一种锗纳米团簇、其制备方法及其用途
【专利摘要】本发明涉及一种锗荧光团簇、在水溶液中锗荧光团簇的制备方法及其在生物成像中的应用。所述合成方法是以二氧化锗作为锗源，以生物小分子半胱氨酸作为保护剂，硼氢化钠作为还原剂制备单分子层保护的具有荧光性质的锗纳米团簇。本发明所用原料简单、易得，性质稳定，没有毒性；反应过程无需高温以及惰性气体的保护，简单易操作；获得的具有翠绿色或黄色荧光的锗量子点与之前报导的贵金属纳米团簇相比具有更高的荧光量子产率，团簇尺寸大约在1nm左右，具有很好的水溶性，无细胞毒性，能够很好地应用于生物细胞成像。
【专利说明】一种锗纳米团簇、其制备方法及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种锗纳米团簇、其制备方法及其用途，尤其涉及一种具有强荧光性质的锗纳米团簇、其制备方法及其在生物成像上的应用。
【背景技术】
[0002]第四主族的硅、锗作为间接带隙半导体材料，过去的几十年里在微电子领域得到很多的应用，但是由于在室温下荧光量子产率极低，在光学和光电子器件领域的应用一直受到局限。近年来随着纳米技术的飞速发展，半导体材料硅、锗的研究也取得了新的突破，当其处于纳米尺度时，由于量子限域效应，将转变成为直接带隙纳米材料，呈现出不同于传统硅锗材料的独特的物理化学性质。
[0003]作为纳米领域研究热点的硅、锗半导体量子点，表现出很强的荧光特性，与传统的荧光材料相比具有光稳定性强、荧光性质可调、荧光寿命长等优点。过去二十年中有很多的研究组对硅的量子点制备及其应用进行了深入的研究，与硅相比，锗量子点的研究工作则相对较少。但是我们知道，锗与硅相比具有更大的激子玻尔半径，表现出更强的量子限域效应，因此锗量子点近年来也逐渐开始引起人们的关注，但是我们看到关于锗的研究报道也只是局限在锗制备的微孔材料和锗量子点上，除了在物理学领域在理论上对于锗团簇的稳定性进行研究之外，用化学手段制备的锗团簇的报道几乎没有，而关于具有荧光性质的锗团簇的报道更是没有。
[0004]由于团簇处在原子与宏观物质的一个过渡衔接区域，它为物质的进化生长过程的研究提供了新的模型和支撑，在过去二十年中已经成为一大研究热点。尤其是金纳米团簇，由于量子限域效应，金团簇呈现出不连续的电子态，并且表现出类似于分子的性质，具有较强的荧光和光稳定性，也表现出独特的催化活性和磁学性质。金纳米团簇的合成方法也一度称为人们感兴趣的热点课题，金融超和曾晓成等课题组对于金纳米团簇的合成技术做了大量的工作，也在对金纳米团簇的结构进行了大量理论研究。关于金纳米团簇荧光形成的机制以及手性光学活性的来源也已经有大量的报道，报道中把金属团簇当做是一个超级分子，把金属团簇的突光机制归结于分子内部HOMO和LUMO之间的电子跃迁,而把金属团簇的手性光学活性则可归结于保护层分子的手性诱导和金属核心部位的金属原子的手性堆叠方式两个部分。目前报道的金属团簇集中在金、银、铜、钼这几种过渡金属元素，金属团簇不仅仅局限在单一金属的团簇，也有金、银杂化团簇的报导。
[0005]但是到目前为止，我们没有见到具有荧光性质的半导体金属团簇的报导。
[0006]与贵金属的纳米粒子在1-1OOnm之间只表现出等离子基元共振现象不同的是，半导体的量子点也会有很好的荧光性质，在我们的发明中首次观察到当半导体锗在尺寸小于Inm也就是以原子团簇状态存在时，也表现出很好的荧光活性，并且表现出比贵金属更高的荧光量子产率，我们的发明不仅提供一类新的荧光材料，也开辟了一个全新的研究领域。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种具有较强的荧光性质锗纳米团簇，及其制备方法，该方法所用材料简单、易得，合成过程简单、实用、可用于工业化大规模生产，获得的锗纳米团簇稳定、荧光量子产率高，并且在体外实验中表现出良好的生物细胞成像特性,可用于生物成像。
[0008]本发明所提供的锗纳米团簇的制备方法，包括如下步骤:
[0009](I)将锗源溶于碱溶液中制得锗源溶液；
[0010](2)将保护剂溶于水制得保护剂的水溶液；
[0011](3)将步骤(I)所得锗源溶液加入到步骤(2)保护剂的水溶液中；
[0012](4)将还原剂加入到步骤(3)所得溶液中；
[0013](5)加热步骤⑷的溶液，得到锗纳米团簇。
[0014]作为优选技术方案，本发明所述的制备方法，其中步骤(I)所述的锗源为二氧化锗或/和锗盐；优选为二氧化锗或/和偏锗酸钠；进一步优选为二氧化锗。
[0015]优选地，步骤(I)所述碱溶液为含碱金属的氢氧化物的溶液，优选为氢氧化钠或/和氢氧化钾；
[0016]优选地，步骤(2)所述保护剂为带有巯基的小分子，优选为半胱氨酸；
[0017]优选地，步骤(4)所述还原剂为具有还原能力的无机盐类，优选为硼氢化钠；
[0018]优选地，步骤(5)所述加热的温度为50_90°C，优选为60_80°C，进一步优选为65V -75，特别优选为70°C。
[0019]二氧化锗能够在超声作用下溶于氢氧化钠的水溶液；半胱氨酸是一种本身具有一定还原能力的生物小分子，经常在各种纳米材料的制备中作为保护剂；而硼氢化钠是一种具有很强的还原能力的还原剂，可以将锗由高价态还原至低价态。锗的生物毒性小，因此考虑将锗量子点应用于生物成像。
[0020]作为优选技术方案，本发明所述的制备方法，其中所述方法包括如下步骤:
[0021](I)在超声波辐射条件下，将锗源溶于碱溶液中，制备成锗源溶液，用酸溶液将锗源溶液的 pH 值调节至 6-9，例如为 6.1,6.5,6.7、7、7.4,7.5,7.8、8、8.2,8.5,8.6 等；
[0022](2)将保护剂加入到超纯水中，搅拌，溶解，得到保护剂的水溶液；
[0023](3)将步骤⑴的锗源溶液加入到步骤(2)保护剂的水溶液中；
[0024](4)将还原剂加至步骤(3)所得溶液中，搅拌，溶解；
[0025](5)将步骤(4)所得溶液加热下搅拌，继续加热反应得到锗纳米团簇；
[0026]任选进行(6)去除步骤(5)所得的锗纳米团簇水溶液中的无机盐，_50°C?-60°C的温度下冷冻干燥保存。
[0027]作为优选技术方案，本发明所述的制备方法，其中步骤(I)中所述超声波辐射采用超声清洗仪。对于超声功率没有特别的要求。
[0028]优选地,所述碱溶液为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液；优选所述碱溶液的浓度为
2-10mg/ml,例如为 3mg/ml、4.5mg/ml、5mg/ml、6.3mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、9.lmg/ml,9.5mg/ml等。碱溶液的浓度对于锗源溶液的制备过程具有重要影响，碱溶液浓度过低则锗源不能充分溶解其中，碱溶液浓度过高则锗源会在其中形成乳白色不溶物，适宜浓度的碱溶液应当既能够将锗源充分溶解其中又不会形成不溶物，因此本发明选择碱溶液的浓度为2-10mg/ml,进一步优选为5_8mg/ml ;特别优选为6mg/ml。
[0029]优选地，所述锗源为二氧化锗或/和锗盐；优选为二氧化锗或/和偏锗酸钠；进一步优选为二氧化锗；
[0030]优选地，所述锗源溶液中锗源的含量为2.6-26mg/ml，例如为2.8mg/ml、3mg/ml、5mg/ml、7.5mg/ml、10mg/ml、IL 5mg/ml> 14.2mg/ml、15mg/ml> 16.8mg/ml、20mg/ml、22.7mg/ml、24mg/ml、25.2mg/ml、25.8mg/ml 等，优选为 5-20mg/ml,进一步优选为 10mg/ml。
[0031]优选地，所述酸溶液为稀盐酸。酸溶液的种类及浓度没有特别要求，只要能够将锗源溶液的PH值调节至所要求的范围即可，优选为稀盐酸。
[0032]优选地，所述锗源溶液的pH值调节后为6-7.5 ;进一步优选为7。
[0033]作为优选技术方案，本发明所述的制备方法，其中步骤(2)中所述保护剂为带有巯基的小分子，优选为半胱氨酸；
[0034]优选地，所述保护剂的浓度为0.05-1.5mmol/ml,例如为0.06mmol/ml、0.1Ommol/ml、0.15mmol/ml、0.30mmol/ml、0.50mmoI/ml、0.70mmol/ml、0.85mmol/ml>1.0mmol/ml、
1.15mmol/ml、l.30mmol/ml等,保护剂的浓度对于锗团簇的形成具有较大影响,本发明选择保护剂的浓度为0.05-1.5mmol/ml以使团簇容易并快速形成,优选为0.1-lmmol/ml ;进一步优选为lmmol/ml。
[0035]优选地，所述搅拌的方式为磁力搅拌。
[0036]作为优选技术方案，本发明所述的制备方法，其中步骤(4)中所述还原剂为硼氢化钠，加入量为 3.2-64mg/ml,例如可以是 3.5mg/ml、6.4mg/ml、12.8mg/ml、25.6mg/ml、
32.0mg/ml>38.6mg/ml、45.0mg/ml、51.6mg/ml、62.0mg/ml 等，还原剂的用量对于反应进行的影响较大，对于反应初期的溶液pH值以及初期还原速率都有很大的影响，因此本发明选择加入量为3.2-64mg/ml以利于反应的进行，加入量优选为10_48mg/ml，进一步优选为32mg/ml。
[0037]优选地，所述搅拌的方式为磁力搅拌。搅拌的速率没有特别要求，优选为200-2000r/min,例如为 200-875r/min、440_1682r/min、1015-2000r/min、200r/min、350r/min、489r/min、500r/min、750r/min、998r/min、1000r/min、1167r/min、1250r/min、1344r/min、1500r/min、1710r/min、1983r/min、2000r/min 等；进一步优选为 500-1500r/min。
[0038]作为优选技术方案，本发明所述的制备方法，其中步骤(5)中所述加热的温度为50-90 O，例如为 61.7 0C>63.6 0C>65 0C>66.2 0C>69 0C>70 0C>72.5 0C>74 0C>75 0C>77.3 0C>79°C、85°C等，优选为60-80°C，进一步优选为65°C -75，特别优选为70°C。
[0039]优选地，步骤(5)中所述加热的方式为油浴或水浴，优选为油浴；
[0040]优选地，步骤(5)中所述搅拌的时间为5_60min,例如为8min、15min、20min、26min、34min、46min、55min 等，优选为 10_30min ;进一步优选为 15_25min,特别优选为20min ；
[0041]优选地，步骤(5)中所述继续加热反应的温度为50_90°C，例如为55°C、61°C、65°C、68°C、72°C、76°C、79°C、84°C、88°C 等，优选为 60-80°C，进一步优选为 65°C -75，特别优选为70°C ；
[0042]优选地，步骤(5)中所述继续加热反应的时间为12_48h，例如为15h、28h、23h、26h、33h、39h、42h、45h 等，优选为 20_40h，进一步优选为 36h ；
[0043]优选地，步骤￠)中所述去除锗纳米团簇水溶液中的无机盐采用透析膜透析的方式，优选用MW500-2000的透析膜进行，进一步优选用MW500的透析膜进行。透析为本领域的常用技术手段。本发明的锗团簇只需通过简单的透析等方法即可从反应体系中分离出来，而现有技术中很多贵金属团簇的制备反应都是在有机相中进行，分离困难。
[0044]作为优选技术方案，本发明所述的制备方法，所述方法包括如下步骤:
[0045](I)在超声波辐射条件下，将二氧化锗溶于浓度为2-10mg/ml的氢氧化钠溶液中，制备成锗源溶液，锗源溶液中溶解的锗源含量为2.6-26mg/ml，用稀盐酸将锗源溶液的pH值调节至6-9 ;其中氢氧化钠溶液浓度优选为5-8mg/ml ;特别优选为6mg/ml，锗源溶液中溶解的锗源含量优选为5-20mg/ml，进一步优选为10mg/ml，锗源溶液的pH值调节后优选为6-7.5 ;进一步优选为7 ；
[0046](2)将半胱氨酸加入到超纯水中，搅拌使得半胱氨酸充分溶解，制备半胱氨酸的水溶液，半胱氨酸的水溶液的浓度为0.05-1.5mmol/ml ;其中半胱氨酸的水溶液的浓度优选为 0.Ι-lmmol/ml ;进一步优选为 lmmol/ml ；
[0047](3)将步骤(I)的溶液加入到步骤⑵的水溶液中；
[0048](4)将硼氢化钠加至步骤(3)所得溶液中，使得硼氢化钠的浓度为3.2-64mg/ml,继续搅拌；其中硼氢化钠的浓度优选为10-48mg/ml,进一步优选为32mg/ml ；
[0049](5)将步骤(4)所得溶液置于50°C -90°C的油浴中，搅拌5_60min，直至反应液中出现大量的橙黄色不溶物，50°C -90°C的油浴中继续反应，橘黄色不溶物逐渐消失，12-48h后得到锗纳米团簇溶液；其中油浴温度优选为60-80°C，进一步优选为65°C -75，特别优选为70°C ;搅拌时间优选为10-30min ;进一步优选为15_25min，特别优选为20min ;继续反应的时间为12-48h，优选为20-40h，进一步优选为36h ；
[0050]任选进行(6)MW500-2000的透析膜透析去除步骤(5)所得的锗纳米团簇水溶液中的无机盐，得到的锗团簇水溶液，-50°C?_60°C的温度下冷冻干燥保存。其中透析膜优选为丽500的透析膜。
[0051]本发明的目的之一还在于提供本发明所述的方法获得的单分子层保护的锗纳米团簇。本发明所提供的锗团簇在以荧光素钠作为标准物时，量子产率可以达到40%以上。
[0052]干燥后的锗团簇在大气条件下保存时非常稳定，数月之后荧光也不会有明显的减弱，而传统的荧光染料则容易发生降解。
[0053]锗团簇即使在毫克级也没有表现出任何的细胞毒性，具有很好的生物相容性。
[0054]本发明的目的之一还在于提供所述的锗纳米团簇在生物细胞成像上的应用。经过细胞成像研究，发现所述锗团簇具有绿色荧光，能够很好地应用于细胞荧光成像，并且根据细胞荧光成像研究的结果，发现锗团簇量子点主要分布在细胞的非核部位。
[0055]作为优选技术方案，所述的用途其中的所述生物细胞成像的细胞培养条件为37°C和5vol%的CO2。将本发明的锗量子点应用于生物成像时，对于细胞的种类没有特殊的要求。
[0056]在说明书和权利要求书中使用的所有表示工艺参数、反应条件等在所有情况下都应当被理解为加上术语“约”的修饰。因此，除非相反指出，在说明书和权利要求书中所给出的数值都可以根据本发明所希望得到的性质的不同而变化。在最低限度，并不用于将等价物原则的应用限定为权利要求的范围，每个数值都应当至少依照所报道的有效数字的值通过使用普通的舍入方法进行解释。而且，所有在此公布的范围都应当被理解为包含范围的起点和终点值，包含任意和所有包含在其中的小范围。例如，一定的范围“1-10”应当被认为包含最小值I和最大值10之间(包括在内)的任何和所有小范围；即所有以大于或等于I的最小值起始，而且以小于或等于10的最大值结束的所有小范围，例如5-10，3.3-6.7，或1.5-8.8。本发明中所有提及的气体和液体的体积均为在20°C以及一个标准大气压下的数值。本发明中提及的所有参考文献都应当被理解为全部包括进来用于参考。
[0057]本发明中用到的主要原料物质，锗源二氧化锗、还原剂硼氢化钠以及保护剂半胱氨酸均为常见的化学物质，性质稳定、易于保存，并且基本没有生物毒性。本发明采用的合成方法无需高温以及惰性气体的保护，简单易操作，同时反应没有中间环节，一步即可完成，便于规模化工业扩大。本发明得到的锗团簇具有高达40%以上的量子产率，易于从体系中分离，冷冻干燥即可长期保存，特别是还具有稳定的荧光性质而无细胞毒性，能够很好地应用于生物细胞成像，是一种无生物毒性的绿色荧光材料。
【专利附图】
【附图说明】
[0058]图1为实施例1中翠绿色荧光锗团簇在紫外灯下的荧光图片；
[0059]图2为为实施例1中锗团簇的荧光激发和发射；
[0060]图3为对比例I中黄色荧光锗团簇在紫外灯下的荧光图片；
[0061]图4为对比例I中黄色锗团簇的荧光激发和发射光谱；
[0062]图5为荧光光谱仪测得实施例1得到的锗团簇的在不同的激发波长下的荧光光谱；
[0063]图6为电喷雾电离质谱测得的实施例1中的锗团簇的质谱图；
[0064]图7为实施例2中CCK-8法在不同浓度团簇浓度的情况下检测细胞凋亡水平获得的细胞活性柱状图；
[0065]图8为实施例1中得到的锗团簇用于生物细胞成像的荧光显微镜下细胞成像效果图。
【具体实施方式】
[0066]为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0067]实施例1
[0068]按照如下方法合成水溶性锗团簇:
[0069](I)称取0.06g氢氧化钠溶于1ml水中，超声溶解，制成氢氧化钠溶液；
[0070](2)称取0.26g二氧化锗(GeO2，购自西格玛奥德里奇上海贸易有限公司，产品号为483702)溶于步骤(I)的氢氧化钠溶液中，超声溶解，得锗源溶液；
[0071](3)在超声波辐射条件下，将锗源溶于氢氧化钠溶液中，制备成锗源溶液，用稀盐酸调节步骤(2)的锗源溶液的pH值至6-7之间；
[0072](4)将1.21g半胱氨酸(购自西格玛奥德里奇上海贸易有限公司，产品号30089-25G)加入到9ml超纯水中，搅拌使得半胱氨酸充分溶解，制备半胱氨酸的水溶液；半胱氨酸的水溶液的浓度为1.0mmo I/ml ；
[0073](5)取制备好的锗源溶液Iml加入到半胱氨酸的水溶液中，称取0.32g硼氢化钠，然后将硼氢化钠加至半胱氨酸水溶液中，使得硼氢化钠的浓度为32mg/ml，继续搅拌，再置于70°C的油浴中，搅拌20min，直至反应液中出现大量的橙黄色不溶物；70°C的油浴中继续反应，橘黄色不溶物逐渐消失，24h后得到亮黄色透明具有翠绿色荧光的锗团簇溶液；
[0074](6)用Mw=500的透析膜将步骤(5)所得反应液进行透析，去除锗团簇溶液中的无机盐；
[0075](8)根据将除去无机盐的锗团簇溶液在_50°C?_60°C的温度下冷冻干燥。
[0076]根据文献(Zheng,J.，Petty,等美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.) 2003,125, 7780-7781)中所述的方法，利用荧光光谱仪测定本实施例1和对比例I得到的锗团簇的荧光光谱，结果如图1?4所示，图1和图2可以看出锗团簇的呈现翠绿色的荧光，发射峰在504nm处，图3和图4显示在对比例I中得到的荧光为黄绿色，荧光的发射峰在530nm，可见配体和锗源之间的浓度比对于合成的团簇的荧光性质有一定的影响。
[0077]图5可以看出荧光发射波谱激发波长并不存在明显的依赖关系，随着激发波长的改变，发射波谱几乎没有变化。
[0078]图6为电喷雾电离质谱测得的实施例1中的锗团簇的质谱图，对团簇分子量的范围进行了表征，可以看出团簇的分子量基本4000以内。
[0079]根据文献(WangJ.Sun 等化学通讯(chemical communicat1n) 2011,17,4941-443)中所述的方法，利用荧光素钠作为作为标准物质，测定本实施例1得到的团簇的荧光量子产率在40%以上，实施例2得到的荧光量子产率也在20%以上。
[0080]实施例2:
[0081]本实施例按照与实施例1相同的方法制备锗团簇，唯一不同的是:所用半胱氨酸的量为0.121g。
[0082]按照实施例1中的相同的表征方法，利用荧光光谱仪测得本对比例得到的锗团簇的荧光光谱与实施例1很不同，发射峰位红移至530nm，激发峰位蓝移至385nm，利用荧光素钠作为荧光标准物质测得本实施例得到的锗团簇的荧光量子产率在20%以上，说明半胱氨酸和锗源的配比浓度对合成的团簇的突光性质有一定的影响。
[0083]实施例3
[0084](I)称取0.02g氢氧化钾溶于1ml水中，超声溶解，制成氢氧化钠溶液；
[0085](2)称取0.026g 二氧化锗(GeO2，购自西格玛奥德里奇上海贸易有限公司，产品号为483702)溶于步骤(I)的氢氧化钠溶液中，超声溶解，得锗源溶液；
[0086](3)在超声波辐射条件下，将锗源溶于氢氧化钠溶液中，制备成锗源溶液，用稀盐酸调节步骤(2)的锗源溶液的pH值至9 ;
[0087](4)将0.0605g半胱氨酸(购自西格玛奥德里奇上海贸易有限公司，产品号30089-25G)加入到9ml超纯水中，搅拌使得半胱氨酸充分溶解，制备半胱氨酸的水溶液；半胱氨酸的水溶液的浓度为0.05mmol/ml ；
[0088](5)取制备好的锗源溶液Iml加入到半胱氨酸的水溶液中，称取0.032g硼氢化钠，然后将硼氢化钠加至半胱氨酸水溶液中，使得硼氢化钠的浓度为3.2mg/ml，继续搅拌，再置于50°C的油浴中，搅拌50min，直至反应液中出现大量的橙黄色不溶物；50°C的油浴中继续反应，橘黄色不溶物逐渐消失，48h后得到亮黄色透明具有翠绿色荧光的锗团簇溶液；
[0089](6)用Mw=2000的透析膜将步骤(5)所得反应液进行透析，去除锗团簇溶液中的无机盐；
[0090](8)根据将除去无机盐的锗团簇溶液在_50°C?_60°C的温度下冷冻干燥。
[0091]利用荧光素钠作为作为标准物质，测定本实施例得到的团簇的荧光量子产率在20%以上。
[0092]实施例4
[0093](I)称取0.1g氢氧化钠溶于1ml水中，超声溶解，制成氢氧化钠溶液；
[0094](2)称取0.1g 二氧化锗(GeO2，购自西格玛奥德里奇上海贸易有限公司，产品号为483702)溶于步骤(I)的氢氧化钠溶液中，超声溶解，得锗源溶液；
[0095](3)在超声波辐射条件下，将锗源溶于氢氧化钠溶液中，制备成锗源溶液，用稀盐酸调节步骤(2)的锗源溶液的pH值至7.5 ;
[0096](4)将1.8150g半胱氨酸(购自西格玛奥德里奇上海贸易有限公司，产品号30089-25G)加入到9ml超纯水中，搅拌使得半胱氨酸充分溶解，制备半胱氨酸的水溶液；半胱氨酸的水溶液的浓度为1.5mmol/ml ；
[0097](5)取制备好的锗源溶液Iml加入到半胱氨酸的水溶液中，称取0.64g硼氢化钠，然后将硼氢化钠加至半胱氨酸水溶液中，使得硼氢化钠的浓度为64mg/ml，继续搅拌，再置于90°C的油浴中，搅拌60min，直至反应液中出现大量的橙黄色不溶物；90°C的油浴中继续反应，橘黄色不溶物逐渐消失，12h后得到亮黄色透明具有翠绿色荧光的锗团簇溶液；
[0098](6)用Mw=100的透析膜将步骤(5)所得反应液进行透析，去除锗团簇溶液中的无机盐；
[0099](8)根据将除去无机盐的锗团簇溶液在_50°C?_60°C的温度下冷冻干燥。
[0100]利用荧光素钠作为作为标准物质，测定本实施例得到的团簇的荧光量子产率在40%以上。
[0101]对比例I
[0102]本对比例按照与实施例1相同的方法制备锗团簇，唯一不同的是:在步骤(4)中将半胱氨酸改为等摩尔浓度的抗坏血酸钠。
[0103]12h后观察反应液，发现溶液为无色透明，但是在紫外灯下没有荧光。
[0104]对比例2
[0105]本对比例按照与实施例1相同的方法制备锗团簇，唯一不同的是:在步骤(3)中将步骤(2)所得反应液的pH值调节至5-6之间。
[0106]12h后观察反应液，发现溶液中有大量白色沉淀产生，并且溶液在紫外灯下观察没有荧光。从对比例I和2可见锗源溶液pH值的选择对本发明的方法有重要影响，直接影响反应的进行与否。
[0107]对比例3
[0108]本对比例按照与实施例1相同的方法制备锗团簇，唯一不同的是:在步骤(3)中将锗源溶液PH调节至10-11之间。
[0109]在步骤(5)进行12h后，观察发现反应液变为无色透明，但是在紫外灯下观察没有荧光。可见配制锗源溶液时的pH值得选择对后续的反应也有着至关重要的影响。
[0110]实施例5
[0111]将实施例1中得到的锗团簇用于细胞毒性实验:
[0112]将肺癌细胞(A549细胞系，购自ATCC，编号CCL-185)以每35mm内径的培养皿13个的密度接种于含有2ml的DMEM培养基(购自Gibco，牌号sh30022.01B,且含10vol%的胎牛血清)的培养皿中，在37°C和5vol%的CO2浓度下培养24h后，吸出培养基，加入缓冲液，根据文献(Qinghua Miao 等，生物材料(B1materials), 2010, 31 (28): 7364-75)中所述的CCK-8法在锗量子点存在的情况下检测细胞凋亡水平。
[0113]具体操作步骤如下:
[0114](I)在64孔板中配置100 μ L的细胞悬浮液，将培养板在培养箱中预培养24h(37°C, C025vol%)；
[0115](2)向培养板加入10 μ L不同浓度的锗团簇使得培养液中所含锗团簇的浓度分别为 0.2 μ g/ml、2 μ g/ml、20 μ g/ml、200 μ g/ml ；
[0116](3)将培养板在培养箱中孵育24h ；
[0117](4)向培养板中每孔加入1yL CCK溶液；
[0118](5)将培养板在培养箱中孵育Ih (37°C, C025vol%)；
[0119](6)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
[0120]结果如图7所示,可以看出当锗量子点的浓度分别为2 μ g/ml>50 μ g/ml、100 μ g/ml、200 μ g/ml、2000 μ g/ml 时，对应的细胞活性分别为 100.08±3.71%、100.33土L 48%、100.93±8.21%、101.61 ± 1.45%、101.86±5.32%，可见本发明合成的锗量子点即使在2000 μ g/ml的高浓度下也没有表现出任何的细胞毒性。
[0121]实施例6
[0122]将实施例1中得到的锗量子点用于细胞成像试验:
[0123]将肺癌细胞(A549细胞系，购自ATCC，编号CCL-185)以每35mm内径的培养皿13个的密度接种于含有2ml的DMEM培养基(购自Gibco，牌号sh30022.01B)，且含10体积％的胎牛血清)的培养皿中，在37°C和5vol%的CO2浓度下培养24h后，吸出培养基，将2ml溶有锗团簇的培养基(药物浓度为2mg/ml)加入培养皿中，将培养皿在37°C和5vol%的CO2浓度下孵育12h，吸出培养基，之后在含有万分之一溶酶体β -半乳糖苷酶染色试剂(购Propbs，产品编号GMS10121)的磷酸盐缓冲液(购自Gibco，牌号P1020-500)中培养五分钟，用磷酸盐缓冲液洗涤3次(每次5ml)，并使用荧光显微镜成像。
[0124]成像结果如图8所示，可以看出锗团簇进入细胞后，细胞非核部位呈现较量的荧光，即本发明的锗团簇具有很好的细胞成像能力，在进入细胞后能够很好地起到细胞成像的作用，由溶酶体染色剂的定位作用，可以看到荧光锗团簇进入细胞的方式主要是溶酶体介导的。
[0125]应该注意到并理解，在不脱离后附的权利要求所要求的本发明的精神和范围的情况下，能够对上述详细描述的本发明做出各种修改和改进。因此，要求保护的技术方案的范围不受所给出的任何特定示范教导的限制。
[0126] 申请人:声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺流程才能实施。所属【技术领域】的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
【权利要求】
1.一种锗纳米团簇的制备方法，包括如下步骤: (1)将锗源溶于碱溶液中制得锗源溶液； (2)将保护剂溶于水制得保护剂的水溶液； (3)将步骤(I)所得锗源溶液加入到步骤(2)保护剂的水溶液中； (4)将还原剂加入到步骤(3)所得溶液中； (5)加热步骤⑷的溶液，得到锗纳米团簇。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(I)所述的锗源为二氧化锗或/和锗盐；优选为二氧化锗或/和偏锗酸钠；进一步优选为二氧化锗； 优选地，步骤(I)所述碱溶液为含碱金属的氢氧化物的溶液，优选为氢氧化钠或/和氢氧化钾； 优选地，步骤(2)所述保护剂为带有巯基的小分子，优选为半胱氨酸； 优选地，步骤(4)所述还原剂为具有还原能力的无机盐类，优选为硼氢化钠； 优选地，步骤(5)所述加热的温度为50-90°C，优选为60-80°C，进一步优选为65_75°C，特别优选为70°C。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: (1)在超声波辐射条件下，将锗源溶于碱溶液中，制备成锗源溶液，用酸溶液将锗源溶液的PH值调节至6-9 ； (2)将保护剂加入到超纯水中，搅拌，溶解，得到保护剂的水溶液； (3)将步骤⑴的锗源溶液加入到步骤⑵保护剂的水溶液中； (4)将还原剂加至步骤(3)所得溶液中，搅拌，溶解； (5)将步骤(4)所得溶液加热下搅拌，继续加热反应得到锗纳米团簇； 任选进行(6)去除步骤(5)所得的锗纳米团簇水溶液中的无机盐，_50°C?-60°C的温度下冷冻干燥保存。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(I)中所述超声波辐射采用超声清洗仪； 优选地，所述碱溶液为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液；优选所述碱溶液的浓度为2-10mg/ml,进一步优选为5_8mg/ml ;特别优选为6mg/ml ； 优选地，所述锗源为二氧化锗或/和锗盐；优选为二氧化锗或/和偏锗酸钠；进一步优选为二氧化锗； 优选地，所述锗源溶液中锗源的含量为2.6-26mg/ml，优选为5-20mg/ml，进一步优选为 10mg/ml ； 优选地，所述酸溶液为稀盐酸； 优选地，所述锗源溶液的PH值调节后为6-7.5 ;进一步优选为7。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述保护剂为带有巯基的小分子，优选为半胱氨酸； 优选地，所述保护剂的浓度为0.05-1.5mmol/ml,优选为0.1-lmmol/ml ;进一步优选为Immol/ml ； 优选地，所述搅拌的方式为磁力搅拌。
6.根据权利要求3-5之一所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述还原剂为硼氢化钠，加入量为3.2-64mg/ml,优选为10-48mg/ml,进一步优选为32mg/ml ； 优选地，所述搅拌的方式为磁力搅拌。
7.根据权利要求3-6之一所述的方法，其特征在于，步骤(5)中所述加热的温度为50-90°C，优选为60-80°C，进一步优选为65°C -75，特别优选为70°C ； 优选地，步骤(5)中所述加热的方式为油浴或水浴，优选为油浴； 优选地，步骤(5)中所述搅拌的时间为5-60min，优选为10_30min ;进一步优选为15-25min，特别优选为20min ； 优选地，步骤(5)中所述继续加热反应的温度为50-90°C，优选为60-80°C，进一步优选为65°C -75，特别优选为70°C ； 优选地，步骤(5)中所述继续加热反应的时间为12-48h ;优选为20-40h，进一步优选为36h ； 优选地，步骤￠)中所述去除锗纳米团簇水溶液中的无机盐采用透析膜透析的方式，优选用MW500-2000的透析膜进行，进一步优选用MW500的透析膜进行。
8.根据权利要求1-7之一所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: (1)在超声波辐射条件下，将二氧化锗溶于浓度为2-10mg/ml的氢氧化钠溶液中，制备成锗源溶液，锗源溶液中溶解的锗源含量为2.6-26mg/ml，用稀盐酸将锗源溶液的pH值调节至6-9 ； (2)将半胱氨酸加入到超纯水中，搅拌使得半胱氨酸充分溶解，制备半胱氨酸的水溶液，半胱氨酸的水溶液的浓度为0.05-1.5mmol/ml ； (3)将步骤(I)的溶液加入到步骤(2)的水溶液中； (4)将硼氢化钠加至步骤(3)所得溶液中，使得硼氢化钠的浓度为3.2-64mg/ml，继续搅拌； (5)将步骤(4)所得溶液置于50°C-90°C的油浴中，搅拌5-60min，直至反应液中出现大量的橙黄色不溶物，50°C _90°C的油浴中继续反应，橘黄色不溶物逐渐消失，12-48h后得到锗纳米团簇溶液； 任选进行出)丽500-2000的透析膜透析去除步骤(5)所得的锗纳米团簇水溶液中的无机盐，得到的锗团簇水溶液，_50°C?_60°C的温度下冷冻干燥保存。
9.根据权利要求1-8之一所述的方法获得的单分子层保护的锗纳米团簇。
10.根据权利要求9所述的锗纳米团簇的用途，其特征在于，所述的锗纳米团簇用于生物细胞成像； 优选地，所述生物细胞成像的细胞培养条件为37°C和5vol%的C02。
【文档编号】B22F9/24GK104174863SQ201310190010
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2013年5月21日 优先权日:2013年5月21日
【发明者】聂广军, 李凤 申请人:国家纳米科学中心