中空介孔二氧化硅纳米粒、纳米载体及其制备方法与流程

本发明涉及药物制剂领域，特别是涉及一种中空介孔二氧化硅纳米粒、纳米载体及其制备方法。

背景技术：

基因治疗是指通过一定方式将具有治疗作用的外源基因转入特定细胞，以达到治疗的目的。其中，如何有效地将目标基因传递到细胞，并发挥疗效是该疗法的关键。基因传递通常需借助载体，目前的基因载体常分为病毒型载体与非病毒型载体两类。病毒型载体虽然能达到较高的转染效率，但较高的免疫原性，可能致癌等安全性问题，限制了这类载体的广泛应用。非病毒型载体因具有免疫原性低、安全性高、制备方便等优点而受到研究者关注，该类型载体主要包括脂质体、阳离子聚合物、无机纳米粒等。其中，脂质体是较为成熟的体外转染载体，但其稳定性较差；阳离子聚合物型载体通常具有较好的体外基因转染效果，但该类材料毒性明显，血清条件下转染能力差，限制了其体内应用的前景；无机纳米材料稳定性良好，易于改性修饰等，可作为基因传递载体，不足之处在于通常转染效率较低。良好的基因制剂应该同时具有较高的转染效率、生物安全性和稳定性，并能够抗血清转染。因而，考虑联合使用不同种类的载体，以达到取长补短。而无机材料与有机材料的结合，是实现该目标的策略之一。

在无机纳米载体中，介孔二氧化硅纳米粒(MSNs)因其细胞毒性低、稳定性良好、易修饰改性及具有较大的比表面积、孔容积和有序的孔道结构等独特优势，在药物与基因传递领域受到广泛关注，不足之处在于纳米粒负载基因后表面电位会产生下降，不利于细胞的摄取，并且体系进入细胞后，溶酶体会对其转染形成干扰，造成转染效率下降。另一方面，聚乙烯亚胺(PEI)作为一种常用的阳离子聚合物型载体，可引起“质子海绵效应”，能够避免溶酶体等对基因的破坏，进而提高转染效率，但其毒性大和抗血清转染能力弱等缺陷也不容忽视。

技术实现要素：

基于此，本发明的目的之一是提供一种中空介孔二氧化硅纳米粒及其制备方法。

实现上述目的的技术方案如下。

具体技术方案如下。

一种中空介孔二氧化硅纳米粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)将乙醇、去离子水、氨水在20～50℃磁力搅拌混合；

(2)将正硅酸乙酯迅速加入步骤1所得产物后继续混合；

(3)将预混的正硅酸乙酯和十八烷基三甲氧基硅烷加入步骤2所得产物后继续混合；

(4)将所得产物离心分离后，取下层沉淀用碳酸钠在20～100℃下蚀刻；

(5)将所得产物真空干燥，300～600℃下煅烧，即得所述中空介孔二氧化硅纳米粒.

在其中一个实施例中，所述乙醇、去离子水、氨水的质量比为：65-75:10:2-4。步骤(2)中，加入的正硅酸乙酯与氨水的用量的体积比为5-7:2-4，步骤(3)中，加入的正硅酸乙酯与氨水的用量的体积比为4-6：2-4，十八烷基三甲氧基硅烷与氨水的用量的体积比为2-4：2-4。

根据上述制备方法得到的中空介孔二氧化硅纳米粒，可以用于作为基因纳米载体，能提高的基因负载率、降低其毒性。

本发明的另一目的是提供一种中空介孔二氧化硅纳米载体。

实现上述目的的技术方案如下。

一种中空介孔二氧化硅纳米载体，由上述中空介孔二氧化硅纳米粒和阳离子脂质体制备而成。

在其中一些实施例中，所述的阳离子脂质体选自Mw＝0.6～2.0的聚乙烯亚胺。

在其中一些实施例中，所述的所述的阳离子脂质体选自Mw＝1.6～2.0的聚乙烯亚胺。

在其中一些实施例中，所述的中空介孔二氧化硅纳米粒与阳离子脂质体以质量比为120:1～10:1。

在其中一些实施例中，中空介孔二氧化硅纳米粒与阳离子脂质体的质量比为50:1～70:1。

本发明的另一个目的是提供一种中空介孔二氧化硅基因纳米载体。

实现上述目的的技术方案如下。

一种中空介孔二氧化硅基因纳米载体，其有上述的中空介孔二氧化硅纳米载体与基因制备而成。

本发明利用阳离子聚合物聚乙烯亚胺的正电荷性与“质子海绵效应”，结合本发明的所制备的中空介孔二氧化硅纳米粒等，提高基因治疗系统的转染效果。

本发明的中空介孔二氧化硅基因纳米载体的制备方法中，先制备二氧化硅纳米粒，再将介孔二氧化硅层附着在上面，进一步将碱性的碳酸钠加入蚀刻纳米粒，最后将纳米粒超声后与聚乙烯亚胺(PEI)，该方法制备的中空介孔二氧化硅纳米载体与现有的阳离子脂质体相比，中空介孔二氧化硅的存在可以有效减少阳离子脂质体的毒性，从而减少载体在专递基因的过程中对于细胞的负面影响，可以有效减少增加基因的负载量，从而可以增加载体的转染效率。因此，本发明提供的中空介孔二氧化硅基因纳米载体的制备方法，可以有效地解决传统阳离子脂质体毒性大，转染效率低等问题。用本发明所述方法制备的绿色荧光蛋白中空介孔二氧化硅基因纳米载体，其载体细胞毒性下，基因转染效率高(为聚乙烯亚胺2倍)，基因负载量大，且纳米粒表面光滑、球型完整，平均粒径在270nm左右，孔径为10nm。该方法适用于DNA、siRNA、miRNA等结构脆弱、活性敏感的基因，具备临床应用的实际价值。

附图说明

图1分别为实施例1载体扫描电镜图；

图2分别为实施例1载体的透射电镜图；

图3为实施例1载体的电位图；

图4为实施例1载体的GFP-DNA吸附量图；

图5为实施例1所制备的中空介孔二氧化硅基因纳米载体以及1.8kDa PEI、25kDa PEI转染效率图；

图6A和图6B为中空介孔二氧化硅基因纳米载体以及25kDa PEI细胞毒性图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

在其中一个实施例中，本发明提供了一种中空介孔二氧化硅纳米粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)将醇类、去离子水、氨水在20～50℃(更优选为25～35℃)磁力搅拌混合；

(2)将正硅酸乙酯迅速加入步骤1所得产物后继续混合；

(3)将预混的正硅酸乙酯和十八烷基三甲氧基硅烷加入步骤2所得产物后继续混合；

(4)将所得产物离心分离后，取下层沉淀用碳酸钠在20～100℃(更优选为70～90℃)下蚀刻；

(5)将所得产物真空干燥，300～600℃(更优选为500～600℃)下煅烧，即得所述空介孔二氧化硅纳米粒；所述乙醇、去离子水、氨水的质量比为：65-75:10:2-4。步骤(2)中，加入的正硅酸乙酯与氨水的用量的体积比为5-7:2-4，步骤(3)中，加入的正硅酸乙酯与氨水的用量的体积比为4-6：2-4，十八烷基三甲氧基硅烷与氨水的用量的体积比为2-4：2-4。

然后将所得的空介孔二氧化硅纳米粒与阳离子脂质体以质量比为120～10:1混合(空介孔二氧化硅纳米粒与阳离子脂质体的质量比优选为为50～70:1，最优选为60:1)，得到中空介孔二氧化硅纳米载体。所述的阳离子脂质体选自Mw＝0.6～2.0的聚乙烯亚胺，更优选为Mw＝1.6～2.0的聚乙烯亚胺，最优选为Mw＝1.8的聚乙烯亚胺。

将中空介孔二氧化硅纳米载体与基因混合，得到中空介孔二氧化硅基因纳米载体，所述基因可以选自DNA、siRNA或miRNA中的一种或几种，特别是DNA。

实施例1：绿色荧光蛋白中空介孔二氧化硅纳米载体的制备

本实施例的绿色荧光蛋白中空介孔二氧化硅纳米载体的制备方法包括如下步骤：

1、制备绿色荧光蛋白DNA(GFP-DNA)的制备

取2.5g LB培养基粉，加入100mL蒸馏水，15psi高压下蒸汽灭菌20min。该100mL LB培养基中含有1g蛋白胨，0.5g酵母，1g氯化钠。在生物安全柜中向100mL灭菌的LB培养基中分别加入卡那霉素(使终浓度为50μg/mL)，1mL已转化有绿色荧光蛋白质粒基因(pEGFP)的大肠杆菌。于37.0℃，200rpm振摇培养14～16h。将过夜培养的菌液加入离心管中，室温4000rpm，离心6min收集菌体，弃去上清，用滤纸吸干壁上残余水滴。向留有菌体沉淀的离心管中加入8mL已加入RNase A的P1溶液，涡旋重悬菌体，务必彻底悬浮细菌沉淀。然后加入8mL P2溶液，立即温和地上下翻转6-8次，室温放置5min。再加入8mL溶液P4，立即温和地上下颠倒翻转6-8次，充分混匀，至溶液出现白色分散絮状沉淀。然后室温放置10min。4000rpm离心15min，使白色沉淀沉于管底。将全部溶液小心倒入过滤器CS1中，缓慢推动推柄过滤。将滤液收集至干净的50mL在第(4)步室温放置10min过程中，向吸附柱CP6中加入2.5mL平衡液BL，4000rpm离心4min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀后转移至吸附柱CP6中。室温4000rpm离心4min，倒掉收集管中的废液。重复离心至全部滤液过柱，并将将吸附柱CP6重新放回收集管中。向吸附柱中加入10mL漂洗液PW，4000rpm离心4min。弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。重复漂洗1次。向吸附柱中加入3mL无水乙醇，室温4000rpm离心4min。倒掉收集管中的废液。将吸附柱重新放回收集管中，室温4000rpm离心8min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。再将吸附柱开盖于室温中放置5min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱置于干净的50mL收集管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加1-2mL洗脱缓冲液TB，室温放置5min，然后室温4000rpm离心4min。将50mL离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1.5mL离心管中。以洗脱缓冲液TB为空白，于Nanodrop2000紫外-可见分光光度计中测定DNA浓度以及OD260和OD280。OD280/OD260的范围在1.8-2.0之间为纯度合格。将DNA溶液稀释到一定浓度后放置于-20℃中保存。

2、制备中空介孔二氧化硅纳米粒

71.4mL乙醇、10mL去离子水、3.14mL氨水在30℃下磁力搅拌混合，6mL正硅酸乙酯(TEOS)迅速加到里面混合，继续磁力搅拌一小时。将提前混合的5mLTEOS和3mL十八烷基三甲氧基硅烷迅速加入溶液中继续混合一小时。产物离心分离后，倒掉上清液，将底层产物分散到300mL浓度为0.6M碳酸钠中80℃下，搅拌10个小时。用超纯水将产物清洗至中性后，550℃下煅烧6h。将本实施例制备的中空介孔二氧化硅纳米粒放在贴有导电胶带的金属载物台上，喷金制成扫描电镜样本，在扫描电镜下观察微球外形(结果见图1)。扫描电镜结果显示，本发明所制备的中空介孔二氧化硅纳米粒，表面光滑，球型完整，颗粒规则无粘连。将本实施例制备的中空介孔二氧化硅纳米粒放在贴有导电胶带的金属载物台上，喷金制成透射电镜样本，在透射电镜下观察微球外形(结果见图2)。透射电镜结果显示纳米粒具有良好的中空及孔道结构，分散性良好。

3、制备载有GFP-DNA的中空介孔二氧化硅纳米载体

称取一定量的上述中空介孔二氧化硅纳米粒，加入适量的超纯水，按照120:1、90:1、60:1、30:1、10:1的质量比加入1.8kDa PEI，混合0.5h，得到中空介孔二氧化硅纳米载体。

将步骤1制备的GFP-DNA混合于中空介孔二氧化硅纳米粒中，混合2h。

载有GFP-DNA的中空介孔二氧化硅纳米基因载体制备完成，得到所述的中空介孔二氧化硅基因纳米载体(HMSNs-1.8Da PEI)。

采用马尔文激光粒度仪本实施例制备的中空介孔二氧化硅纳米粒与1.8kDa PEI质量比为60:1的中空介孔二氧化硅基因纳米载体进行电位测量(结果见图3)。结果表明，本发明所制备的中空介孔二氧化硅纳米载体基因电位为36.0±0.473mv。

采用超微量分光光度计(nanodrop2000)对本实施例制备的上述中空介孔二氧化硅基因纳米载体进行DNA吸附量的测量(结果见图4，图中的WR120、WR90、WR60、WR30、WR10对应与上述实验中的“按照120:1、90:1、60:1、30:1、10:1的质量比加入1.8kDa PEI”)。结果表明，本发明所制备的中空介孔二氧化硅纳米载体基因负载量高。

以下实施例中，所用到的本发明所述的中空介孔二氧化硅基因纳米载体都由上述方法制备得到的二氧化硅纳米粒与1.8kDa PEI质量比为60:1的中空介孔二氧化硅纳米载体与GFP-DNA制备得到的。

实施例2：流式细胞仪测中空介孔二氧化硅纳米载体的转染效率

将人结肠癌细胞(Lovo)在传代结束后计数，稀释，24孔板每孔加2*10⁵个细胞，培养24小时后，换无血清培养基，精密称取实施例1所制备的中空介孔二氧化硅纳米粒与1.8kDa PEI质量比为60:1的中空介孔二氧化硅纳米载体120μg与实施例1所制备的GFP-DNA 2μg混合两小时后，得到的中空介孔二氧化硅基因纳米载体(HMSNs-1.8kDaPEI)与人结肠癌细胞(Lovo)培养4小时，换成有血清培养基，培养48小时后加200μL胰酶消化，所得产物装到1.5mL EP管中，1200rpm下离心3min，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗1次，然后再加500μLPBS后用流式细胞仪测Lovo细胞的转染效率，实验结果实施例1所制备的中空介孔二氧化硅纳米基因载体转染效率达到48.60％(结果见图5，参见其中的HMSNs-1.8kDaPEI)。

对比例2：流式细胞仪测阳离子脂质体PEI的转染效率

将人结肠癌细胞(Lovo)在传代结束后计数，稀释，24孔板每孔加2*10⁵个细胞，500μL含血清10％基本培养基(DMEM)37℃，5％CO₂培养24小时后，换无血清培养基，精密称取2μg GFP-DNA与2.606μg 1.8kDa PEI或25kDa PEI混合两小时后与人结肠癌细胞(Lovo)培养4小时，换成有含血清10％DMEM培养基，37℃，5％CO₂培养48小时后加200μl胰酶消化，所得产物装到1.5mLEP管中，1200rpm下离心3min，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗1次，然后再加500μLPBS后用流式细胞仪测Lovo细胞的转染效率，实验结果对比例2中的25kDa PEI转染效率达到25.89％(结果见图5)，1.8kDa PEI和25kDa PEI的转染效果远不如本发明的HMSNs-1.8kDaPEI。

实施例3：酶标仪测中空介孔二氧化硅基因纳米载体的细胞毒性

选取对数期生长细胞，将Lovo细胞以2*104个/孔的密度接种于96孔板，每孔150μL含10％血清培养基，37℃，5％CO2条件下培养24h。吸除原培养基，分别加入以DMEM培养基(不含血清)配制的不同浓度(0、60、120、180、240μg/mL，相对应于图6中的0、60、120、180、240的结果)的实施例1所述的中空介孔二氧化硅基因纳米载体(HMSNs-1.8kDaPEI)溶液100μL，每个浓度3个复孔，其他操作相同，培养24h。吸除原培养基，每孔加入20μL噻唑蓝(MTT)溶液(5mg/mL)与180μL的培养基，在37℃，5％CO2条件下继续孵育4h。吸除培养基，每孔加入150μL DMSO，振摇10min以充分溶液紫色结晶物质，以酶标仪测定各孔的OD值，检测波长为490nm。实验结果中的所述中空介孔二氧化硅基因纳米载体的细胞毒性很小，在浓度为240μg/mL时细胞存活率大于50％(结果见图6A)

对比例3：酶标仪测25kDa PEI的细胞毒性

选取对数期生长细胞，将Lovo细胞以2*104个/孔的密度接种于96孔板，每孔150μL含10％血清培养基，37℃，5％CO2条件下培养24h。吸除原培养基，分别加入以DMEM培养基(不含血清)配制的不同浓度(0、60、120、180、240μg/mL)的25kDa PEI溶液100μL，每个浓度6个复孔，培养24h。吸除原培养基，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)与180μL的培养基，在37℃，5％CO2条件下继续孵育4h。吸除培养基，每孔加入150μL DMSO，振摇10min以充分溶液紫色结晶物质，以酶标仪测定各孔的OD值，检测波长为490nm。实验结果实施例3中的25kDa PEI的细胞毒性比较大，在浓度为240μg/mL时细胞存活率小于50％(结果见图6B)，其毒性大于本发明所述的中空介孔二氧化硅基因纳米载体。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。