专利名称：贴壁细胞扫描电镜载体及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种贴壁细胞扫描电镜载体及制备方法，尤其是一种操作简单、成本低、避免细胞形态变化、保证实验效果的贴壁细胞扫描电镜载体及制备方法。
背景技术：
目前，在医学领域，用扫描电镜(电子显微镜)观察贴壁细胞的表面形貌已非常普遍。由于扫描电镜是利用细聚焦电子束在样品表面扫描时激发出来的各种物理信号来调制成像的，因此必须将贴壁细胞制备成可供扫描电镜观察的载体，即贴壁细胞扫描电镜载体。现有贴壁细胞扫描电镜载体大多是以玻璃载玻片为培养板，其制备方法基本上是将玻璃载玻片经紫外线灭菌、多聚赖氨酸包被后放入细胞培养皿中，进行细胞培养。当细胞培养至所需密度后，向培养皿中加入缓冲液对细胞进行清洗，然后再用PH7.2 1.4，浓度为2.5%的戊二醛固定细胞，再次对细胞进行清洗之后，用不同浓度梯度的乙醇对细胞脱水、干燥及抽真空处理。将覆有细胞的玻璃载玻片取出，并通过导电胶层将玻璃载玻片固定在扫描电镜样品托上，从导电胶层侧面引出一条导电条，将导电条的另一端置于细胞面上，用离子溅射镀膜仪镀导电层，使导电条的另一端与导电层固定相接。存在如下问题:
1.由于玻璃载玻片的细胞贴附性差，为提高细胞贴附性，培养之前必须对载波片进行包被处理，费时费力；
2.玻璃载玻片经过多次脱水及干燥处理后脆性增加，易断裂，导致细胞形态的变化，尤其是可导致具有较长树突的细胞树突断裂；同时细胞表面还会因脂类析出而覆盖一层厚厚的被膜，使贴壁细胞的轮廓隐约显现，严重时致使贴壁细胞皱缩、塌陷，所有现象均会影响实验结果；
3.每次均需将覆有细胞层的玻璃载玻片从细胞培养皿中取出，因玻璃载波片与培养皿底面的贴合力大，故取出载波片较为艰难,容易在细胞面上产生划痕；
4.难以区分细胞面与玻璃载玻片底面，有时会出现将细胞面朝下的玻璃载玻片固定在样品托上的现象。TC 表面细胞培养皿(Corning tissue-culture treated culture dishes)是现有的细胞培养器皿，是用透明的、具有一定韧性德纯净聚苯乙烯制造而成，内表面共价结合水凝胶层，具有亲水性和电荷中性，具有表面湿润的持久性和细胞吸附的稳定性，作为专用细胞培养器具，对细胞有很好的亲和性。然而，迄今为止并没有关于用TC表面细胞培养皿直接制备贴壁细胞扫描电镜载体的相关报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种尤其是一种操作简单、成本低、避免细胞形态变化、保证实验效果的贴壁细胞扫描电镜载体及制备方法。本发明的技术解决方案是:一种贴壁细胞扫描电镜载体，有扫描电镜样品托，在扫描电镜样品托上通过导电胶层固定有TC表面细胞培养皿的底板，在TC表面细胞培养皿的底板上覆有细胞层，细胞层上有导电膜，导电条跨接导电膜与导电胶层。一种所述贴壁细胞扫描电镜载体的制备方法，其特征在于依次按如下步骤进行:
a.将细胞在TC表面细胞培养皿中培养至所需密度；
b.用pH7.2 1.4、浓度为2.5%的戊二醛固定细胞；
c.用0.lmol/ L的PBS缓冲液清洗细胞3次，再用0.1mol /L的PBS缓冲液浸泡细胞12 15小时；
d.用IXPBS缓冲液清洗细胞I次；
e.依浓度梯度从低到高向细胞中加入叔丁醇，每加入一次叔丁醇，轻柔吹打3飞次，静置10分钟，IXPBS缓冲液清洗细胞I次，直至最后一次加入叔丁醇；当最后一次加入叔丁醇后直接在液氮环境下使叔丁醇结晶；所述浓度梯度为10%、25%、50%、60%、70%、80%、90%、100% ；
f.将TC表面细胞培养皿置入真空机里抽真空；
g.将TC表面细胞培养皿侧壁剪去，并将覆有细胞层的培养皿的底板剪至电镜观察所需的大小及形状并通过导电胶层将培养皿的底板固定在扫描电镜样品托上，从导电胶层侧面引出一条导电条；
h.将导电条的另一端置于细胞层上，用离子溅射镀膜仪镀导电层，使导电条的另一端与导电层固定相接。本发明是直接用TC表面细胞培养皿培养细胞并以覆有细胞层的TC表面细胞培养皿的底板制备贴壁细胞扫描电镜载体，具有简单、快捷、方便等优点，具体如下:
1.由于TC表面细胞培养皿对细胞有很好的亲和性，因此无需进行包被处理，操作简单，省时省力；
2.TC表面细胞培养皿具有一定韧性，虽经过多次脱水及干燥处理也不易断裂，避免因断裂而导致细胞形态变化，保证实验效果；
3.以叔丁醇替代乙醇做脱水剂，不仅具有更好的脱水效果，而且叔丁醇可在液氮环境下形成结晶，以最大限度保持细胞的性状，避免细胞形态在抽真空状态下发生变化；
4.克服了将覆有细胞层的玻璃载玻片从细胞培养皿中取出所存在的技术缺陷；
5.由于最终是将剪去TC表面细胞培养皿侧壁且覆有细胞的的底板固定在样品托上，细胞面便一目了然，不会出现将细胞面朝下固定在样品托上的现象。
图1是本发明实施例的结构示意图。
具体实施例方式依次按如下步骤进行:
a.将细胞在35mmTC表面细胞培养皿中培养至所需密度；
b.用pH7.2 1.4、浓度为2.5%的戊二醛固定细胞；
c.用0.lmol/ L的PBS缓冲液清洗细胞3次，再用0.1mol /L的PBS缓冲液浸泡细胞12 15小时；
d.用IXPBS缓冲液清洗细胞I次； e.依浓度梯度从低到高向细胞中加入叔丁醇，每加入一次叔丁醇，轻柔吹打:T5次，静置10分钟，IXPBS缓冲液清洗细胞I次,直至最后一次加入叔丁醇；当最后一次加入叔丁醇后就无需吹打、静置，而是直接在液氮环境下使叔丁醇结晶；所述叔丁醇的浓度梯度为 10%、25%、50%、60%、70%、80%、90%、100% ；
f.将TC表面细胞培养皿置入真空机里抽真空，抽出结晶的叔丁醇等；
g.将TC表面细胞培养皿侧壁剪去，并将覆有细胞层的培养皿的底板剪至电镜观察所需的大小及形状并通过导电胶层将培养皿底板(细胞层朝上)固定在扫描电镜样品托上，从导电胶层侧面引出一条导电条；
h.将导电条的另一端置于细胞层上，用离子溅射镀膜仪镀导电层，使导电条的另一端与导电层固定相接。 所生产的贴壁细胞扫描电镜载体如图1所示，有扫描电镜样品托1，在扫描电镜样品托I上通过导电胶层2固定有TC表面细胞培养皿的底板3，在TC表面细胞培养皿的底板3上覆有细胞层4，细胞层4上有导电膜5，导电条6跨接于导电膜5与导电胶层2。
权利要求
1.一种贴壁细胞扫描电镜载体,有扫描电镜样品托(I),其特征在于:在扫描电镜样品托(I)上通过导电胶层(2 )固定有TC表面细胞培养皿的底板(3 )，在TC表面细胞培养皿的底板(3)上覆有细胞层(4)，细胞层(4)上有导电膜(5)，导电条(6)跨接导电膜(5)与导电胶层(2)。
2.根据权利要求1所述贴壁细胞扫描电镜载体的制备方法，其特征在于依次按如下步骤进行: a.将细胞在TC表面细胞培养皿中培养至所需密度； b.用pH7.2 .4、浓度为2.5%的戊二醛固定细胞； c.用0.lmol/ L的PBS缓冲液清洗细胞3次，再用0.1mol /L的PBS缓冲液浸泡细胞12 15小时； d.用IXPBS缓冲液清洗细胞I次； e.依浓度梯度从低到高向细胞中加入叔丁醇，每加入一次叔丁醇，轻柔吹打3飞次，静置10分钟，IXPBS缓冲液清洗细胞I次，直至最后一次加入叔丁醇；当最后一次加入叔丁醇后直接在液氮环境下使叔丁醇结晶；所述浓度梯度为10%、25%、50%、60%、70%、80%、90%、100% ； f.将TC表面细胞培养皿置入真空机里抽真空； g.将TC表面细胞培养皿侧壁剪去，并将覆有细胞层的培养皿的底板剪至电镜观察所需的大小及形状并通过导电胶层将培养皿的底板固定在扫描电镜样品托上，从导电胶层侧面引出一条导电条； h.将导电条的另一端 置于细胞层上，用离子溅射镀膜仪镀导电层，使导电条的另一端与导电层固定相接。
全文摘要
本发明公开一种贴壁细胞扫描电镜载体，有扫描电镜样品托(1)，在扫描电镜样品托(1)上通过导电胶层(2)固定有TC表面细胞培养皿的底板(3)，在TC表面细胞培养皿的底板(3)上覆有细胞层(4)，细胞层(4)上有导电膜(5)，导电条(6)跨接于导电膜(5)与导电胶层(2)。其制备方法是直接用TC表面细胞培养皿培养细胞，以以叔丁醇替代乙醇做脱水剂，最终以覆有细胞层的TC表面细胞培养皿的底板制备贴壁细胞扫描电镜载体，具有简单、快捷、方便等优点。
文档编号H01J37/20GK103151231SQ20131003052
公开日2013年6月12日 申请日期2013年1月28日 优先权日2013年1月28日
发明者宋智琦, 李乃浩 申请人:大连医科大学附属第一医院