一株节杆菌及其在降解黄曲霉毒素中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株节杆菌及其在降解黄曲霉毒素中的应用。本发明提供了一株节杆菌(Arthrobacter?sp.)L15，其保藏编号为CGMCC?No.8869。本发明的实验证明，本发明发现了一株节杆菌L15，将其发酵液与黄曲霉毒素溶解混匀，其可以高效降解黄曲霉毒素，因此该菌作为黄曲霉毒素降解的生物材料，无论在开发新的生物降解菌剂还是生物降解无菌制剂方面都具有很好的应用前景。
【专利说明】一株节杆菌及其在降解黄曲霉毒素中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一株节杆菌及其在降解黄曲霉毒素中的应用。
【背景技术】
[0002]黄曲霉毒素(Aflatoxin, AFT)是一类主要由黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(A.parasiticus)真菌产生的有毒次级代谢产物，具有致癌、致畸、致细胞突变的作用，仅0.294mg/kg剂量就能引起敏感动物的急性中毒死亡(Bondy and Pestka, 2000 ；ffanget al., 2002 ；Rawal, et al., 2010),其主要的作用祀标是肝脏,是诱发恶性肿瘤原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)的主要因素之一,此外还可以引起肾脏和肾上腺的急性病变(Poirier et al., 2000 ；Kensler et al.,2011)。
[0003]黄曲霉毒素的基本结构是二呋喃环和氧杂萘邻酮(香豆素)，前者为基本毒性结构，后者有加强毒性及致癌作用。目前已发现的黄曲霉毒素约有20种，在紫外光下发蓝色光(Blue)的为B族(黄曲霉毒素B1和B2),发绿光(Green)的为G族(黄曲霉毒素G1和G2)。黄曲霉毒素M1是AFB1的羟基化衍生物。其中AFB1分布最广、含量最高、毒性最强，其毒性是氰化钾的10倍、砒霜的68倍。
[0004]传统的黄曲霉毒素去毒方法有物理和化学方法，包括氨化法、碱法、高温法、射线辐照法及超滤-渗滤法等，这些方法存在效果不稳定、营养成分损失大、降解产物复杂、降解产物毒性难以确定， 以及难以规模化生产等缺点；此外，还有吸附法，吸附法在吸附毒素的同时也会吸附营养成分。生物法，是利用微生物及其分泌的酶等代谢产物降解黄曲霉毒素的方法。生物法具有效率高、特异性强以及对食品、饲料和环境没有污染的特点，是黄曲霉毒素降解的方向。
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的是提供一株节杆菌。
[0006]本发明提供的一株节杆菌(Arthrobacter sp.) L15,其保藏编号为CGMCCN0.8869。
[0007]上述节杆菌L15和/或其菌悬液和/或其发酵液和/或其代谢产物在降解黄曲霉毒素中的应用也是本发明保护的范围。
[0008]上述节杆菌L15和/或其菌悬液和/或其发酵液和/或其代谢产物在制备降解黄曲霉毒素的产品中的应用也是本发明保护的范围。
[0009]上述应用中，所述黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2或黄曲霉毒素Μ:。
[0010]本发明的另一个目的是提供一种降解黄曲霉毒素的方法。
[0011]本发明提供的方法，包括如下步骤:用上述的节杆菌L15对黄曲霉毒素进行降解处理。[0012]上述方法中，所述降解处理的方式为将所述节杆菌L15的菌悬液和/或其发酵液和/或其代谢产物与含有黄曲霉毒素的样品和/或产品混合。
[0013]所述含有黄曲霉毒素的样品和/或产品具体为含有黄曲霉毒素的农产品加工原料、饲料、食品及环境样品和/或产品。
[0014]上述方法中，所述黄曲霉毒素为B族黄曲霉毒素、B族黄曲霉毒素的衍生物和/或G族黄曲霉毒素，其中，所述B族黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1或黄曲霉毒素B2 ;所述G族黄曲霉毒素为黄曲霉毒素G1或黄曲霉毒素G2。所述B族黄曲霉毒素的衍生物为黄曲霉毒素M1O在本发明中，所述黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2或黄曲霉毒素Μ:。
[0015]所述含有黄曲霉毒素的样品和/或产品具体为含有黄曲霉毒素的农产品加工原料、饲料、食品及环境样品和/或产品。
[0016]在本发明的实施例中，所述降解处理为节杆菌L15的培养液与黄曲霉毒素溶液混合；黄曲霉毒素溶液由黄曲霉毒素和色谱纯甲醇组成，且黄曲霉毒素在黄曲霉毒素溶液中的终浓度为IOOppb。
[0017]节杆菌L15 培养液为将节杆菌(Arthrobacter sp.) L15 (CGMCC N0.8869)接种于液体NB培养基中，在温度为28°C和转速为200rpm(旋转半径20mm)的条件下振荡培养24h后，培养容器内的所有物质记作L15培养液。
[0018]菌株L15已于2014年2月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号 为CGMCC N0.8869，分类命名为节杆菌Arthrobacter sp.。
[0019]本发明的实验证明，本发明发现了一株节杆菌L15，将其发酵液与黄曲霉毒素溶解混匀，其可以高效降解黄曲霉毒素，因此该菌作为黄曲霉毒素降解的生物材料，无论在开发新的生物降解菌剂还是生物降解无菌制剂方面都具有很好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为黄曲霉毒素B1降解效果液相色谱图
[0021]图2为黄曲霉毒素B2降解效果液相色谱图
[0022]图3为黄曲霉毒素G1降解效果液相色谱图
[0023]图4为黄曲霉毒素G2降解效果液相色谱图
[0024]图5为黄曲霉毒素M1降解效果液相色谱图
【具体实施方式】
[0025]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0026]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0027]NB液体培养基:由溶剂和溶质组成；溶质为蛋白胨、牛肉膏和NaCl，溶剂为水；蛋白胨在NB液体培养基中的浓度为I %，牛肉膏在NB液体培养基中的浓度为0.3%，NaCl在NB液体培养基中的浓度为0.5%，所述％均为质量体积百分比(g/100ml)。
[0028]NA固体培养基:在NB液体培养基中加入琼脂(琼脂与液体培养基的比例为1.5g:100ml)，得到NA固体培养基。[0029]实施例1、菌的分离与鉴定
[0030]一、菌的分离
[0031]( 一)2013年6月，在超净工作台中，将采集自北京郊区土壤样品放在无菌蒸馏水中震荡15分钟制备菌悬液，摇床转速为180rpm。
[0032]( 二)将菌悬液用无菌蒸馏水进行浓度梯度稀释后涂布在NA培养基平板上，300C条件下培养24小时，菌落布满整个平板，用接种环挑取平板上形态、大小、颜色、透明度不同的菌株平板划线纯化，点接纯化后的菌株应用于黄曲霉毒素降解实验。得到的一株黄曲霉毒素降解能力强的菌株命名为L15。
[0033]二、鉴定
[0034]1、形态和生理生化特性
[0035]按照“伯杰细菌鉴定手册”(第八版)和“常见细菌系统鉴定手册”(东秀珠，蔡妙英等编著，北京:科学出版社，2001.2)中描述的方法，对菌株L15进行形态特征和生理生化特性鉴定，具体结果如下:
[0036]菌体的形态和生理生化特性:
[0037]呈杆状；革兰氏阳性；氧化酶:_ ;接触酶:+ ;淀粉水解:+ ;酪素水解:_ ;硝酸盐还原:+ ;50°C生长:_。
[0038]Biolog GEN II 生长实验表明，菌株L15可以利用a_D_葡萄糖、p-羟基苯乙酸、糊精、D-甘露糖、丙酮酸甲酯、D-麦芽糖、D-果糖、L-丙氨酸、D-乳酸甲酯、D-海藻糖、D-半乳糖、L-精氨酸、L-乳酸、D-纤维二糖、L-天冬氨酸、柠檬酸、龙胆二糖、D-岩藻糖、L-谷氨酸、α -酮戊二酸、蔗糖、L-岩藻糖、L-组氨酸、松二糖、L-鼠李糖、L-焦谷氨酸、L-苹果酸、水苏糖、肌苷、L-丝氨酸、溴代丁二酸、D-棉子糖、果胶、D-甘露醇、Y -氨基丁酸、D-蜜二糖、α-羟丁酸、β-甲基-D-葡糖苷、D-葡糖酸、β-羟基-D，L-丁酸、D-水杨苷、甘油、D-葡萄糖醛酸、α - 丁酮酸、N-乙酰-D-葡糖胺、乙酰乙酸、丙酸、奎宁酸和乙酸。
[0039]Biolog GEN III化学敏感实验表明，菌株L15对I %乳酸钠、萘啶酸、ρΗ6.0、氯化锂、ΡΗ5.0、氨曲南、1% NaCl、丁酸钠、4% NaCl和溴酸钠等测定条件敏感。
[0040]对林可霉素、夫西地酸、盐酸胍、D-丝氨酸、十四烷硫酸钠、醋竹桃霉素、万古霉素、利福霉素SV、四唑紫、8% NaCl、二甲胺四环素、四唑蓝等所测定条件不敏感。
[0041]2、16S rDNA 试验
[0042]提取L15的总DNA，以其为模板，利用细菌16S rDNA通用引物(27f:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG ；1492r:GGTTACCTTGTTACGACTT)进行 PCR 扩增，得到长度约为
1.3kb的扩增产物，将扩增产物回收并进行测序,扩增产物的核苷酸序列为序列表中的序列
1
[0043]根据Gen-Bank 序列同源性比较，菌株 L15 与 Arthrobacter sp.bE58 (2011)(GenBank登录号JF772506.1)同源性为99 %，初步判定该菌为节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)。
[0044]基于以上特征，将菌株L15鉴定为节杆菌(Arthrobacter sp.)。该菌株已于2014年2月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCN0.8869,分类命名为节杆菌Arthrobacter sp.。[0045]实施例2、节杆菌L15对黄曲霉毒素降解作用
[0046]一、培养活化
[0047]将节杆菌(Arthrobacter sp.) L15CGMCC N0.8869接种于液体NB培养基中，在温度为28°C和转速为200rpm (旋转半径20mm)的条件下振荡培养24h后，培养容器内的所有物质记作L15培养液L15培养液，用于后续的黄曲霉毒素降解实验。
[0048]二、节杆菌L15对黄曲霉毒素B1降解作用
[0049]1、黄曲霉毒素B1溶液(AFB1)的配制: [0050]将Img黄曲霉毒素B1标准品(Sigma-aldrich?，货号A6636)溶解于2ml色谱纯甲醇中获得浓度为500ppb的黄曲霉毒素B1溶液。
[0051]2、降解实验
[0052]实验组:取0.4ml上述一获得的L15培养液置于1.5ml离心管中，加入0.1ml浓度为500ppb的黄曲霉毒素B1溶液至其终浓度为lOOppb，充分混匀37°C静置72h后，1000Og离心10min去除细胞。
[0053]对照组:以0.4ml不接菌的NB培养基加入0.1ml浓度为500ppb的黄曲霉毒素Biq
[0054]3、黄曲霉毒素B1的检测:
[0055]首先使用甲醇冰(6:4)溶液对实验组上清液、对照组和黄曲霉毒素B1标准品分别进行萃取，然后使用免疫亲和净化柱对样品残留毒素进行净化提取(方法参照免疫亲和柱使用说明书)；最后用HPLC-T0F-MS对净化提取得到的样品进行检测。
[0056]HPLC检测条件为流动相甲醇冰=I:1 ;流速lml/min ;色谱柱C18150mmX4.6mm,
0.5 μ m ;激发波长350nm，检测波长450nm ;柱温30°C ;进样量20 μ I。
[0057]AFB1降解率(％ )=(对照组残留AFB1含量-实验组残留AFB1含量)/对照组残留AFB1含量X 100。
[0058]结果如图1和表1所示，A:黄曲霉毒素标准品(黄曲霉毒素B1的保留时间为
13.009min) ；B:对照组(黄曲霉毒素B1的保留时间为13.660min) ；C:实验组(黄曲霉毒素B1的保留时间为13.126min)；
[0059]对照组中残留黄曲霉毒素B1含量为98.65±3.86ppb ；
[0060]实验组中残留黄曲霉毒素B1含量为21.34±2.46ppb ；
[0061]结果表明，L15对黄曲霉毒素B1有较好的降解效果，降解率78.37±2.49%。
[0062]三、节杆菌L15对黄曲霉毒素B2降解作用
[0063]1、黄曲霉毒素B2的配制:
[0064]将Img黄曲霉毒素B2标准品(sigma-aldrich?，货号A9887)溶解于2ml色谱纯甲醇中获得浓度为500ppb的黄曲霉毒素B2溶液。
[0065]2、降解实验
[0066]实验组:与上述二的方法基本相同，不同的是替换为黄曲霉毒素B2溶液。
[0067]对照组:与上述二的方法相同。
[0068]3、黄曲霉毒素B2的检测:
[0069]与上述二的方法相同。
[0070]AFB2降解率(％ )=(对照组残留AFB2含量-实验组残留AFB2含量)/对照组残留AFB2含量X 100。[0071 ] 结果如图2和表1所不，A:黄曲霉毒素标准品(黄曲霉毒素B2的保留时间为
11.401min) ；B:对照组(黄曲霉毒素B1的保留时间为11.382min) ;C:实验组(黄曲霉毒素B1的保留时间为11.310min)；
[0072]对照组中残留黄曲霉毒素B2含量为105.89 ± 1.69ppb ；
[0073]实验组中残留黄曲霉毒素B2含量为53.58±2.89ppb。
[0074]结果表明，L15对黄曲霉毒素B2有一定的降解效果，降解率为49.40 ±2.73%。
[0075]四、节杆菌L15对黄曲霉毒素G1降解作用
[0076]1、黄曲霉毒素G1的配制:
[0077]将Img黄曲霉毒素G1标准品(Sigma-aldrich?，货号32756)溶解于2ml色谱纯甲醇中获得浓度为500ppb的黄曲霉毒素G1溶液。
[0078]2、降解实验
[0079]实验组:与上述二的方法基本相同，不同的是替换为黄曲霉毒素G1溶液。
[0080]对照组:与上述二的方法相同。
[0081]3、黄曲霉毒素G1的检测: [0082]与上述二的方法相同。
[0083]AFG1降解率(％ )=(对照组残留AFG1含量-实验组残留AFG1含量)/对照组残留AFG1含量X 100。
[0084]结果如图3和表1所不，A:黄曲霉毒素标准品(黄曲霉毒素G1的保留时间为
9.706min) ；B:对照组(黄曲霉毒素G1的保留时间为9.746min) ；C:实验组；
[0085]对照组中残留黄曲霉毒素G1含量为101.19±3.17 ；
[0086]实验组中残留黄曲霉毒素G1含量为Oppb。
[0087]结果表明，L15对黄曲霉毒素G1有很好的降解效果，降解率为100±0%。
[0088]五、节杆菌L15对黄曲霉毒素G2降解作用
[0089]1、黄曲霉毒素G2的配制:
[0090]将Img黄曲霉毒素G2标准品(Sigma-aldrich?，货号A0263)溶解于2ml色谱纯甲醇中获得浓度为500ppb的黄曲霉毒素G2溶液。
[0091]2、降解实验
[0092]实验组:与上述二的方法基本相同，不同的是替换为黄曲霉毒素G2溶液。
[0093]对照组:与上述二的方法相同。
[0094]3、黄曲霉毒素G2的检测:
[0095]与上述二的方法相同。
[0096]AFG2降解率(％ )=(对照组残留AFG2含量-处理组残留AFG2含量)/对照组残留AFG2含量X 100。
[0097]结果如图4和表1所不，A:黄曲霉毒素标准品(黄曲霉毒素G2的保留时间为
8.681min) ；B:对照组(黄曲霉毒素G1的保留时间为8.902min) ；C:实验组；
[0098]对照组中残留黄曲霉毒素G2含量为83.42±2.47bbp ；
[0099]实验组中残留黄曲霉毒素G2含量为Obbp。
[0100]结果表明，L15对黄曲霉毒素G2有很好的降解效果，降解率为100±0%。
[0101]六、节杆菌L15对黄曲霉毒素M1降解作用[0102]1、黄曲霉毒素M1的配制:
[0103]将Img黄曲霉毒素M1标准品(Sigma-aldrich?,货号34031)溶解于2ml色谱纯甲醇中获得浓度为500ppb的黄曲霉毒素M1溶液。
[0104]2、降解实验
[0105]实验组:与上述二的方法基本相同，不同的是替换为黄曲霉毒素M1溶液。
[0106]对照组:与上述二的方法相同。
[0107]3、黄曲霉毒素M1的检测:
[0108]与上述二的方法相同。
[0109]AFM1降解率(％ )=(对照组残留AFM1含量-实验组残留AFM1含量)/对照组残留AFM1含量X 100。
[0110]结果如图5和表1所示，A:黄曲霉毒素标准品(黄曲霉毒素M1的保留时间为
7.847min) ；B:对照组(黄曲霉毒素M1的保留时间为7.866min) ；C:实验组(黄曲霉毒素M1的保留时间为7.920min)；
[0111]对照组中残留黄曲霉毒素M1含量为92.97±0.56bbp ；
[0112]实验组中残留黄曲霉毒素M1含量为16.43±0.41bbp。
[0113]结果表明，L15对黄曲霉毒素M1有很好的降解效果，降解率为82.33±0.44%%。
[0114]表1节杆菌L15对黄曲霉毒素的降解效果
[0115]
【权利要求】
1.一株节杆菌(Arthrobacter sp.) L15，其保藏编号为 CGMCC N0.8869?
2.权利要求1所述的节杆菌L15和/或其菌悬液和/或其发酵液和/或其代谢产物在降解黄曲霉毒素中的应用。
3.权利要求1所述的节杆菌L15和/或其菌悬液和/或其发酵液和/或其代谢产物在制备降解黄曲霉毒素的产品中的应用。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于:所述黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2或黄曲霉毒素Mp
5.一种降解黄曲霉毒素的方法，包括如下步骤:用权利要求1所述的节杆菌对黄曲霉毒素进行降解处理。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述降解处理的方式为将权利要求1所述的节杆菌L15的菌悬液和/或其发酵液和/或其代谢产物与含有黄曲霉毒素的样品和/或产品混合。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于:所述黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2或黄曲霉毒素Mp
【文档编号】A62D3/02GK103981132SQ201410203045
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月14日 优先权日:2014年5月14日
【发明者】刘阳, 赵月菊, 兰茨纳·桑格, 娅娃·米妮·埃尔迪·富丽, 邢福国, 周露, 王龑 申请人:中国农业科学院农产品加工研究所