专利名称：一种提高原核生物转录组高通量测序效率的方法
技术领域：
本发明涉及基因组测序，特别是高通量基因组测序领域，更特别地本发明的方法适用于原核生物转录组高通量测序方法。
背景技术：
原核生物是生物系统中的重要组成部分，包括细菌、蓝藻、立克次氏体和衣原体等多个门类。原核生物的转录组研究对医药、食品、环境和疾病等许多领域具有重要意义。但是，在原核生物中，mRNA(messnger RNA，信使RNA)仅占其总RNA(total RNA)的2%-5% 左右，含量极低，且绝大多数原核生物mRNA都不具有3’端的poly㈧结构，这就使得mRNA 的分离有较大困难。因此，按照以真核生物mRNA特点而建立的转录组文库构建方法进行solexa高通量测序难以获得理想的结果(Arnoud H. M. van Vliet. Next generation sequencing of microbial transcriptomes :challenges and opportunities. Federation of European Microbiological Societies, Microbiol Lett 302(2010) 1-7)。有石if究表明，利用琼脂糖电泳分离细菌总RNA并切胶回收的方法可以提高mRNA在测序数据中的比例 (Ken C. McGrath,Skye R. Thomas-Hall,Chu Ting Cheng,et al. Isolation and analysis of mRNA from environmental microbial communities. Journal of Microbiological Methods, 2008 (75) :172-176)。但该方法操作复杂，对实验环境要求较高，且rRNA(也称为ribosome RNA，核糖体RNA)的去除效率并不理想。为提高原核生物转录组高通量测序的效率，有研究人员利用rRNA的已知序列设计杂交探针，使探针与rRNA分子结合， 再利用磁珠吸附将rRNA去除。D. R. Yoder-Himes等采用该方法研究了石竹伯克氏菌 (B. cenocepacia)在不同环境下的转录组，测序结果表明经过探针杂交处理后的样品mRNA 比例平均约为12.6%，rRNA污染率仍较高，对测序质量有明显影响(D. R. Yoder-Himes， P. S. G. Chain,Y. Zhu,et al. Mapping the Burkholderia cenocepacia niche response via high-throughput sequencing. PNAS, 2009, vol 106 :3976-3981) 。 D. R. Yoder-Himes 的± 述实验的具体数据见图1。
发明内容
1.由于原核生物的16s和23s rRNA有许多相对保守的区域，因此可以根据这些保守区域设计特定的探针。针对16s RNA和23s RNA保守区设计探针的方法是本领域技术人员已知的方法，例如可以参考如下如下实验手册Terry J. Smith, Majella Maher, Frank Gannon and Michael T. Dawson. Diagnostic Bacteriology Protocols-Development of Bacterial SpeciesSpecific DNA Probes Based on Ribosomal RNA Genes Using PCR. Methods in Molecular Biology,1995, Volume 46,247-256, DOI 10. 1385/0-89603-297-3 :247 2.使用所述探针结合rRNA，再通过带有与探针互补配对序列的磁珠去除rRNA-探针复合物，达到富集mRNA的目的。原理见图2。
3.由于探针杂交的效率受多种因素的影响，因此优化反应条件对提高rRNA去除效率会有一定帮助。在本发明新的处理方法中，探针与rRNA变性的温度由70°C提高至 72°C，结合时间由15min延长至30min。提高变性温度可更好地打开rRNA 二级结构，提高探针结合效率，延长反应时间则能够使结合更充分，有利于rRNA的去除。4.使用DSN酶(也称为Duplex-Specific Nuclease，双链特异性核酸酶)处理构建完成的文库，可进一步提高mRNA在测序数据中的比例。DSN能够特异性地降解双链DNA 和DNA-RNA杂合链中的DNA。通过控制退火过程和DSN酶处理，可以降低丰度较高的rRNA 在文库中的含量，从而提高mRNA的比例。使用本发明的改进后的探针杂交方法去除rRNA后对样品进行转录组测序，结果表明mRNA比例相对未处理的对照组有明显提高，与琼脂糖凝胶电泳回收法相比，mRNA比例也提高了 2 4倍以上。与文献报道的数据相比，改进的方法去除效率更高，效果更稳定。 实验数据表明，DSN酶处理后的文库与处理前相比，mRNA比例提高3 5倍。对于高通量测序而言，有效数据比例每提高一倍，获得可靠结果所需要的总测序量就可以降低一半，因此该方法可极大的降低原核生物转录组solexa测序的成本。
图1.利用杂交探针去除rRNA的B. cenocepacia转录组测序结果 (D. R. Yoder-Himes, P. S. G. Chain, Y. Zhu,et al. Mapping the Burkholderia cenocepacia niche response via high-throughput sequencing. PNAS,2009, voll06 :3976-3981)。 D. R. Yoder-Himes等采用探针杂交的方法去除rRNA，对8个B. cenocepacia转录组样本进行高通量测序，测序结果mRNA比例为2. 7% 54. 2%，平均值为12. 6%。这一结果表明，采用未经优化的杂交探针法去除rRNA效率不稳定，可重复性较差。图2.利用杂交探针与去除原核生物rRNA的原理图3.总RNA与本发明的探针杂交法处理后的RNA Agilent Bioanalyzer 2100检测结果。a为总RNA，b为经过处理后的RNA。结果表明经过本发明的探针杂交法处理后， 2100检测峰图上原有的16s、23s rRNA峰消失了，说明该方法有效去除了大部分rRNA。图4.大肠杆菌(E. coli)转录组Solexa测序结果。E. coli 1-3为经本发明的改进的探针杂交法处理后建库的三个不同样品，切胶组为切胶法去除rRNA后建库的样品，对照组为直接建库的总RNA。本发明的探针杂交处理后的三个样品转录组测序结果mRNA比例分别为27. 3 %、35. 5 %、48. 3 %，平均值为37. O %，与切胶回收法(切胶组)相比mRNA比例提高了 3倍左右，与总RNA(对照组)相比mRNA比例提高30倍左右。图5.大肠杆菌(E. coli)转录组文库经DSN处理前后测序结果。处理前的文库 (E.coli l)mRNA比例为27. 3%，经过DSN酶处理后，mRNA比例提高至61. 33%，约提高了 2. 25倍。说明DSN处理对细菌转录组测序文库的构建具有明显左右，可提高mRNA比例，降低测序成本。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
除非另有定义，否则本文中所使用的科学和技术术语具有本领域技术人员通常理解的含义。为了更好的理解本发明，特别提供了下列术语的定义。如本文中所使用的，术语“杂交”是指相互间具有互补序列的两个单链核酸分子在一定条件下(适宜的温度及离子强度等)按碱基互补配对原则退火形成双链核酸的过程。 核酸杂交可以在DNA-DNA之间，也可在DNA-RNA或RNA-RNA之间进行，只要它们之间存在互补序列，可以进行碱基配对。一般而言，杂交的双方是待测核酸分子和已知核酸分子。在杂交体系中已知的核酸分子称作探针(probe)。核酸杂交包括固-液相杂交和液相杂交。液相杂交是在溶液中进行的杂交反应，其是指待测核酸分子与已知核酸分子(探针)在溶液中退火形成杂交复合物。通常，探针是经标记的，从而在杂交反应结束后，通过利用探针上的标记物，可以分离和检测杂交后的双链。可用于标记探针的标记物在本领域内是已知的，包括但不限于， 放射性同位素或核素，生物素，吖啶翁酯(acridinium ester)，polyA等。根据使用的标记物，相应的核酸分离和检测方法在本领域内也是已知的，包括但不限于，羟基磷灰石(HAP) 法和亲和吸附法。本发明一方面提供了一种提高原核生物转录组高通量测序效率的方法，所述方法的特征在于提供与原核生物的16s和23s rRNA的保守区域杂交的经标记的探针，使用所述探针结合rRNA，利用与所述标记特异性结合的分子实体结合探针-rRNA复合物，从而去除 rRNA-探针复合物而富集mRNA，其后将经处理的RNA用于构建文库。在本发明所述的方法中，所使用的探针是针对16s RNA和23sRNA保守区设计的探针，而针对16s RNA和23s RNA保守区设计探针的方法是本领域技术人员已知的方法。在本发明的一个具体实施方式
中，其中用于标记的标记物是polyA，所述分子实体为寡聚dT(01igo(dT))，例如寡聚dT磁珠。标记物polyA的长度可由本领域技术人员根据现有技术来确定，可以是5-30个“A”碱基，优选地10-20个“A”碱基，例如15、16、17、18或 19个“A”碱基。在本发明的一个具体实施方式
中，所述的方法使用的探针包括1.5'-CGTTTCACTTCTGAGTTCGGCATGGGATAAAAAAAAAAAAAAAAAAA--3
2.5'-CATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAA--3
3.5'-CACATCTGACTTAACAAACCGCCTGCGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA--3
4.5'-TTCCCACCATTACGTGCTGGCAACAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAA--3
5.5'-TGCGACTTTCCAGACGCTTCCACTAACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA--3
6.5'-CATTAGTCGGTTCGGTCCTCCAGTTAGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA--3
7.5'-TCAACATTAGTCGGTTCGGTCCTCCAGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA--3
8.5'-CATTCGCACTTCTGATACCTCCAGCAACAAAAAAAAAAAAAAAAAAA--3
9.5'-ATTCGCACTTCTGATACCTCCAGCAACCAAAAAAAAAAAAAAAAAAA--3
10. 5'-TCCGTCCTGTCGCGGGTAACCTGCATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-在本发明的一个具体实施方式
中，探针与rRNA杂交的温度是70_74°C，优选地是 720C ；杂交时间是25-35min，优选地是30min。在本发明的一个具体实施方式
中，用于构建文库的方法包括基于Illumina solexa，ABI SOLiD及Roche妨4测序平台的建库方法，优选地是基于illumina solexa测4/6页 序平台的建库方法。上述三种测序平台均为已经商业化的测序平台，其说明书中相应的都有提供RNA相关的建库流程，具体可参考商家的网站。 在本发明的一个具体实施方式
中，本发明所述的方法进一步包括使用DSN酶处理构建完成的文库的步骤。
本发明另一方提供了通过本文所述的方法构建的、用于测序的文库。 本发明进一步的方面提供了探针，其包括
1.5' -CGTTTCACTTCTGAGTTCGGCATGGGATAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'，
2.5 ‘ -CATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘，
3.5 ‘ -CACATCTGACTTAACAAACCGCCTGCGTAAAAA AAAAAAAAAAAAAA-3‘，
4.5 ‘ -TTCCCACCATTACGTGCTGGCAACAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘
5.5 ‘ -TGCGACTTTCCAGACGCTTCCACTAACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘
6.5 ‘ -CATTAGTCGGTTCGGTCCTCCAGTTAGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘
7.5 ‘ -TCAACATTAGTCGGTTCGGTCCTCCAGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘
8.5 ‘ -CATTCGCACTTCTGATACCTCCAGCAACAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘
9.5 ‘ -ATTCGCACTTCTGATACCTCCAGCAACCAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘
10.5' -TCCGTCCTGTCGCGGGTAACCTGCATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'所述探针的特征在于与原核生物的16s和23s rRNA的保守区域特异性结合。在本发明的一个具体实施方式
中，提供了所述的探针用于提高原核生物转录组高通量测序效率的方法的用途。在本发明的一个具体实施方式
中，提供了所述的探针构建的、用于测序的文库。本发明的进一步方面提供了试剂盒，其含有与原核生物的16s和23s rRNA的保守区域杂交的经标记的探针，以及能与探针特异性结合的分子实体。在本发明的一个具体实施方式
中，所述的试剂盒中用于标记的标记物是polyA，所述分子实体为寡聚dT(01igo(dT))，例如寡聚dT磁珠。在本发明的一个具体实施方式
中，所述的试剂盒中的探针包括1. 5' -CGTTTCACTTCTGAGTTCGGCATGGGATAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'2. 5 ‘ -CATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘3. 5 ‘ -CACATCTGACTTAACAAACCGCCTGCGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘4. 5 ‘ -TTCCCACCATTACGTGCTGGCAACAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘5. 5 ‘ -TGCGACTTTCCAGACGCTTCCACTAACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘6. 5 ‘ -CATTAGTCGGTTCGGTCCTCCAGTTAGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘7. 5 ‘ -TCAACATTAGTCGGTTCGGTCCTCCAGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘8. 5 ‘ -CATTCGCACTTCTGATACCTCCAGCAACAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘9. 5' -ATTCGCACTTCTGATACCTCCAGCAACCAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'10.5' -TCCGTCCTGTCGCGGGTAACCTGCATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'。在本发明的一个具体实施方式
中，提供了所述的试剂盒用于提高原核生物转录组高通量测序效率的方法的用途。在本发明的一个具体实施方式
中，提供了通过使用所述的试剂盒构建的、用于测
7CN 102533956 A
序的文库。实施例实施例1.大肠杆菌转录组solexa测序1. DNA 酶消化1)取IOyg总RNA(使用TRIzoKinvitrogen，美国)根据生产商说明书从大肠杆菌提取)样品至一个无RNA酶的1.5mL离心管(Axygen，美国)中，加入IyL DNA酶 (invitrogen，美国)，混勻，37°C反应10min，80°C加热5min终止反应；2)加入3倍体积的无水乙醇(sigma，美国)，混勻，_80°C静置30min，4°C高速离心 20min，吸去上清，加入ImL用DEPC水(Ambion，美国)配成的75%乙醇，洗涤沉淀一次，4°C 高速离心5min，弃上清，空气干燥去除残留的乙醇；
3)用10 μ LDEPC水溶解沉淀，_80°C保存。 2.将探针与rRNA杂交
1)取200μ L杂交缓冲液至无RNA酶的1. 5mL EP管(Axygen，美国)中；
2)加入15μ L DNA酶(invitrogen，美国)消化过的总RNA (不超过10 μ g)，混勻；
3)加入4μ L探针，混勻，短暂离心使混合液位于管底； 所使用的经PolyA标记的探针序列如下
1.5
2.5
3.5
4.5
5.5
6.5
7.5
8.5
9.5 10
5
-CGTTTCACTTCTGAGTTCGGCATGGGATAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3' -CATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3' -CACATCTGACTTAACAAACCGCCTGCGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3' -TTCCCACCATTACGTGCTGGCAACAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3' -TGCGACTTTCCAGACGCTTCCACTAACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3' -CATTAGTCGGTTCGGTCCTCCAGTTAGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3' -TCAACATTAGTCGGTTCGGTCCTCCAGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3' -CATTCGCACTTCTGATACCTCCAGCAACAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3' -ATTCGCACTTCTGATACCTCCAGCAACCAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3' -TCCGTCCTGTCGCGGGTAACCTGCATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'4)72°〇变性5111土11;5)37°〇结合30111土11。3.含寡聚dT的磁珠结合探针-rRNA复合物1)将洗脱液放于37°C温育IOmin备用；2)取 50μ L 的结合有寡聚 dT 的磁珠(Dynabeads Oligo (dT) 25，invitrogen, 61005)，加入由步骤2中得到的探针-rRNA反应液中，混勻，短暂离心，37°C温育30min ；3)将EP管放于磁力架(invitrogen，美国)上，静置2 ;3min，取上清液至收集管 (Collection Tube，Axygen，美国)中，冰上静置；4)用100 μ L预热的洗脱液洗磁珠，混勻后放于磁力架上静置2 3min，取上清液与收集管中的溶液合并；5)加入三倍体积的无水乙醇沉淀RNA，用适量RNase-free水溶解，_80°C保存备用。4.有步骤 3 得到的处理过的 RNA 经 Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent，美国)检测后，按照illumina solexa平台转录组测序建库方法(参考例如illumina mRNA-Seq Sample Preparation Guide)建库并在 illumina Hikq2000 测序仪上进行测序。同时分别采用切胶法(参考例如 Ken C. McGrath，Skye R. Thomas-Hal 1，et al. Isolation and analysis of mRNA from environmental microbial communities, Journal of Microbiological Methods. 75(2008)，172-176)去除rRNA后进行建库，以及进行直接建库(直接采用上文步骤4中采用的illumina solexa平台转录组测序建库方法) 作为比较。检测与数据分析结果见图3、图4，结果表明本发明的改进的探针杂交法可有效减少rRNA的含量，提高测序数据中的mRNA比例。实验数据表明处理后的样本mRNA比例相对未处理的对照组提高10-20倍左右，与琼脂糖凝胶电泳回收法相比，mRNA比例也提高了 2 4倍以上。实施例2使用DSN酶处理构建完成的文库使用实施例1中构建的文库进行如下步骤5.取步骤4构建完成的文库，分为两部分等量试样，其中一份进行DSN酶(双链特异性核酸酶，Evrogen，俄罗斯)处理，另一份做为对照。DSN酶处理的步骤为1)取4yL文库(cDNA)至1. 5mL离心管中，加入4 μ L杂交缓冲液和8 μ L超纯水， 混勻，短暂离心使溶液位于管底；2)98°C 加热 2min，68°C 孵育 4 7hr ；注意第3、4步的加液与混勻操作均需在恒温(68°C)下进行，不能将离心管拿出加热仪(ABI 9700 型 PCR 仪，Applied Biosystems，美国)。3)向离心管中加入20yL预热至68°C的DSN酶反应缓冲液，充分混勻，68°C孵育 IOmin ；4)向离心管中加入4μ L DSN酶溶液，充分混勻，68°C孵育25min ；5)向离心管中加入40 μ L终止缓冲液，充分混勻，68°C孵育5min，将离心管放于冰上静置5min，加入20 μ L超纯水，混勻，_20°C保存；6)取20 μ L DSN处理后的cDNA为模板进行PCR扩增(采用solexa测序引物)， 将扩增后的产物在illumina HiSeq2000测序仪上进行测序。同时将未经处理的文库以同样的方法在在illumina HiSeq2000测序仪上进行测序。处理前后的文库测序结果见图5。经杂交探针去除rRNA后建库的样品(E. colil) 测序结果mRNA比例约为27. 3%，进过进一步DSN处理并PCR扩增后(E. coli 1 DSN)再进行测序，mRNA比例约为61. 3%，提高2. 2倍左右。尽管本发明的具体实施方式
已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
权利要求
1.一种提高原核生物转录组高通量测序效率的方法，所述方法的特征在于提供与原核生物的16s和23s rRNA的保守区域杂交的经过标记的探针，使用所述探针结合rRNA，利用与所述标记特异性结合的分子实体结合探针-rRNA复合物，从而去除rRNA-探针复合物而富集mRNA，其后将经处理的RNA用于构建文库。
2.权利要求1所述的方法，其中所述用于标记的标记物是polyA，所述分子实体为寡聚 dT (Oligo (dT))，例如寡聚dT磁珠。
3.权利要求1所述的方法，其中所述的探针包括1.5'-CGTTTCACTTCTGAGTTCGGCATGGGATAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'，2.5 ‘-CATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘，3.5 ‘-CACATCTGACTTAACAAACCGCCTGCGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘，4.5 ‘-TTCCCACCATTACGTGCTGGCAACAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘，5.5 ‘-TGCGACTTTCCAGACGCTTCCACTAACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘，6.5 ‘-CATTAGTCGGTTCGGTCCTCCAGTTAGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘，7.5 ‘-TCAACATTAGTCGGTTCGGTCCTCCAGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘，8.5 ‘-CATTCGCACTTCTGATACCTCCAGCAACAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘，9.5 ‘-ATTCGCACTTCTGATACCTCCAGCAACCAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘，10.5' -TCCGTCCTGTCGCGGGTAACCTGCATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'。
4.权利要求1所述的方法，其中探针与rRNA杂交的温度是70-74°C，优选地是72°C； 杂交时间是25-35min，优选地是30min。
5.权利要求1所述的方法，其中用于构建文库的方法包括基于Illuminasolexa, ABI SOLiD及Roche妨4测序平台的建库方法，优选地是基于Illumina solexa测序平台的建库方法。
6.权利要求1所述的方法，其进一步包括使用DSN酶处理构建完成的文库的步骤。
7.通过权利要求1-6中任一项所述的方法构建的、用于测序的文库。
8.探针，其包括I.5'-CGTTTCACTTCTGAGTTCGGCATGGGATAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'，2.5 ‘ -CATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘，3.5 ‘ -CACATCTGACTTAACAAACCGCCTGCGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘，4.5 ‘ -TTCCCACCATTACGTGCTGGCAACAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘，5.5 ‘ -TGCGACTTTCCAGACGCTTCCACTAACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘，6.5 ‘ -CATTAGTCGGTTCGGTCCTCCAGTTAGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘，7.5 ‘ -TCAACATTAGTCGGTTCGGTCCTCCAGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘，8.5 ‘ -CATTCGCACTTCTGATACCTCCAGCAACAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘，9.5 ‘ -ATTCGCACTTCTGATACCTCCAGCAACCAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘，10.5' -TCCGTCCTGTCGCGGGTAACCTGCATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'； 所述探针的特征在于与原核生物的16s和23s rRNA的保守区域特异性结合。
9.权利要求8所述的探针用于提高原核生物转录组高通量测序效率的方法的用途。
10.通过使用权利要求8所述的探针构建的、用于测序的文库。
11.试剂盒，其含有与原核生物的16s和23srRNA的保守区域杂交的经标记的探针，以及能与探针特异性结合的分子实体。
12.权利要求11所述的试剂盒，其中所述用于标记的标记物是polyA，所述分子实体为寡聚dT (Oligo (dT))，例如寡聚dT磁珠。
13.权利要求11所述的试剂盒，其中所述的探针包括1.5'-CGTTTCACTTCTGAGTTCGGCATGGGATAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'，2.5 ‘-CATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘，3.5 ‘-CACATCTGACTTAACAAACCGCCTGCGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘，4.5 ‘-TTCCCACCATTACGTGCTGGCAACAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘，5.5 ‘-TGCGACTTTCCAGACGCTTCCACTAACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘，6.5 ‘-CATTAGTCGGTTCGGTCCTCCAGTTAGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘，7.5 ‘-TCAACATTAGTCGGTTCGGTCCTCCAGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘，8.5 ‘-CATTCGCACTTCTGATACCTCCAGCAACAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘，9.5 ‘-ATTCGCACTTCTGATACCTCCAGCAACCAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3‘，10.5' -TCCGTCCTGTCGCGGGTAACCTGCATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'。
14.权利要求11-13中任一项所述的试剂盒用于提高原核生物转录组高通量测序效率的方法的用途。
15.通过使用权利要求11-13中任一项所述的试剂盒构建的、用于测序的文库。
全文摘要
本发明提供了一种提高原核生物转录组高通量测序效率的方法。通过使用本发明的探针杂交方法去除rRNA后对样品进行转录组测序，mRNA比例与未处理的对照组以及现有技术相比有明显提高，效果更稳定。本发明的方法中还包括DSN酶处理后的文库，经该处理后mRNA比例进一步得到。对于高通量测序而言，有效数据比例每提高一倍，获得可靠结果所需要的总测序量就可以降低一半，因此该方法可极大的降低原核生物转录组solexa测序的成本。
文档编号C40B40/06GK102533956SQ20101060021
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月22日 优先权日2010年12月22日
发明者万成, 刘晓, 刘雪莉, 陈利 申请人:深圳华大基因研究院, 深圳华大基因科技有限公司