专利名称：一种磁性石墨烯复合材料的合成方法及其应用的制作方法
一种磁性石墨烯复合材料的合成方法及其应用技术领域
本发明属于先进纳米富集材料与纳米技术领域，具体涉及一种用于磷酸化蛋白/ 肽段富集的磁性石墨烯复合材料的合成方法及其应用。
背景技术：
蛋白质的可逆磷酸化是一种非常重要的翻译后修饰，调节着如细胞信号传导、细胞分化、细胞生长、细胞凋亡等几乎所有的生命活动，也被形象地描述为细胞生理活动的分子开关。因此，对蛋白质磷酸化的研究有助于全面理解蛋白质的各项功能及其机理。
于修饰蛋白的低丰度、难检测，在质谱分析前需对修饰蛋白及肽段进行选择性富集，而发展新型的富集技术成为当前蛋白组学研究的热点。
目前对磷酸化肽段进行富集的方法主要有免疫沉淀法，化学修饰法，固定金属离子亲和色谱法，金属氧化物亲和色谱法，其中固定金属离子亲和色谱法和金属氧化物亲和色谱法研究最广。具有超顺磁性的Fe3O4微球，基于其自身特性已应用于生物医学中的许多领域，近年来其已成为蛋白质组学研究中新兴的重要分析技术。磁球在外加磁场的作用下易于分离，因此也适用于磷酸化肽段富集。
墨烯因其杰出的力学、电学、热学、光学特性以及高达2600 Hi2g-1的理论比表面积吸引了大量研究者的兴趣，这些独特而有趣的特性使这种高品质碳材料有望应用在许多潜在的应用领域，如透明导电膜、传感器、超级电容器，纳米电子学、电池等。
石墨烯氧化物复合材料在发挥石墨烯特有优势的同时，通过引入其他材料实现对石墨烯基材料的功能化，不仅可以扩大石墨烯材料的应用领域，同时，通过引入氧化物可以克服石墨烯自身堆积，分散性差的缺点，近期也成为研究热点。
发明中所涉及的具有大比表面积的磁性石墨烯金属氧化物复合材料，合成方法简单新颖，在石墨烯基础上，同时引入具有磁性的氧化铁及具有富集功能的金属氧化物，将此复合材料用于磷酸化蛋白组学中磷酸化肽段、蛋白的富集研究，不仅因石墨烯的大比表面积有好的富集效果，同时因具有磁性使得实验操作更简便。此外，引入其他不同的金属氧化物可用于其他相关的应用领域。发明内容
本发明目的在于提供一种磁性石墨烯复合材料的合成方法及其磁性石墨烯复合材料在质谱检测中的应用。
本发明内容为一种磁性石墨烯复合材料的合成方法，具体步骤如下(1)将石墨烯均匀分散在浓硝酸中进行酸化处理，清洗、干燥；(2)将步骤(I)所得到的石墨烯与六水合氯化铁一起分散到乙二醇溶液中，并加入柠檬酸钠、乙酸钠、聚乙二醇，分散均匀；(3)将步骤(2)所得的混 合溶液放入高压反应釜中，在180°C_220°C高温下反应8_12 小时后得到磁性石墨烯，清洗干燥所得磁性石墨烯；(4)磁性石墨烯复合材料前躯体的制备采用下述任一种方法将步骤(3)所得的磁性石墨烯分散到无水乙醇中，在pH为8、条件下，缓慢加入钛酸丁酯，持续机械搅拌下反应20-24小时，得到磁性石墨烯复合材料前躯体，其中，每O. 15g加入2ml钛酸丁酯；或者将步骤(3)所得的磁性石墨烯分散到96ml乙醇/水溶液中，其中，每O. 12g加入 96ml的乙醇/水溶液中，加入尿素和四水合锡酸钠，搅动分散使盐溶解，得到磁性石墨烯复合材料前驱体，其中，每O. 12g加入96ml的乙醇/水溶液，和加入2. 25g尿素和O. 329g四水合锡酸钠；(5)将步骤(4)所得的磁性石墨烯复合材料前躯体分散到水中，转移到高压反应釜中， 1500C _170°C高温下水热反应20-40小时；降至室温，用磁铁分离、清洗后在氮气保护下 350-450°C高温煅烧2-4小时后，得到磁性石墨烯复合材料。
本发明中，步骤(2)中石墨烯、六水合氯化铁、柠檬酸钠、乙酸钠和聚乙二醇的质量比为(O. 1-0. 15) :0· 405:0. 15:1. 8:1. 0，其中聚乙二醇的分子量为 200000。
本发明中，磁性石墨烯复合材料在质谱检测中的应用，具体步骤是将磁性石墨烯复合材料分散到乙腈中，配成磁性石墨烯复合材料分散液，加入肽段混合液，混合均匀后， 放入酶解仪中混悬富集，磁铁分离去除上清，用缓冲液清洗后，在碱性条件下混悬洗脱，取出上清，可用于质谱检测。
本发明中，磁性石墨烯复合材料在磷酸化蛋白组学中对磷酸化肽段选择性富集的应用。本发明的有益效果在于所提供的一种具有磁性的石墨烯复合材料的合成方法结合了石墨烯酸化处理、水热反应制备磁性微球、钛酸丁酯水解反应形成二氧化钛、磁性石墨烯二氧化钛前躯体水热处理、煅烧结晶，获得的复合材料具有磁性、比表面积高、分散性好、生物相容性高等诸多特点，可用作磷酸化肽段选择性富集材料，以选择性性富集蛋白酶解混合物中的磷酸化肽段。由于该复合材料具有磁性，富集过程中可用磁铁分离，操作简便快捷。富集得到的磷酸化肽段可直接进行质谱检测。
本发明所得到的该材料的骨架为石墨烯，石墨烯层上修饰有磁性四氧化三铁微球及二氧化钛微球，材料的比表面积为95. 78m2/g、孔体为O. 25 cm3/g、分散性及生物相容性好、具有磁性。该材料以石墨烯为骨架，修饰在石墨烯骨架上的四氧化三铁微球具有磁性， 同时骨架上修饰有二氧化钛微球。提供了大的比表面积，具有磁性且分散性好，在磷酸化肽段选择性富集应用中操作快捷简便，修饰的二氧化钛与磷酸化肽段的特异性相互作用使其可用于磷酸化肽段富集研究中，并有很好的富集能力，此外，该材料有很好的生物相容性， 有望用于生物样品中磷酸化蛋白的在线富集。
图1实施例1中磁性石墨烯复合材料前躯体的透射电子显微镜照片；图2实施例1中磁性石墨烯复合材料的透射电子显微镜照片；图3实施例1中磁性石墨烯 复合材料对50ng/ul的β -casein标准磷酸化肽段富集前后对照图，(a)为g集如，(b)为g集后；图4为实施例1中鼠脑酶解肽段中鉴定到的单磷酸化肽段TAKDSpDDDDDVTVTVDR的双电荷形式的二级质谱图；图5为实施例1中图4中质荷比为924. 3的峰对应的三级质谱图。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。
实施例1.
磁性石墨烯二氧化钛复合材料的合成(I)将O. 40 g石墨烯分散到50ml浓硝酸中，在60°C下磁力搅拌7小时，处理过后的石墨烯用去离子水清洗5次，50°C下真空干燥后收集待用。
(2) 100-150mg干燥的预处理过的石墨烯与405mg六水合氯化铁一起分散到40ml 乙二醇溶液，并加入O. 15g柠檬酸钠、1. 8g乙酸钠、1. Og聚乙二醇(分子量为20000)，超声分散后磁力搅拌2小时。
(3)上述混合溶液密封到高压反应釜中，放于200°C烘箱中反应10小时。得到的磁性石墨烯用去离子水清洗3次后烘干收集。
(4) O. 15g上述得到的磁性石墨烯分散到200ml无水乙醇中，加入O. 9ml浓氨水 (28 wt%)，超声15分钟，在5分钟内逐滴加入2mlTB0T，45°C持续机械搅拌下反应24小时。 用去离子水和乙醇分别清洗3次以后，得到磁性石墨烯金属氧化物前躯体。如图1，显示层状石墨烯上修饰了四氧化三铁磁性微球及二氧化钛。
(5) O. 5g此前躯体分散到20ml去离子水中，超声混合均匀后倒入高压反应釜中， 将反应釜放入160°C烘箱中中反应24小时。降温至室温后，通过磁铁分离，用去离子水和乙醇分别清洗3次，于50°C真空烘箱中烘干，400°C氮气保护下煅烧2小时，即得到磁性石墨烯二氧化钛复合材料。如图2，显示层状石墨烯上修饰了四氧化三铁磁性微球及二氧化钛。该材料的骨架为石墨烯，石墨烯层上修饰有磁性四氧化三铁微球及二氧化钛微球，材料的比表面积为95. 78m2/g、孔体为O. 25 cm3/g，材料中钛含量为24. 91%。
性石墨烯二氧化钛复合材料在磷酸化肽段选择性富集中的应用磁性石墨烯二氧化钛复合材料分散到50%的乙腈中，配成2mg/ml磁性石墨烯二氧化钛复合材料分散液待用。
(I)对于标准磷酸化肽段富集，吸取200ul磁性石墨烯二氧化钛复合材料分散液到600ul体积EP管中，用缓冲液(50%乙腈+0. 1%TFA)清洗3次，加入200ul缓冲液及一定浓度的标准磷酸化肽段13-(^8^11，混合均匀后，放入酶解仪中混悬富集0.5小时，磁铁分离去除上清，继续用缓冲液清洗3次，加入O. 4M氨水(pH约为10. 4)5ul，混悬进行洗脱10分钟,取出上清。将上清点到质谱祀板上(每个点O. 6ul),蒸发干燥后点O. 5ul基质(20 mg/ ml, 50%乙腈，1% H3PO4 (v/v))。蒸发干燥后进行MALD1-TOF MS (基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱)检测。
(2)对于实际生物样品，要先进行蛋白提取及酶解，400ul酶解后的肽段混合液，用 TFA调节pH至2,离心去除沉淀。吸取Iml磁性石墨烯二氧化钛复合材料分散液到1. 5ml 体积EP管中，用缓冲液(50%乙腈+0. 1%TFA)清洗3次，加入上述离心处理过的实际蛋白酶解后肽段混合液。混合均匀后，放入酶解仪中混悬富集O. 5小时，磁铁分离去除上清，继续用缓冲液清洗3次，加入O. 4M氨水(pH约为10. 4)200ul，混悬进行洗脱30分钟，取出上清， 冻干后溶于液相色谱流动相进行LC - ES1-MS检测。
实施例2磁性石墨烯二氧化锡复合材料的合成其余合成条件与实施例1相同，仅步骤(4)(5)为O. 12g磁性石墨烯分散到96ml乙醇/ 水混合液(乙醇体积为37. 5%)中，加入2. 25g尿素和O. 329g四水合锡酸钠(Na2SnO3 ·4Η20)。 搅动分散使盐溶解，分散好的混合液转移到高压反应釜中，170° C反应36小时。得`到磁性石墨烯二氧化锡复合材料。同样可用于磷酸化肽段选择性富集研究。
权利要求
1.一种磁性石墨烯复合材料的合成方法，其特征在于具体步骤如下 将石墨烯均匀分散在浓硝酸中进行酸化处理，清洗、干燥； 将步骤(I)所得到的石墨烯与六水合氯化铁一起分散到乙二醇溶液中，并加入柠檬酸钠、乙酸钠和聚乙二醇，分散均匀； 将步骤(2)所得的混合溶液放入高压反应釜中，在180°C _220°C高温下反应8-12小时后得到磁性石墨烯，清洗干燥所得的磁性石墨烯； (4)磁性石墨烯复合材料前躯体的制备采用下述任一种方法 将步骤(3)所得的磁性石墨烯0. 15g分散到无水乙醇中，在pH为8、条件下，缓慢加入钛酸丁酯2ml，持续机械搅拌下反应20-24小时，得到磁性石墨烯复合材料前躯体； 或者将步骤(3)所得的磁性石墨烯分散到96ml乙醇/水溶液中，其中，每0. 12g加入96ml的乙醇/水溶液中，加入2. 25g尿素和0. 329g四水合锡酸钠，搅动分散使盐溶解，得到磁性石墨烯复合材料前驱体； (5)将步骤(4)所得的磁性石墨烯复合材料前躯体分散到水中，转移到高压反应釜中，1500C _170°C高温下水热反应20-40小时；降至室温，用磁铁分离、清洗后在氮气保护下350-450°C高温煅烧2-4小时后，得到磁性石墨烯复合材料。
2.根据权利要求1所述的一种磁性石墨烯复合材料的合成方法，其特征在于步骤(2)中石墨烯、六水合氯化铁、柠檬酸钠、乙酸钠和聚乙二醇的质量比为(0. 1-0. 15) :0. 405:0. 15:1. 8:1. 0，其中聚乙二醇的分子量为 200000。
3.—种如权利要求1所述合成方法得到的磁性石墨烯复合材料在质谱检测中的应用，其特征在于具体步步骤为将磁性石墨烯复合材料分散到乙腈中，配成磁性石墨烯复合材料分散液，加入肽段混合液，混合均匀后，放入酶解仪中混悬富集，磁铁分离去除上清，用缓冲液清洗后，在碱性条件下混悬洗脱，取出上清，可用于质谱检测。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述磁性石墨烯复合材料在磷酸化蛋白组学中对磷酸化肽段选择性富集的应用。
全文摘要
本发明属于先进纳米富集材料与纳米技术领域，涉及一种磁性石墨烯复合材料的合成方法及其应用。将石墨烯酸化处理，与六水合氯化铁一起分散到乙二醇溶液中，并加入柠檬酸钠、乙酸钠、聚乙二醇，高温水热反应得到磁性石墨烯。再分散到乙醇中，加入钛酸丁酯，或尿素和四水合锡酸钠，得到磁性石墨烯复合材料前驱体。再分散到水中，经高温高压水热处理及高温煅烧处理得到具有磁性石墨烯复合材料。该材料具有磁性且分散性好，有很好的生物相容性，可用于生物样品中磷酸化蛋白的在线富集。
文档编号C01B31/04GK103030139SQ201210559598
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月21日 优先权日2012年12月21日
发明者邓春晖, 卢晋, 王梦依, 闫迎华, 孙念荣, 熊娅, 张祥民 申请人:复旦大学