 有机溶剂如烃或乙醚的有机化合物。所用的食品级脂质可包括但不限于饱 和或不饱和的脂肪或油形式的甘油三酸酯。构成所用的饱和甘油三酸酯的 脂肪酸及其组合的实例包括但不限于丁酸(来源于乳脂肪)、棕榈酸(来源 于动物及植物脂肪)和/或硬脂酸(来源于动物及植物脂肪)。构成所用的不饱 和甘油三酸酯的脂肪酸及其组合的实例包括但不限于棕榈油酸(来源于动 物及植物脂肪)、油酸(来源于动物及植物脂肪)、亚油酸(来源于植物油)和/ 或亚麻酸 来源于亚麻子油)。其他考虑且落在本范围的食品级脂质包括但不限于衍生自上文所讨论的甘油三酸酯的甘油单酯和甘油二酯，磷脂及 糖酯。
将液体形式的食品级脂质与粉末形式的a-淀粉酶颗粒以这样的方式 接触，从而脂质物质覆盖至少大多数(例如100%) a-淀粉酶颗粒的至少一 部分表面。因此，各a-淀粉酶颗粒独立地包封在脂质中。例如，全部或基 本上全部的a-淀粉酶颗粒均被提供有薄层连续的包封脂膜。这可通过首先 向容器中倾入一定量的脂质，然后将a-淀粉酶调成浆液，从而使脂质彻底 润湿各a-淀粉酶颗粒的表面而实现。在短期搅拌之后，回收其表面携带实 质量脂质的包封的a-淀粉酶颗粒。可通过选择所用脂质的类型，来控制向 a-淀粉酶颗粒如此施加的包衣的厚度，并在期望时通过重复操作以建造较 厚的膜。
包载的递送载体的储存、处理和掺入可通过包装混合物实现。包装混 合物可包括包封的a-淀粉酶。不过，包装混合物可以还含有生产商或面点 师所需的其他成分。在包封的ot-淀粉酶掺入到面团之中后，面点师继续进 行产品的常规生产方法。
包封a-淀粉酶的优势有两重。其一，对于热不稳定性酶而言，食品级 脂质在烘焙过程中保护酶免受热变性。结果，虽说a-淀粉酶在醒发和烘焙 阶段被稳定化和受保护，其在最终的烘焙产品中从保护性包膜中释放出来， 在这里水解多聚葡聚糖中的糖苷键。包栽的递送载体也确保向烘焙品持续 释放活性酶。也就是说，继烘焙过程之后，活性a-淀粉酶从保护性包膜中 持续释放，其释放速率抵消并因此减小陈化机制的速率。
一般而言，向a-淀粉酶颗粒施用的脂质的量可从a-淀粉酶总重的几个 百分点到该重量的许多倍进行变动，这取决于脂质的性质、向a-淀粉酶颗 粒施用脂质的方式、待处理面团混合物的组成、以及所涉及的面团混合操 作的强度。
以有效延长烘焙商品保存限期的量向用于制备烘焙商品的成分中添加 包载的递送载体(即，脂质包封的酶)。面点师可以计算为实现期望抗陈化 效果所需的如上文那样制备的包封a-淀粉酶的量。所需的包封a-淀粉酶的
89量基于被包封的酶的浓度以及a-淀粉酶与指定面粉的比例来计算。虽然已 发现广范围的浓度有效，但是正如已经讨论过的那样，抗陈化方面的可见 改进与a-淀粉酶浓度并不线性相关，而是超过一定的最低水平后，a-淀粉 酶浓度的大幅增加仅产生很小的额外改进。在特定烘焙生产中实际应用的 a-淀粉酶浓度可能比最低需要量高得多，以便向面点师提供一定的保障以 对抗因其无意低估引起的错误。酶浓度的下限由面点师希望达到的最低抗 陈化效果决定。
根据该方法，制备烘焙品的一个典型方法包括a)制备脂质包被的a-淀粉酶颗粒，其中基本上100%的a-淀粉酶颗粒被包覆；b)混合含面粉的 面团；c)在完成混合之前向面团中添加脂质包被的a-淀粉酶，在脂质包衣 从a-淀粉酶上去掉之前终止混合；d)醒发面团；和e)烘焙面团以提供烘 焙品，其中a-淀粉酶在混合、醒发和烘焙阶段无活性，而在烘焙品中有活 性。
因此，可在接近混合周期结束的时候向面团中添加包封的a-淀粉酶。 该方法的一个特征在于包封的a-淀粉酶在混合阶段中于允许包封的a-淀 粉酶充分地遍及整个面团分布的时间点添加，不过，混合阶段在保护性包 膜从a-淀粉酶颗粒剥落之前终止。根据面团的类型和体积、以及混合器的 作用方式和速度不同，可能需要1-6分钟或更长的任何时间将包封的a-淀 粉酶混入面团中，但平均为2-4分钟。因此，存在可以决定该精确程序的 几种变量。首先，包封的a-淀粉酶的量必须具有足以允许包封的a-淀粉酶 分布于整个面团混合物的总体积。如果包封的a-淀粉酶制品为高度浓缩 的，可能需要在向面团添加包封的a-淀粉酶之前先向预混物中添加额外的 油。食镨和生产方法可能需要特定的改变。不过，当将面包面团配方中指 定的25%的油从面团中扣除，而用作为浓缩的包封a-淀粉酶的载体在接近 混合周期结束的时候加入时， 一般能够达成良好的结果。在食语具有极低 脂肪含量的面包或其他烘焙品(如法式面包)中，已发现干面粉重量约1%的 包封a-淀粉酶混合物足以使包封的a-淀粉酶与面团彻底地混合，但可以生 效的百分比范围非常宽泛，并取决于配方、成品以及个体面点师的生产方法需求，而非任何已知的限制。其次，必须在混合周期中余下足够时间以
向混合物中添加包封的a-淀粉酶悬液，以便完全的混合入面团中，但是不
要太早以致于过度的机械作用使保护性脂质包膜从大比例的包封(X-淀粉
酶颗粒上剥落下来。
在另一实施方案中，向脂质包被的酶颗粒中添加细菌a-淀粉酶(BAA)。 已知BAA可以使面包缩小成为粘团，这是由于其在充分烘焙的面包块中 具有过度的热稳定性和保留活性。然而，已发现当在受保护的酶产品中掺 入BAA时，可以获得相当大的附加抗陈化保护作用，即便以非常低的BAA 剂量水平也是如此。例如，已发现150 RAU (参考淀粉酶单位)/100磅面 粉的BAA剂量是有效的。 一方面，向脂质包纟皮的酶产品添加约50-2000 RAU的BAA。此低BAA剂量水平，组合保护性包衣能够在充分烘焙的面 包块中阻止酶与淀粉自由接触的能力(除水蒸气随机地将酶自其包衣中释 放出来的情况之外)，有助于达成非常高水平的抗陈化活性，而没有BAA 的反面副作用。
对于本领域技术人员显而易见的是，可以对本文所述的以及下文实施 例中进一步举例的组合物和方法进行多种改动和变动而不偏离目的用途的 精神或范围。
实施例
实施例l芽孢杆菌属物种707ot-淀粉酶的密码子优化 从GeneArt (德国)订购合成的芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶基因 preLAT-Amy707 。编码芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶的该基因(A. Tsukamoto等人，1988必/oc/ie附.Co附附ww. 151(1): 25-31)，净皮 克隆到整合载体pICatH (见图4)中，得到命名为pICatH-Amy707(oril)的 产物(见图5)。 pICatH包含如下特征(l)温度敏感型复制起点(ori pE194， 用于在芽孢杆菌中复制)，(2) ori pBR322 (用于在大肠杆菌中扩增)，(3)用 于选择的新霉素抗性基因，和(4)用于选择、染色体整合及盒扩增的天然地 衣芽孢杆菌氯霉素抗性基因(car)。在许可温度(37°C)，将pICatH-Amy707(oril)转化到宿主菌林BML780 (BRA7 f汴生物，cat-， amyL-， spo-， aprL-， endoGluC-)中。选择一新霉素抗性(neoR)和一氯霉素抗 性(capR)转化林，并命名为BML780(pICatH-Amy707(ori1))。通过在非许 可温度(即 50。C)在具有氯霉素的TSB (胰蛋白胨大豆肉汤)培养基中生长 菌林，使BML780中的质粒(pICatH-707(ori))整合到地衣芽孢杆菌基因组 的区域。选择一个氯霉素抗性克隆，并命名为 BML780-pICatH-Amy707(oril)。所选的菌林再次在许可温度生长几代， 不加抗生素，以环出载体序列，然后选择一个新霉素敏感(neoS和capR) 克隆。在此克隆中，切除了染色体上的pICatH载体序列，包括新霉素抗 性基因，仅留下Amy707-cat盒。注意所使用的caf基因为天然地衣芽孢杆 菌基因，而Amy707基因为引入到宿主中的唯一异源DNA片段。
接下来，通过在具有渐增浓度氯霉素(即，5、 25、 50和75 ng/mL氯 霉素)的TSB培养基中生长菌林来扩增染色体上的Amy707-cat盒。在多轮 扩增之后，选择两个克隆(抗75 ng/mL氯霉素，并且当在含可溶淀粉的心 浸液琼脂板上生长时在碘染色后产生最大的晕圏) BML780-Amy707-CAP75克隆1和克隆2。两个菌林均在淀粉琼脂板上产 生大晕圏。
实施例2芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶的纯化 转化了 BML780-Amy707-CAP75的细胞利用本领域已知的技术发酵。 从发酵肉汤中分离细胞，并利用Millipore prep scale TFF-6 10K分子量截 断(MWCO)超滤膜柱(Millipore Corp., Bedford, MA;货号CDUF 006 TG) 浓缩肉汤以获得UFC。含有1-2 g/L a-淀粉酶的超滤浓缩物(UFC)在10 K 透析(SpecraPor Cat. No, 132119)管中用20 L溶于pH 5.0的25 mM乙酸钠 緩沖液的2 mM氯化钾透析过夜。透析物过滤，并将一半的物质上样到阳 离子交换柱(POROS HS 20 83 mL; Applied Biosystems, California)上；该 阳离子交换柱事先已经以溶于pH 5.0的25 mM乙酸钠緩冲液的1 mM氯 化钙平衡。柱用相同的緩冲液彻底洗涤，直至A280 nm的吸光度(A)小于
920.1个OD单位，且酶活性用溶于相同緩冲液中的0-100 mM氯化钠梯度进 行洗脱，a-淀粉酶活性在90 mM氯化钠处洗脱。基于利用Megazyme a-淀粉酶试剂盒(货号K-CERA; Megazyme)测量的酶促活性而合并具有活性 的级分。其余的样品类似处理，并与第一份样品合并。向1/3的此合并物 中添加硫酸铵至750 mM，并上样到96 mL苯基Sepharose柱(货号 17-0973-10; GE Healthcare)上，该柱事先已经用调整至pH 6.8的50 mM MES緩冲液(4-吗啉乙磺酸緩冲液)中所含的750 mM硫酸铵、2 mM氯化 4丐平衡。在用相同的溶剂洗涤之后，a-淀粉酶蛋白质以750 mM至OmM 硫酸铵梯度洗脱。酶活性在此梯度终点洗脱。合并具有酶活性的级分。类 似地纯化其余的离子交换合并级分。组合所有的苯基Sepharose合并物， 并在具有10 K纤维素膜(Millipore)的搅拌的Amicon cell (Millipore)中浓 缩。浓缩物利用10 K透析管以50 mM hydrogen maleate緩沖液(pH 6.8) 中所含的5 mM氯化钙透析16小时。向此透析样品补加10%山梨糖醇以 助酶溶解。在除菌过滤后，通过凝胶光密度分析法来定量含芽孢杆菌属物 种707a-淀粉酶的样品，显示2.8mg/mL的量。
实施例3性能表征
在稻淀粉污染的织物样片上用与淀粉结合的指示染料进行性能试验 (Test Fabrics货号CS-28; TestFabrics Inc.)。洗涤性能通过指示染料向溶 液相的釋，放来判断。在测定前，染色的试验织物用蒸馏水预洗l小时，然 后风干。试验织物的预洗在测定前除去了任何差结合的指示染料。
从预洗织物上切下1/4英寸的圆盘，并置于96孔板中。向各孔中加入 190 nL洗涤剂(IEC-A头碱洗涤剂；货号88010-1; WFK Testgewebe GmBH， 德国)。带有样片和洗涤剂的板在40。C预孵育15分钟。向各孔添加10nL 体积的、来自实施例2的0-3 ppm芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或对照0-3 ppm a-淀粉酶(OxAm (Purastar ) Genencor International, Inc.),以起始反 应。板随之在大约40。C以750 rpm (Eppendorf Thermomix)孵育10分钟。 孵育后，将150 ftL上清液转移到新板中，并在A488 nm测量上清液(其含有释放的指示染料)的吸光度。
为进行比较，利用Stainzyme (Novozymes)和OxAm (Purastar⑧； Genencor International, Inc.)(地衣芽孢杆菌a-淀粉酶的一种衍生物 (Genencor产品))进行类似的测定。测定中应用(K5.2 ppm (mg/L)，条件同 上文所述。
pH 8.0 (洗衣条件)时IEC "A"标准洗涤剂的数据示于图1。将吸光度作 为a-淀粉酶浓度的函数进行了绘图。此试验显示，在这些条件下，芽孢杆 菌属物种707 a-淀粉酶的性能比OxAm (Purastar⑧)显著更佳，且与 Stainzyme⑧相当。
利用相同的测定法、相同量的芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶以及(相同) 量的Stainzyme⑧和OxAm (Purastar ),将pH调整至10.1重复该测定。 这些条件(即，增加pH)使人联想到自动餐具洗涤中的条件。在pH 10.1时， 芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶的性能再一次地比OxAm (Purastar )更佳， 且令人惊讶地比Stainzyme⑧更佳。见图2。
实施例4利用Terg-o-tometer的洗涤剂测定 #辨和才法 使用的样片
CFT可可在棉上，STC CFT CS-2 (TestFabrks)
CFT全卵带颜料在棉上，STC CFT CS-37 (TestFabrics)
CFT着色的稻淀粉在棉上，STC CFT CS-28 (TestFabrics)
每轮试验2x白色漂白的棉
利用额外的压栽物(ballast)以造成40 g/L常规载量 在1L Terg-o-tometer中
5 mM HEPES pH 8.0,1.5 g/L AATCC HDL WOB (2003) 1.8 g/L Tide,带漂白替代物(灭活的)
6 gpg水硬度，温度在74°F或23.3 °C 处理
941). AATCC; 2). AATCC + 0.1 ppm 707 a-淀粉酶；3). AATCC + 0.1 ppm Stainzyme ; 4). Tide; 5),灭活Tide; 6).灭活Tide + 0.1 ppm 707 a-淀粉酶；7).灭活Tide + 0.1 ppm Stainzyme ; 8).灭活Tide + 0.1 ppm 707 a一定粉酶+ 0.5 ppm Purafect Prime;灭活Tide + 0.1 ppm Stainzyme + 0.5 ppm Purafect Prime (Genencor)。 AATCC存在量为1.5 g/L，而灭活 Tide存在量为l,8g/L。
潜采。对于可可和卵污渍而言，在对照和酶处理之间未观察到清洁性 能的差异，这提示两种污渍的清洁饱和，如图6所示。活性Tide产生的结 果与使用0.1 ppm 707 a-淀粉酶时灭活Tide的相当。707 a-淀粉酶的性能 比Stainzyme⑧^f氐。添力口 Purafect Prime并不改变Stainzyme 或707 a-淀粉酶的清洁性能(图6)。
实施例5利用Launder-o-meter试验a-淀粉酶
使用的样片
CFT可可在棉上，STCCFTCS-2
CFT全卵带颜料在棉上，STCCFTCS-37
着色的淀粉在棉上，EMPA161
CFT着色的玉米淀粉在棉上，STCCFTCS-26
CCFT着色的稻淀粉在棉上，STC CFT CS-28 向缸(Pot)中添加
向各缸中加入2x白色漂白棉布。向各缸中加入额外的压载物以造成 42 g/200 mL常规载量(漂白的棉毛布(cotton interlock))。水具有12 gpg的 7jC5更度。测定在40。C进行40分钟。 处理
8 g/L IEC八*带漂白剂。这些洗涤剂组合物或者在仅有洗涤剂时、或 者在洗涤剂加0.2 ppm 707 a-淀粉酶(4 mg/mL)的存在下、或者是在洗涤剂 加0.2 ppm Stainzyme 的存在下进行试验。在洗涤之前和之后均利用
95Minolta反射计以50 mm孔径来度量清洁程度。
潜果。测定表明在清洁可可和全卵样片方面，对照和酶处理之间没有 显著的性能差异(图7)。带漂白剂的IEC AA对照显示出芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶比Stainzyme⑧表现更佳。
实施例6餐具洗涤剂
^^^々才法。芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶与Stainzyme⑧和OxAm (Purastar⑧)一起在自动洗碟机中针对米乳污渍进行了试验。如图8所示， 洗涤剂为WfK C (含标准ADD的磷酸盐)和漂白剂(WFK Testgewebe GmBH，德国)；所用的漂白剂为过硼酸盐。Stainzyme⑧以25 mg/g的等价 活性酶的浓度应用。芽孢杆菌属物种707以4 mg/g的浓度应用。OxAm (Purastar⑧)具有其中3,2 mg = 0.6 % Ww剂量的浓度。瓷盘用来自IKW 的混合淀粉和米乳(Genencor International, Inc.)污染。Genencor乳-米污 渍在140。C在瓷盘上烘烤。污染的餐具在Miele洗碟机中于50。C以21°GH 的7jO更度洗涤。米乳测定结果示于图8。混合淀粉测定结果示于图9。洗涤 剂组合物中还加入了 0.8%的properase 4000D。 a-淀粉酶在该自动餐具洗 涤条件下以0.4、 0.8、 1.6和3.2mg总活性酶的酶剂量加入。
潜采。芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶在全等级(full-scale)自动洗碟机 (ADW)试验中达到了 Stainzyme⑧的性能，并且至少具有处于实验误差范 围内的Stainzyme⑧活性。芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶在自动餐具洗涤条 件下比OxAm (Purastar⑧)具有更高的性能。
实施例7芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶及变体 如上文实施例1-2所述的密码子优化的变体可进一步重组修饰以包括 如下文献中所教导的任何变异美国专利No. 6,093,562; 6,187,576; 6,197,565; 6，204，232; 6,297,038; 6，309，871; 6,486,113; 6，528，298; 6,623,948; 6,673,589; 6，867，031和6,887,986; ^>开的美国申请No. 20040096952; 20040253676; 20050059131; 20050084937; 20050196853; 2005025664和20060035323;欧洲申请No, EP 1423513和EP 1538155;国际PCT申请 No. WO 01/64852; WO 0166712; WO 01/88107; WO 01/96537', WO 02/092797和WO 02/10355 ;以及日本申请No. JP2001520006 ; JP2001521739; JP2002530072和JP2004505606.
实施例8 M202L a-淀粉酶变体 M202L变体利用标准方法通过用亮氨酸取代a-淀粉酶序列202位上的 甲硫氨酸而创建。其他变体可包括M208及M261位的不同M酸取代， 以及这3个位点上一个或多个取代的组合。任何变体的纯化可如上所述进 行。
实施例9 Amv707变体的清洁能力 ^"^N^才法。如上文所讨论的CS-28稻淀粉污染的样片于20。C在所示 a-淀粉酶的存在下在有或没有漂白剂的情况下孵育。该测定应用IEC "A" 标准条件。变体通过本领域技术人员已知的标准方法制备，并且未从培养 物上清中纯化即应用。变体的浓度通过SDS PAGE凝胶光密度分析法来确 定。用于此实验的洗涤剂为以8 g/L应用的IEC "A"。当存在漂白剂时， 其由漂白活化体系过硼酸钠(sodium perporate)(13.7 mM)和TAED (1.85 mM)提供。
潜果。与不含漂白剂的溶液相比，在漂白剂的存在下芽孢杆菌属物种 707 M202L变体具有更高的活性。与野生型芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶 获得的结果相比，M202L变体在漂白剂的存在下具有增加的活性。见图 10。不存在漂白剂时，M202L变体的活性不及包含野生型形式的组合物。
所有上文引述的参考文献以其整体作为参考并入本文用于所有目的。
权利要求
1.手工或自动餐具洗涤组合物，其包括芽孢杆菌属物种707α-淀粉酶或其变体，和表面活性剂、洗涤剂助剂、络合剂、聚合物、漂白剂、CaCl2、漂白体系、稳定剂、增泡剂、抑泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、抗污垢再沉积剂、染料、杀细菌剂、助水溶物、晦暗抑制剂和香料中的一种或多种。
2. 清洁餐具的方法，包括施用权利要求l的手工或自动餐具洗涤组合物。
3. 洗衣洗涤剂添加剂，其包括芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体。
4. 洗衣洗涂剂，包括权利要求3的洗衣添加剂，并且还包括以下之一 种或多种，和表面活性剂、洗涤剂助剂、#剂、聚合物、漂白体系、漂 白剂、CaCl2、稳定剂、增泡剂、抑泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、抗污垢再 沉积剂、染料、杀细菌剂、助水溶物、荧光增白剂、织物调理剂和香料中 的一种或多种。
5，权利要求4的洗衣洗涤剂，其中CaCl2在洗涤剂中以约0.1 mM至 约20 mM的量存在。
6. 分离的编码芽孢杆菌属物种707a-淀粉酶或其变体的核酸，其中所 述变体具有选自SEQIDNO: 3的M202、 M208、 S255、 R172和/或M261 的取代的残基取代或缺失。
7. 权利要求5的分离的核酸，其中M202变体是选自M202L、M202V、 M202S、 M202T、 M202I、 M202Q和M202W的取代变体；其中S255取 代是S255N;且其中R172取代是R172Q。
8. 包含SEQ ID NO: 3的a-淀粉酶或其变体，其中所述变体包含SEQ ID NO: 3残基M202、 M208和/或M261位的残基取代或缺失。
9. 权利要求8的a-淀粉酶，其中所述变体是(a)选自M202L、M202V、M202S、M202T、M202I、M202Q和M202W 的M202变体；(b) S255变体S255N;和/或(c) R172变体R172Q。
10. 栽体，含有权利要求6的核酸。
11. 分离的宿主细胞，含有权利要求6的核酸。
12. 分离的宿主细胞，含有权利要求10的载体。
13. 权利要求11或12中任一项的分离的宿主细胞，其中细胞为微生物。
14. 权利要求13的分离的宿主细胞，其中微生物是细菌或真菌。
15. 权利要求14的分离的宿主细胞，其中细菌是选自枯草芽孢杆菌 (5鏡W"s s"Mfo)、 地衣芽孢杆菌CB.扁簡/or附/s)、 迟緩芽孢杆菌(及 /e",附)、短芽孢杆菌(5. 6rev&)、嗜热脂肪芽孢杆菌(及Sfefl/^/^f7m /7A//ws)、 嗜碱芽孢杆菌(及"汰"/o/ /^7"力、解淀粉芽孢杆菌(必.tf/^/o/z^we/ac/ews),凝 结芽孢杆菌CB. co叹"/"附)、环状芽孢杆菌(及"Vr"/朋s)、灿烂芽孢杆菌(及/fl"似S)、苏云金芽孢杆菌(及,ZlW7"g/e"wX)、变铅青链霉菌(S^印to/^C^//v,V/a附)或鼠灰链霉菌(S.附w/""s)的革兰氏阳性菌；或是革兰氏阴性菌， 其中所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌CE^/^Wc/hVi 或假单胞菌属
16. 权利要求8的多肽在衣物洗涤和/或餐具洗涤中的用途。
17. 权利要求8的a-淀粉酶或其变体在衣物洗涤和/或餐具洗涤中的用途。
18. 洗涤剂添加剂，包括权利要求8的a-淀粉酶或其变体，任选地为 无粉尘颗粒、微粒、稳定的液体或受保护的酶的形式。
19. 权利要求18的洗涤剂添加剂，其中所述洗涤剂添加剂还包括选自 下组的酶纤维素酶、蛋白酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化 氢酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、 a-半乳糖苦酶、(5-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡萄糖苷酶、p-葡萄糖苷酶、 卤代过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶裂 解酶、肽基谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、普鲁兰酶、异淀粉酶、角叉茱聚
20. 权利要求19的洗涤剂添加剂，其中淀粉酶为另外的a-淀粉酶、(5-淀粉酶、异淀粉酶或葡糖淀粉酶。
21. 洗涤剂组合物，包括权利要求8的a-淀粉酶或其变体。
22. 洗涤剂组合物，包括权利要求18的洗涤剂添加剂。
23. 权利要求21的洗涤剂组合物，还包括选自下組的酶纤维素酶、 蛋白酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、几丁质酶、角质 酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苷酶、p-半乳 糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡萄糖苷酶、(5-葡萄糖苷酶、卣代过氧化物酶、 转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶裂解酶、肽基谷氨酰 胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转 谷氨酰胺酶、木聚糖酶、普鲁兰酶、异淀粉酶、角叉菜聚糖酶或其任意组 合。
24. 手工或自动餐具洗涤洗涤剂组合物，包括权利要求8的a-淀粉酶 或其变体多肽。
25. 权利要求24的手工或自动餐具洗涤洗涤剂组合物，还包括选自下 组的酶纤维素酶、蛋白酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢 酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖普酶、p-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡萄糖苷酶、p-葡萄糖苷酶、 卤代过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶裂 解酶、肽基谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、 核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、普鲁兰酶、异淀粉酶、角叉菜聚 糖酶或其任意组合。
26. 权利要求24或22中任一项的手工或自动餐具洗涤洗涤剂组合物， 还包括表面活性剂、洗涤剂助剂、M剂、聚合物、漂白剂、CaCl2、漂 白体系、稳定剂、增泡剂、抑泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、抗污垢再沉积剂、 染料、杀细菌剂、助水溶物、晦暗抑制剂和香料中的一种或多种。
27. 权利要求26的手工或自动餐具洗涤洗涂剂组合物，其中CaCl2在 洗涤剂中以约0.1 mM至约20 mM的量存在。
28. 洗涤剂添加剂，包括权利要求8的a-淀粉酶或其变体。
29. 手工或自动衣物洗涤组合物，包括权利要求28的洗涤剂添加剂。
30. 权利要求29的手工或自动衣物洗涤组合物，还包括选自下组的酶 纤维素酶、蛋白酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、几丁 质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苷 酶、p-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡萄糖普酶、p-葡萄糖苷酶、由代过 氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶裂解酶、 肽基谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖 核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、普鲁兰酶、异淀粉酶、角叉菜聚糖酶 或其任意组合。
31. 斥又利要求29或30中4壬一项的手工或自动衣物洗涤组合物，还包 括如下之一种或多种，和表面活性剂、洗涤剂助剂、*剂、聚合物、漂 白体系、漂白剂、CaCl2、稳定剂、增泡剂、抑泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、 抗污垢再沉积剂、染料、杀细菌剂、助水溶物、荧光增白剂、织物调理剂和香料中的一种或多种。
32. 权利要求31的手工或自动衣物洗涤组合物，其中CaCl2在所述组 合物中以约0.1 mM至约20 mM的量存在。
33. 手工或自动衣物洗涤组合物，包括权利要求8的a-淀粉酶或其变体。
34. 权利要求33的手工或自动衣物洗涤组合物，还包括选自下组的酶 纤维素酶、蛋白酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、几丁 质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苷 酶、p-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡萄糖苷酶、P-葡萄糖苷酶、卣代过 氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶裂解酶、 肽基谷氨酖胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖 核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、普鲁兰酶、异淀粉酶、角叉菜聚糖酶或其任意组合。
35. 权利要求33和34中任一项的手工或自动衣物洗涤组合物，还包 括如下之一种或多种和表面活性剂、洗涤剂助剂、络合剂、聚合物、漂白 体系、漂白剂、CaCl2、稳定剂、增泡剂、抑泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、 抗污垢再沉积剂、染料、杀细菌剂、助水溶物、荧光增白剂、织物调理剂 和香料中的一种或多种。
36. 权利要求8的a-淀粉酶或其变体在纺织品退浆中的用途。
37. 纺织品退浆组合物，包括在水性溶液中的权利要求8的芽孢杆菌 属物种707 a-淀粉酶或其变体，且任选地包括酶。
38. 权利要求37的纺织品退浆组合物，其中所述变体是(a) 选自M202L、M202V、M202S、M202T、M202I、M202Q和M202W 的M202变体；(b) S255变体S255N;和/或(c) R172变体R172Q。
39. 使纺织品退浆的方法，包括施用权利要求37或38中任一项的退 浆组合物足以使所述纺织品退浆的一段时间。
40. 淀粉加工组合物，包括在水性溶液中的权利要求8的芽孢杆菌属 物种707 a-淀粉酶或其变体。
41. 权利要求40的淀粉加工组合物，其中所述变体是(a) 选自M202L、M202V、M202S、M202T、M202I、M202Q和M202W 的M202变体；(b) S255变体S255N;和/或(c) R172变体R172Q。
42. 权利要求40的淀粉加工组合物，还包括葡糖淀粉酶、异淀粉酶、 普鲁兰酶、植酸酶或其组合。
43. 加工淀粉的方法，包括施用权利要求40-42中任一项的组合物足 以加工所述淀粉的 一段时间。
44. 生物膜水解组合物，包括在溶液或凝胶中的权利要求8的芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体，且任选地还包括.纤维素酶、半纤维素酶、 木聚糖酶、脂肪酶、蛋白酶、果胶酶、抗孩i生物剂或其任意组合。
45. 权利要求44的生物膜水解组合物，其中所述变体是(a) 选自M202L、M202V、M202S、M202T、M202I、M202Q和M202W 的M202变体；(b) S255变体S255N;和/或(c) R172变体R172Q。
46. 水解生物膜的方法，包括施用权利要求44或45中任一项的组合 物足以加工所述生物膜的一段时间。
47. 用于糖化淀粉的组合物，包括在溶液中的权利要求8的芽孢杆菌 属物种707 (x-淀粉酶或其变体。
48. 权利要求47的组合物，其中所述变体是(a) 选自M202L、M202V、M202S、M202T、M202I、M202Q和M202W 的M202变体；(b) S255变体S255N;和/或(c) R172变体R172Q。
49. 糖化淀粉的方法，包括施用权利要求47或48中任一项的组合物 足以糖化所述淀粉的一段时间。
50. 用于液化淀粉的组合物，包括在溶液中的权利要求8的芽孢杆菌 属物种707 a-淀粉酶或其变体。
51. 权利要求50的组合物，其中所迷变体是(a) 选自M202L、M202V、M202S、M202T、M202I、M202Q和M202W 的M202变体；(b) S255变体S255N;和/或(c) R172变体R172Q。
52. 液化淀粉的方法，包括施用权利要求50或51中任一项的组合物 足以液化所述淀粉的一段时间。
53. 烘焙组合物，包括在溶液或凝胶中的权利要求8的芽孢杆菌属物种707 a-淀粉酶或其变体。
54. 权利要求53的烘焙组合物，其中所述变体是(a) 选自M202L、M202V、M202S、M202T、M202I、M202Q和M202W 的M202变体；(b) S255变体S255N;和/或(c) R172变体R172Q。
55. 烘焙方法，包括施用权利要求53或54中任一项的烘焙组合物。
全文摘要
本发明公开了来源于芽孢杆菌属物种707的α-淀粉酶的变体，包括所述变体的组合物，以及使用所述变体的方法。使用方法包括清洁表面、洗涤纺织品、退浆、从多种基质上水解生物膜、以及处理淀粉(例如液化和糖化)的方法。
文档编号D06M16/00GK101679987SQ200880015125
公开日2010年3月24日 申请日期2008年3月4日 优先权日2007年3月9日
发明者B·E·琼斯, C·常, C·弗勒门, C·纳比, H·德诺贝尔, M·科尔克曼, W·韦勒 申请人:丹尼斯科美国公司