专利名称：新的过氧化氢酶、其基因及包含其的组合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种新的过氧化氢酶及其应用，以及一种制备过氧化氢酶的方法。具体而言，本发明提供了一种克隆自耐热性芽孢杆菌(Bacillusthermoglucosidasius)的新的过氧化氢酶，包含该过氧化氢酶的组合物，以及一种利用基因工程的方法克隆过氧化氢酶基因、构建其表达质粒、转化细胞以获得高产量的过氧化氢酶的方法。
过氧化氢(H2O2)，俗称双氧水，其具有杀菌、清洁、漂白及消毒功效，因而常用于隐形眼镜的消毒液及织物的漂白剂中，且是合法的食品添加剂。但是过氧化氢容易产生高活性的游离氧，强烈的氧化作用会使蛋白质变性，所以不论用过氧化氢消毒隐形眼镜或漂白织物，最后都必须分解残留的过氧化氢，以防止过氧化氢对使用者的伤害。
为了上述目的，业界常利用过氧化氢酶来分解残留的过氧化氢，此亦公认为最有效率的方法。例如USP4,585,488,USP5,145,644,USP5,362,647,USP5,521,091即揭示了在隐形眼镜的消毒过程中添加过氧化氢酶以分解消毒液中残留的过氧化氢。另外，GB2216149及JP-A-104781等专利亦曾揭示在以过氧化氢漂白布料后，须经过氧化氢酶处理以分解残留的过氧化氢，最后再进行染色。
过氧化氢酶[过氧化氢的氧化还原酶(EC11.11.1.6)]可将两分子的过氧化氢(H2O2)氧化成一分子氧(O2)及还原成两分子水(H2O)，其催化反应式如下过氧化氢酶过氧化氢酶存在于自然界的某些动、植物及微生物细胞中，为此类细胞存活于含氧环境中所必需具备的酶。目前过氧化氢酶的制备大都由此类细胞经纯化而来。尤其从牛肝纯化而来的过氧化氢酶更是业界最常使用的过氧化氢酶。但因欧洲牛群于1990年暴发慢性病毒疾病，即俗称的疯牛病(BSE)，且已有研究显示此病可能会传染给人类(Dealler及Lorey 1991 Nutr.Health(Bicester)7:117-134,Dealler及Lacey 1990,Food Microbio 17:253-280)，因此产业界逐渐倾向以非哺乳动物来源的过氧化氢酶，例如微生物来源的过氧化氢酶来取代牛肝过氧化氢酶。
已知可发酵产生过氧化酶的微生物包括黑曲霉(Aspergillus niger)、点青霉(penicillium notatum)及藤黄微球菌(Micrococcus luteus)等。例如，USP3123539曾揭示自黑曲霉及点青霉等真菌获得过氧化氢酶；USP2,635,069、5,360,732及WO93/17721揭示以黑曲霉生产过氧化氢酶；而USP5521091则揭示源自藤黄微球菌及黑曲霉的过氧化氢酶。上述专利的过氧化氢酶都是传统方法，经由发酵特定微生物、打破菌体，再加以纯化而来。
然而，以此等发酵方式所获得的过氧化氢酶产量皆极低，例如根据美国专利USP3,123,539报告，将95磅湿重藤黄微球菌菌体经蛋白回收后所得1000克产物中，仅含5％的过氧化氢酶；而根据美国专利USP,2,635,069报告，由黑曲霉所获得的粗蛋白萃取物每克仅有2.4单位活性的过氧化氢酶。为了提高过氧化氢酶的产量，USP5,360,732曾针对黑曲霉进行菌种改良，使其每毫克粗蛋白萃取物可达到14.17单位活性，然而若依WO93/1772表1所报告的黑曲霉过氧化氢酶的比活性每微克约7.5单位活性计算，此14.17单位活性是由1.9微克的过氧化氢酶所表现，换言之，由USP5,360,732所获得的粗蛋白萃取物，亦仅含有少于0.2％的过氧化氢酶。
Shuichi Furuta与Hiroaki Hayashi于J.Biochem.107,708-713(1990)中揭示以基因工程技术表达重组的大鼠过氧化氢酶基因。然而其产量亦不高，在经纯化前仅有约16毫克/4升。
由上观之，目前产业界所使用的过氧化氢酶，不论是在来源及制备方法方面皆仍有极大的改良空间。
本发明的目的即在于克隆一种新的过氧化氢酶。
本发明进一步的目的在于提供一种利用基因工程方法制造微生物来源的过氧化氢酶的方法。根据本发明方法所制得的过氧化氢酶不但产量极高，且活性亦极佳。
本发明亦提供了本发明方法中所构建的新的重组质粒及转化细胞。
本发明的再一目的在于提供一种用于分解隐形眼镜上残余消毒液中过氧化氢的组合物，其包含本发明的新的过氧化氢酶。
图1pET20b/kat19表达质粒的构建。
图2过氧化氢酶kat19基因的DNA序列。
图3pET15b/kat19表达质粒的构建。
图4pET20b/katTG表达质粒的构建。
图5过氧化氢酶katTG基因的DNA序列。
图6过氧化氢酶TG的氨基酸序列。
图7pET20b/katHP11表达质粒的构建。
图8过氧化氢酶HP11基因的DNA序列。
图9各转化菌株表达过氧化氢酶的12％聚乙酰胺凝胶电泳分析图，由左到右依次为pET15b,pET15b/kat19,pET20b,pET20b/kat19,pET20b/katTG,pET20b/katHP11转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株后，表达过氧化氢酶的图谱。
图10纯化的过氧化氢酶的12％聚乙酰胺凝胶电泳分析图，由左到右分别由pET15b/kat19,pET20b/kat19,pET20b/katTG,pET20b/katHP11转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞所纯化的过氧化氢酶。
本发明所提供的新的过氧化氢酶是利用Bol及Yashin,Gene109,31-37(1991)所揭示的枯草芽孢杆菌过氧化氢酶基因(kat19)的5’及3’端DNA序列合成适当的5’及3’引物后，自耐热性芽孢杆菌(Bacillusthermoglucosdasius)所克隆而得，其基因的DNA序列如图5所示，与kat19基因的相似性为74.4％。将该基因插入适当的表达载体，再转化宿主细胞令其表达后，即得本发明的新的过氧化氢酶，其氨基酸序列示于图6。本发明的新的过氧化氢酶未曾由任何文献揭示。
本发明亦提供了一种利用基因工程技术制备过氧化氢酶的方法，其包含(a)将编码该过氧化氢酶的基因嵌入含适当转录启动子的表达载体上以构建重组质粒；(b)将该重组质粒转化到适当的宿主细胞；(c)于适合该转化细胞表达过氧化氢酶基因的条件下培养该转化细胞；及(d)纯化所表达的过氧化氢酶蛋白质。
本发明的方法除可生产前述的新的过氧化氢酶外，亦适用于克隆其它微生物来源的过氧化氢酶。详言之，本发明方法是以基因库中各种微生物的过氧化氢酶基因的DNA序列为基础设计出适当的引物，以之扩增微生物染色体中的过氧化氢酶基因、构建表达载体、转化宿主细胞，并令其表达而制得可用于本发明方法的“微生物”是指含有过氧化氢酶基因的任何微生物，较佳为细菌，例如枯草芽孢杆菌(如CCRC910064)、大肠杆菌(如CCRC51731)、假单胞菌(如CCRC292607)、藤黄微球菌(如CCRC11034)，以及生产本发明新的过氧化氢酶的耐热性芽孢杆菌(如CCRC14687)等，并不特定限于何者，本领域技术人员可依自身需要加以选用。
源自微生物的过化氢酶基因可藉现有技术方法予以扩增，例如聚合酶链反应(简称PCR)。聚合酶链反应是自1980年代以来常用的一种扩增特定基因序列的技术(如USP4,683,195,4,683,202等)，其实施步骤首先是自生物样本中分离出靶核酸序列，将其双链打开，再以依靶基因两端序列所合成的引物进行杂交，利用聚合酶在适当量的脱氧核苷三磷酸(如dATP、dGTP、dCTP及dTTP等)的存在下进行扩增。所需的反应参数及试剂皆为本领域技术人员所熟知的。上述的聚合酶链反应可以逐步操作，然而较常见者是以商购的自动化装置(温度循环仪)进行。
扩增所得的过氧化氢酶基因是以公知方法插入适当的表达载体中，包括任何可用于细菌、酵母、哺乳动物细胞及昆虫细胞表达系统的表达载体，例如pBR、pUC、pUB或pET系列的质粒。本领域技术人员可依其惯用者或视需要选用。
构建完成的表达载体随后转化适当的宿主细胞并令其表达。可用于本发明的宿主细胞包括细菌(如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌等)、酵母(如酿酒酵母)、哺乳动物细胞(如小鼠纤维母细胞)，或是昆虫细胞等。其中较佳为细菌细胞表达系统，特佳则为大肠杆菌。转化的宿主细胞株于便利该外来质粒大量表达的条件下培养，最后将所欲蛋白质产物予以分离。根据本发明所获得的粗蛋白萃取物中约含15～50％的具活性的过氧化氢酶。再依常法，如组氨酸亲合层析法或丙酮沉淀法予以纯化后，可得到约95％纯度的过氧化氢酶。
由本发明方法制备过氧化氢酶，不但操作简易且成本低廉，产量亦远较已有发酵方法所得者为高，活性亦极佳，十分适于作为分解过氧化氢的组合物，尤其是用于清除残留于隐形眼镜上过氧化氢的组合物。
因此，本发明亦提供了由本发明的新的过氧化氢酶所组成的用于分解残留于隐形眼镜上的过氧化氢的组合物。
制备包含本发明过氧化氢酶产物的组合物的方法，其组成及使用方法皆是本领域技术人员所熟知的，例如可参考诸多文件的记载，如USP5,521,091,5,362,647,5,145,644,4,585,488等。这种组合物可制成溶液的形式，或是呈固体组合物的形式，如锭剂、胶囊等。
在本发明组合物的一实施方案中，其是包含一水性等张液体基质，内含本发明的过氧化氢酶。此等水性等张液体基质较佳包含可有效控制pH值的量的常规缓冲成分，更佳可控制液体基质的pH值的量的常规的缓冲成分，更佳可控制液体基质的pH于3至10左右的范围内，例如约6至8。
过氧化氢酶的量优选是足以分解所有存在于消毒隐形眼镜的含过氧化氢基质中的过氧化氢，且需不损坏隐形眼镜本身且不影响配戴的安全与舒适性。一般而言，其量可在10至1000，较佳为20至800过氧化氢酶活性国际单位/毫升液体基质的范围内。
本发明组合物的另一实施方案是固体组合物，其可呈锭剂、胶囊、一或多个固体颗粒等形式。此等固体组合物包括一经涂层的部分(如核心体)，以及一障壁物质或延迟释放成分。本发明的过氧化氢酶即内含于该经涂层部分(或核心体)中。而该障壁物质(包括水溶性的乙烯系聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇等、水溶性蛋白质、多糖类及纤维素衍生物，如甲基纤维素等)可使本发明组合物在与含过氧化氢基质接触时能延缓其过氧化氢酶的释出，令过氧化氢有充分时间消毒隐形眼镜。其详细的组成皆在上文提及的参考文献中详述。
为使本发明的内容更为明确，兹以下列非限制性实施例进一步详细说明。
实施例1 pET20b/kat19表达质粒的构建枯草芽孢杆菌染色体DNA的提取首先将10克Bacto-胰蛋白胨、5克Bacto-酵母萃取物及10克NaCl溶于1公斤的去离子水中，以1N NaOH溶液调整酸碱度至pH7.5，高压灭菌待其冷却制得Luria-Bertani(LB)培养液若添加50毫克/毫升的氨苄青霉素溶液2毫升即为LB/Amp培养液。
将3毫升配制所得的LB培养液于摄氏37度震荡培养枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus,CCRC 910064),24小时后以5000rpm离心15分钟，以水清洗菌体一次，再次离心后倒掉上清液，加入0.75毫升水并加入0.75毫升苯酚萃取30分钟，以12000rpm离心15分钟，取出上层液后再加入0.75毫升苯酚萃取30分钟，12000rpm离心15分钟后取出上层液再以0.75毫升氯仿萃取15分钟，12000rpm离心，取出上清液后加入2倍体积乙醇，离心15分钟(12000rpm)，沉淀DNA，以75％乙醇洗一次，再用TE缓冲液(10mM Tris-HCl,pH7.5,1mM EDTA)溶解染色体DNA。
枯草芽孢杆菌过氧化氢酶基因(kat-19)的扩增5’端及3’端引物的合成根据Bol及Yashin,Gene 109,31-37(1991)所揭示的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis,YB2003)过氧化氢酶基因序列(kat-19，示于图2)的5’端及3’端DNA序列，合成5’端引物NdeⅠ-kat19(+)，其DNA序列如下T T C A T A T G A G T T C A A A T A A A C T G A C A A C T此序列含NdeⅠ限制酶序列；以及3’端引物kat19-XhoⅠ(-)，其DNA序列如下T T C T C G A G T T A A G A A T C T T T T T T A A T C G G C A A此序列含XhoⅠ限制酶序列。
聚合酶链反应(PCR)取0.5微克枯草芽孢杆菌染色体DNA，加入10微升2.5mM dNTPs,10微升10×PC2缓冲液(50μM Tris-HCl,pH9.1,16mM硫酸铵，3.5mM MgCl2及150微克/毫升BSA),10微升的0.2微克/毫升5’端引物，1.0微升的0.2微克/毫升3’端引物，78微升水及1.0微升的5U/微升klentaq(AB peptides公司)后，再加入50微升矿物油于上层。设定温度循环仪(Robocycle,STRATAGENE公司)的反应参数如下摄氏94度1分钟，1个循环；摄氏94度×30秒，摄氏54度×1分钟，摄氏72度×1.5分钟等为一个循环，共反应30个循环。聚合酶链反应后，以QI A quick Spm PCR纯化试剂盒(QI AGEN公司)纯化聚合酶链反应的产物，以100微升水冲提出产物，用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳分析和溴化乙锭染色观察，确定扩增所得DNA片段的大小如同预期，亦即约1.5kb。pE T20b/kat19表达质粒的构建(图1)
以NdeⅠ及XhoⅠ限制性酶于摄氏37度下反应3小时，酶切PCR产物，利用琼脂糖凝胶电泳分离DNA，切出约1.5kb片段，再以电泳冲提出DNA片段，续以QI A quick Spm PCR纯化试剂盒纯化DNA。纯化后的DNA用T4DNA连接酶于摄氏16度下反应16小时，将其连接到已用NdeⅠ及XhoⅠ限制酶切开的pET-20b表达载体(Novogen公司)上，将连接反应后的混合物转化DH5α菌株，经筛选得到较pET20b为大的质粒，再经由限制性酶分析并利用Sanger’s方法与Sequence Version 2.0 DNA测序试剂试盒(购自United States Biochemical公司)，以T7启动子序列(ATTAATACGACTCACTATAGG)为引物，测定DNA序列，确定克隆到的1.5kb DNA片段为kat-19基因，而完成pET20b/kat1 9表达质粒的构建，并于1997年11月18日保藏于美国典型培养物保藏中心，保藏号为ATCC209467。实施例2 pET15b/kat1 9表达质粒的构建(图3)利用NdeⅠ及XhoⅠ限制酶自pET20b/kat1 9表达质粒上切下kat-19基因，经琼脂糖凝胶电泳分离后，切下1.5kb的DNA片段，以电泳冲提并用QI A quick Spin PCR纯化试剂盒来纯化DNA。经纯化的DNA用T4DNA连接酶于摄氏16度下反应16小时，连接到已用NdeⅠ及XhoⅠ限制酶切开的pET-15b表达载粒上，构建成pET15b/kat1 9表达质粒。利用T7启动子序列为引物，测定5’端DNA序列，确定已克隆完成pET15b/kat1 9表达质粒。该质粒已于1997年11月18日保藏于美国典型培养物保藏中心，保藏号为ATCC 209469。实施例3 pET20b/katT G表达质粒的构建(图4)于摄氏55度下培养耐热性芽孢杆菌(B acillus thermoglucosdasius,CCRC 14687)，依实施例1的方法由培养菌体中抽取耐热性枯草芽孢杆菌的染色体DNA。为了扩增其过氧化氢酶基因，首先合成其3’端引物(kat TG-XhoⅠ(-))，其DNA序列如下
T T C T C G A G T T A A G A A T C T T T T T T A A T C G G C A A除此之外，其余材料与方法皆与实施例1所述扩增kat1 9基因的步骤相同。经聚合酶链反应后，得到1.5kb大小的DNA片段。将此DNA片段予以纯化后，与XhoⅠ限制酶于摄氏37度下反应2小时，再次纯化后，于4℃下保存。
于摄氏37度下以NdeⅠ限制酶酶切pET20b表达载体，反应2小时并纯化后，以klenow酶补平，再次纯化后以XhoⅠ限制酶于摄氏37度反应2小时，用0.8％琼脂糖凝胶分离DNA，切下3.7kbDNA片段再以电泳法将之冲提出后，续用QLA quick Spin PCR纯化试剂盒纯化该DNA片段，得到NdeⅠ位置被补平且XhoⅠ位置被切开的pET20b载体。将此载体与前述的1.5kb片段于摄氏16度下用T4DNA连接酶进行连接反应16小时后，转化DH5α细胞。经筛选后抽取质粒，得到pET20b/katTG表达质粒，利用Sanger′s方法并以Sequence version2.0测序试剂盒测定所克隆的DNA片段的序列(其DNA序列如图5所示)，其与kat1 9相似性为74.4％。经转译所得蛋白质的氨基酸序列如图6所示，其与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的植物性过氧化氢酶(vegetative catalase)相似性则为81.0％。
上述的pET20b/kat TG质粒已于1997年11月18日保藏于美国典型培养物保藏中心，保藏号为ATCC209468。实施例4 pET20b/katH P11表达质粒的构建(图7)依实施例1的方法抽取大肠杆菌DH5α(CCRC 51731)的染色体DNA。然后根据J.B acteriol 173,514-520所揭示大肠杆菌HP11基因的DNA序列(如图8)合成5’端引物(NdeⅠ HP11(+))，其序列如下T C C C A T A T G T C G C A A C A T A A C G A A A A G A A C此引物中含NdeⅠ限制酶序列。另合成3’端引物(HP11-XhoⅠ-(-))，其序列如下T T T C T C G A G G G C A G G A A T T T T G T C A A T C T T A G G此引物中含XhoⅠ限制酶序列。以大肠杆菌DH5α(CCRC 51731)染色体DNA为样本，按照实施例1的聚合酶反应条件扩增HP11基因(其中除将引物的延伸时间改为2分钟外，其余条件皆与实施例1相同)，得到如预期的2.0kb大小的DNA片段。
依照实施例1的方法，构建pET20b/katHP11表达质粒，经限制酶切及DNA测序，确定所克隆到的2.0kbDNA片段为HP11基因。该质粒已于197年11月18日保藏于美国典型培养物保藏中心，保藏号为ATCC209470。实施例5过氧化氢酶的表达将pET20b、pET15b、pET20b/kat1 9、pET20b/katTG及pET20b/katHP11表达质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，然后以20毫升LB/Amp培养液于摄氏37度下震荡培养至O.D.600=2.0时，加入0.1mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导过氧化氢酶表达，24小时后收集菌体。取1.5毫升菌液，离心并倒掉上清液，加入150微升之50mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)于菌体中，再加入150微升的2倍电泳蛋白染料(其配方为0.1M二硫苏糖醇、20％SDS、0.08M Tris-Cl,(pH6.8)、15％甘油及0.06％溴酚蓝)，混合后于摄氏95度下加热5分钟再以12000rpm离心5分钟，取上层液20微升以12％聚乙酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分析菌体总蛋白。分析结果如图9所示，由左至右分别为pET15b,pET15b/kat19,pET20b,pET20b/kat19,pET20b/kat TG,pET20b/HP11转化BL2.1(DE3)菌株后所表达过氧化氢酶的情形。由图9结果可知过氧化氢酶之量约占菌体总蛋白的15～50％，亦即这些含过氧化氢酶基因表达载体的宿主细胞皆可生产大量的过氧化氢酶。实施例6枯草芽孢杆菌过氧化氢酶之纯化将pET20b/kat19表达质粒转化的BL21(DE3)菌株接种于100毫升LB/Amp培养液中，于摄氏37度下震荡培养至O.D.600=2.0。加入0.1mM IPTG诱导24小时，离心后倒掉培养液，以10毫升，pH6.4的50mM磷酸钠缓冲液悬浮菌体。再以超声波震荡破碎菌体，以12000rpm离心15分钟，沉淀菌体碎片再取出上清液后，于摄氏4度下加入等量丙酮于菌胞液中，混合30分钟，再倒掉上清液，以10毫升的pH6.4的50mM磷酸钠缓冲液溶解沉淀物，静置于摄氏4度中12小时，再以5000rpm离心5分钟，取出上层液而完成纯化。
另外，将含pET15b/kat1 9,pET20b/katTG,pET20b/katHP11表达质粒的BL(DE3)菌体，接种子100毫升LB/A mp培养液中，于摄氏37度下震荡培养到O.D.600=2.0时，加入0.1mMIPTG后继续培养24小时，离心，倒掉培养液，加入20毫升I MAC-5(20mM Tris HCl(pH7.9),0.5M NaCl,10％甘油及5mM咪唑)悬浮菌体后，再以超声波震荡破碎菌体，离心，沉淀菌体碎片，取出上层液，以2.5毫升的组氨酸结合亲合层析剂(His-Bind resin,Novogen公司)纯化过氧化氢酶，其纯化步骤完全依据Novogen公司所建议步骤(pE T His T ogTMSystemProtocols,Novogen公司)。
蛋白质及活性测量方法如下蛋白质量的测定是以牛血清白蛋白(Bovineserum albumin)为标准品，用Bio-RAD公司出品的蛋白质定量试剂及方法测定。过氧化氢酶活性测定是在摄氏25度pH7.0的50mM磷酸钠缓冲液中，以UV240nm测量溶液中过氧化氢被过氧化氢酶分解的速率，缓冲液中过氧化氢的起始浓度为20mM，测量时距则为20秒。每单位活性(U)定义为每分钟分解1微摩尔的过氧化氢。
依上述方法测定所纯化各种过氧化氢酶的量及活性，并各取5微克以12％聚乙酰胺凝胶电泳分析其纯度，结果如图10所示，由左而右依次为蛋白质标准品，pET15b/kat19,pET20b/kat19,pET20b/kat TG,pET20b/kat HP11表达质粒所表达的过氧化氢酶，其纯度皆达95％。这些过氧化氢酶之比活性如下表达质粒比活性(U/微克)pET15b/kat19 18-22pET20b/kat19 18-22pET20b/katTG 30-40pET20b/katHP1110-14由上表可知，本发明所制备的各种过氧化氢酶皆具有良好活性，且其比活性皆较市售之黑曲霉过氧化氢酶为佳(依Merck公司之目录，黑曲霉过氧化氢酶约为5U/微克；而依SIGMA公司之目录，黑曲霉过氧化氢酶则约为4-8U/微克。)实施例7分解隐形眼镜消毒水中所含过氧化氢之功效一般市售的隐形眼镜消毒液成分含有3％(w/v)过氧化氢溶液，其消毒步骤是先将隐形眼镜浸置于10毫升3％(w/v)过氧化氢水溶液中消毒约20分钟后，将隐形眼镜由过氧化氢水溶液中取出并放置于10毫升含过氧化氢酶的水溶液中，或将过氧化氢酶加入过氧化氢水溶液中，约10至20分钟后取出隐形眼镜并以生理盐水溶液润洗后就可配戴。为测试本发明过氧化氢酶分解隐形眼镜消毒水中过氧化氢之效力，将本发明方法所制备的各种枯草芽孢杆菌过氧化氢酶各50微克加入3％(w/v)过氧化氢水溶液中，发现仅需5分钟就可有效分解其过氧化氢至低于0.02％(w/v)。其功效显较市售者为佳。实施例8本发明的固体组合物制备-层状锭剂，其具有一核心体，外覆以-延迟释放层。该层状锭剂的组成如下核心体氯化钠89.4毫克磷酸氢二钠(无水) 12.5毫克磷酸(无水)二氢钠单水合物 0.87毫克聚乙二醇(分子量约3350)1.05毫克冻干的本发明过氧化氢酶7020国际单位涂覆层羟丙基甲基纤维素 8毫克实施例9本发明的溶液组合物制备二单位剂量(10毫升)的本发明组合物，其组成如下氯化钠0.85％磷酸氢二钠(七水合物) 0.402％磷酸二氢钠单水合物0.091％伸乙二胺四乙酸二钠0.100％液体的本发明过氧化氢酶(1)260国际单位/毫升纯水 适量(1)液体过氧化氢酶中含35-40％(重量比)的甘油及10％乙醇。
权利要求
1．一种过氧化氢酶基因，其具有如下的核苷酸序列10 20 30 40 50 60ATGAGTTCAA ATAAACTGAC AACTAGCTGG GGAGCACCTG TTGGCGATAA CCAAAACTCG70 80 90100110120ATAACGGCCG GCAATCCTGG CCCGACATTA ATCCAAGACG TACATCTTAT CGAAAAATTA130140150160170180GCACACTTCA ATAGAGAACG TGTCCCAGAA CGTGTTGTCC ATGCGAAAGG CGCTGGTGCG190200210220230240CACGGCTATT TCGAAGTAAC AAACGATATG TCGAAATACA CAAAAGCGAA AGTGTTTAAC250260270280290300GGTGTTGGCA AACGCACGCC TGTATTCGTC CGCTTCTCTA CTGTCGCCGG TGAATTGGGA310320330340350360TCTGCGGATA CAGTCCGCGA CCCGCGCGGT TTTGCCGTCA AATTTTATAC CGAAGAAGGA370380390400410420AACTATGACA TCGTTGGCAA CAACACACCG ATTTTCTTCA TTCGTGATGC GATTAAATTC430440450460470480TCGGATTTTA TCCATACACA AAAACGCGAC CCGCGCACCC ATTTGATTTA TCCGACAGCA490500510520530540ATGTGGGATT TCTTGTCTTT ATCTCCGGAA TCTTTGCACC AAGTCACTTA TTTATTCGGG550560570580590600GATCGCGGCA TCCCATTGAC ATACCGCCAT ATGAACGGAT ACGGAAGCCA TACATTCAAA610620630640650660TGGGTGAATG AAAAAGGCGA AGCGGTATGG GTAAAATACC ACTTTAAAAC AAACCAAGGC670680690700710720GTGAAAAACA TGGATCCGGA ACTAGCGGTT AAAATCGCCG GAGAAAATCC GGATTACCAT730740750760770780ACGGAAGATT TATATAACGC CATCGAAAAA GGCGACTATC CATCTTGGAC ATTATATGTG790800810820830840CAAATTATGC CGTTAGAAGA CGCAAAAACA TACCGTTTCA ATCCATTTGA TGTCACAAAA850860870880890900GTTTGGTCAC ATAAAGATTA TCCGTTAATT GAAGTCGGCC GTATGGTATT AAACCGCAAT910920930940950960CCAGAAAATT ATTTTGCCGA AGTCGAACAA GCGACATTCT CTCCTGGAAA CCTTGTTCCT970980990 1000 1010 1020GGCGTTGAAC CATCGCCGGA TAAAATCTTG CAAGCCCGTT TGTTCGCTTA TGCGGATGCG1030 1040 1050 1060 1070 1080CACCGTTACC GCGTCGGCGT GAACCATAAC TTGCTTCCGA TCAACCGCCC GCGCGTGGAA1090 1100 1110 1120 1130 1140GTAAACAATT ATCAACGTGA CGGCTTCATG CGCTTTGACA ATAATGGCGG CGGTTCGGTC1150 1160 1170 1180 1190 1200AACTACGAAC CAAACAGCTT CGGCGGACCG ACAGAAGTGC CAGAACATAA AACGACCCCA1210 1220 1230 1240 1250 1260TTCCCGGTAT CCGGCGTGGC AGAAAGCGTG CCATATGACG ACGATGATCA TTATACGCAA1270 1290 1290 1300 1310 1320GCAGGCGACT TATACCGTCT CATGAGCGAA GAAGAAAAAG CGCGCCTTGT GAAAAACATT1330 1340 1350 1360 1370 1380GTCGAATCAT TGAAACAAGT AACAAAAGAA GAAATTAAAC TTCGCCAAAT CCGCCACTTC1390 1400 1410 1420 1430 1440TACAAAGCAG ACCCTGACTA CGGCCGCCGC GTTGCCGAAG GTCTTGGATT GCCGATTAAA1450 1460 1470 1480 1490 1500AAAGATTCT. .......... .......... .......... .......... ..........及其简并序列。
2．一种过氧化氢酶，其具有如下的氨基酸序列10 20 30 40 50 60MSSNKLTTSW GAPVGDNQNS ITAGNPGPTL IQDVHLIEKL AHFNRERVPE RVVHAKGAGA70 80 90100110120HGYFEVTNDM SKYTKAKVFN GVGKRTPVFV RFSTVAGELG SADTVRDPRG FAVKFYTEEG130140150160170180NYDIVGNNTP IFFIRDAIKF SDFIHTQKRD PRTHLIYPTA MWDFLSLSPE SLHQVTYLFG190200210220230240DRGIPLTYRH MNGYGSHTFK WVNEKGEAVW VKYHFKTNQG VKNMDPELAV KIAGENPKYH250250270280290300TEDLYNAIEK GDYPSWTLYV QIMRLEDAKT YRFNPFDVTK VWSHKDYPLI EVGRMVLNRN310320330340350360PENYFAEVEQ ATFSPGNLVP GVEPSPDKIL QARLFAYADA HRYRVGVNHN LLPLNRPRVE370380390400410420VNNYQRDGFM RFDNNGGGSV NYEPNSFGGP TEVPEHKTTP FPVSGVAESV PYDDDDHYTQ430440450460470480AGDLYRLMSE EEKARLVKNI VESLKQVTKE EIKLRQIRHF YKADPDYGRR VAEGLGLPIK490500510520530540KDS....... .......... .......... .......... .......... ..........及其功能性片段。
3．一种利用基因工程技术制备微生物来源的过氧化氢酶的方法，其包含(a)将可编码微生物过氧化氢酶的基因嵌入含适当转录启动子的表达载体中以构建重组质粒；(b)将该重组质粒转化到适当的宿主细胞中；(c)于适合该转化细胞表达过氧化氢酶基因的条件下培养该转化细胞；及(d)纯化所表达的过氧化氢酶蛋白质。
4．根据权利要求3所述的方法，其中该微生物是细菌。
5．根据权利要求4所述的方法，其中该细菌为枯草芽孢杆菌。
6．根据权利要求5所述的方法，其中该枯草芽孢杆菌为CCRC910064。
7．根据权利要求4所述的方法，其中该细菌为耐热性芽孢杆菌(Bacillus thermoglucosdasius)。
8．根据权利要求7所述的方法，其中该耐热性芽孢杆菌为CCRC14687。
9．根据权利要求7所述的方法，其中所用的耐热性芽孢杆菌基因为根据权利要求1所述的基因。
10．根据权利要求4所述的方法，其中该细菌是大肠杆菌。
11．根据权利要求10所述的方法，其中该大肠杆菌为大肠杆菌DH5α。
12．根据权利要求11所述的方法，其中该大肠杆菌DH5α为CCRC51731。
13．根据权利要求3所述的方法，其中该宿主细胞选自细菌、酵母、哺乳动物细胞及昆虫细胞。
14．根据权利要求13所述的方法，其中该宿主细胞为细菌。
15．根据权利要求14所述的方法，其中该宿主细胞为大肠杆菌。
16．根据权利要求3所述的方法，其中是以组氨酸亲合层析法或丙酮沉淀法将所表达的过氧化氢酶蛋白质予以纯化。
17．一种表达微生物来源的过氧化氢酶的重组质粒，此重组质粒是利用基因工程技术将微生物来源的过氧化氢酶基因嵌入表达载体中。
18．根据权利要求17所述的重组质粒，其中该微生物是细菌。
19．根据权利要求18所述的重组质粒，其中该细菌是枯草芽孢杆菌。
20．根据权利要求19所述的重组质粒，其中该枯草芽孢杆菌为CCRC910064。
21．根据权利要求18所述的重组质粒，其中该细菌是耐热性芽孢杆菌。
22．根据权利要求21所述的重组质粒，其中该耐热性芽孢杆菌为CCRC14687。
23．根据权利要求18所述的重组质粒，其中该细菌是大肠杆菌。
24．根据权利要求23所述的重组质粒，其中该大肠杆菌为大肠杆菌DH5α。
25．根据权利要求24所述的重组质粒，其中该大肠杆菌DH5α为CCRC51731。
26．根据权利要求17所述的重组质粒，其中该过氧化氢酶基因为根据权利要求1的基因。
27．根据权利要求17所述的重组质粒，其中表达载体是选自细菌、酵母、哺乳动物细胞及昆虫细胞表达系统的表达载体。
28．根据权利要求27所述的重组质粒，其中表达载体为细菌表达系统的表达载体。
29．根据权利要求28所述的重组质粒，其中表达载体为大肠杆菌表达系统的表达载体。
30．根据权利要求17所述的重组质粒，其是选自pET20b/kat19(ATCC209467)、pET15b/kat19(ATCC209469)、pET20b/katTG(ATCC209468)及pET20b/katHP11(ATCC209470)。
31．一种表达微生物来源过氧化氢酶的转化细胞，其是经根据权利要求17-30项中任一项的重组质粒所转化的宿主细胞。
32．根据权利要求31的转化细胞，其中该宿主细胞选自细菌、酵母、哺乳动物细胞及昆虫细胞。
33．根据权利要求32的转化细胞，其中该宿主细胞是细菌。
34．根据权利要求33的转化细胞，其中该宿主细胞是为大肠杆菌。
35．根据权利要求34的转化细胞，其中该大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
36．根据权利要求35的转化细胞，其中该大肠杆菌35BL21(DE3)经选自pET20b/kat19(ATCC209467)、pET15b/kat19(ATCC209469)、pET20b/katTG(ATCC209468)及pET20b/katHP11(ATCC209470)重组质粒所转化。
37．一种用于分解隐形眼镜上残余消毒液中过氧化氢的组合物，其包含有效量的根据权利要求2的过氧化氢酶。
38．根据权利要求37的组合物，其是呈溶液或固体状。
全文摘要
本发明提供了一种新的过氧化氢酶,其克隆自耐热性芽孢杆菌(Bacillus thermoglucosidasius)。本发明还提供了一种制备高产量过氧化氢酶的方法,其是利用基因工程技术用克隆自微生物的过氧化氢酶基因构建出其表达质粒及转化细胞而获得其表达产物。本发明亦包括此方法中所构建的新的重组质料及转化细胞。此外,本发明亦提供一种用于分解隐形眼镜上残余消毒药水中过氧化氢的组合物,其包含本发明的新的过氧化氢酶。
文档编号G02C7/04GK1219588SQ9712038
公开日1999年6月16日 申请日期1997年12月11日 优先权日1997年12月11日
发明者张立言, 黄清龙, 骆正凯 申请人:财团法人生物技术开发中心