对鳞翅目昆虫有活性的苏云金芽孢杆菌δ内毒素组合物及其使用方法

专利名称：：对鳞翅目昆虫有活性的苏云金芽孢杆菌δ内毒素组合物及其使用方法1.0发明背景1.1发明领域本发明总体上涉及分子生物学领域。更具体地讲，某些实施方案涉及含有来自细菌的DNA片段和蛋白的方法和组合物。更具体地讲，本发明涉及来自苏云金芽孢杆菌的编码鳞翅目毒性结晶蛋白的新型基因。披露了用于制备和使用上述DNA片段、编码合成修饰过的Cry蛋白的DNA片段、以及天然和合成结晶蛋白的各种方法，例如，用DNA片段作为诊断探针和蛋白生产的模板，并将蛋白、融合蛋白载体和肽用于各种免疫学和诊断应用中。还披露了制备、利用核酸片段开发含有本文所披露的DNA片段的转基因植物细胞的方法。1.2相关技术的说明几乎所有的大田作用、植物、和商品化种植区都容易受到一种或多种昆虫虫害的侵袭。危害特别大的是鞘翅目和鳞翅目害虫。例如，蔬菜和芸薹作物，如洋蓟、大头菜、arugula、韭、芦笋、扁豆、菜豆、莴苣(例如，头、叶、长叶莴苣)、甜菜、大白菜、黄体芋薯、花茎甘蓝、瓜类(例如，甜瓜、西瓜、crenshaw、密瓜、哈密瓜)、抱子甘蓝、甘蓝、cardoni、胡萝卜、napa、花椰菜、秋葵、洋葱、芹菜、欧芹、鹰嘴豆、欧洲防风、菊苣、豌豆、大白菜、胡椒、芥蓝、马铃薯、黄瓜、南瓜、葫芦、红萝卜、干球洋葱、芜菁甘蓝、茄子、婆罗门参、沙拉菜、冬葱、菊苣、大豆、大蒜、菠菜、叶用葱、西葫芦、生菜、甜菜、甘薯、萝卜、牛皮菜、辣根、番茄、无头甘蓝、萝卜和各种香料作物对下列一种或多种害虫的侵害敏感苜蓿尺蠖、粘虫、甜菜粘虫、洋蓟羽蛾、菜青虫、甘蓝尺蠖、菜螟、玉米穗虫、芹菜食叶虫、横条菜青虫、欧洲玉米钻心虫、菜蛾、绿色三叶草虫、进口菜青虫、甜瓜野螟、杂食性卷叶虫、泡菜虫、树皮虫复合体、盐碱地毛虫、大豆尺蠖、烟草蚜虫、番茄果虫、番茄天蛾、番茄蛲虫、绒毛豆毛虫、和黄条粘虫。类似地，诸如苜蓿、牧草和青贮饲料的牧草作物通常会受到如下害虫的侵害粘虫、牛肉粘虫、苜蓿毛虫、欧洲叩头虫、多种尺蠖和网虫，以及黄条粘虫。果树类和藤本作物，如苹果、杏、樱桃、油桃、桃、梨、李、梅、榅桲、杏仁、栗树、榛树、美洲山核桃、阿月浑子树、核桃、柑橘、黑刺莓、蓝莓、草莓、蔓越橘、红醋栗、罗干莓、悬钩子、草莓、葡萄、萼梨、香蕉、猕猴桃、柿子、石榴、菠萝、热带水果，通常容易受到以下害虫的侵害并落叶瘦果天蛾、卷蛾、粘虫、柑橘夜蛾、香蕉叩头虫、黑头火虫、蓝莓卷叶虫、尺蠖、草莓果虫、柑橘夜蛾、蔓越橘环切虫、东方天幕毛虫、美国白鹅、美国白蛾、欧洲榛卷叶虫、欧洲榛网虫、果树卷叶虫、葡萄卷叶蛾、葡萄卷叶虫、葡萄叶食叶虫、绿色果虫、gummosos-batrachedracommosae、舞毒蛾、山核桃剥壳虫、天蛾、尺蠖、脐橙虫、斜条卷叶虫、杂食性卷叶虫、杂食性尺蠖、橙卷叶蛾、食橙虫、东方果蛾、流行卷叶虫、桃小食心虫、山核桃鞘蛾、斜条卷叶虫、红色卷曲毛虫、糙皮切根虫、盐碱地毛虫、尺蠖、天幕毛虫、thecla-theclabasillides、烟草蚜虫、卷叶蛾、丛生苹果芽蛾、杂色卷叶虫、胡桃毛虫、Western天幕毛虫、和黄条粘虫。大田作物，如欧洲油菜/油菜籽油菜、月见草、meadowfoam、玉米(大田玉米、甜玉米、爆裂玉米)、棉花、蛇麻、西蒙得木、花生、水稻、红花、小型谷物(大麦、燕麦、黑麦、小麦等)、高粱、大豆、向日葵、和烟草通常是以下昆虫的侵害对象，包括粘虫、亚洲及其他玉米钻心虫、条纹向日葵蛾、甜菜粘虫、棉铃虫、甘蓝尺蠖、玉米切根虫(包括Southern和Western变种)、棉叶钻孔虫、菜蛾、欧洲玉米钻心虫、绿色三叶草虫、头蛾、头虫、进口菜青虫、尺蠖(包括Anacamptodesspp.)、斜条卷叶虫、杂食性野螟、豆荚虫、豆荚虫、盐碱地毛虫、西南玉米钻心虫、大豆尺蠖、斑点切根虫、向日葵蛾、烟草蚜虫、烟草天蛾、绒毛豆毛虫。花坛植物、花、观赏植物、蔬菜和盆栽植物通常会受到以下害虫的采食，如粘虫、杜鹃花蛾、甜菜粘虫、菜蛾、天蛾、佛州蕨叶蛾、玉米天蚕虫、尺蠖、夹竹桃蛾、杂食性卷叶虫、杂食性尺蠖和烟草蚜虫。林木、果树、观赏植物、和长坚果的树木以及灌木和其他苗木通常容易受到各种昆虫的侵害，如袋蛾、黑头蚜虫、褐尾蛾、加州橡树虫、冷杉毒蛾、榆尺蠖、美国白蛾、果树卷叶虫、绿条槭树虫、舞毒蛾、短叶松卷蛾、含羞草网虫、松树蝴蝶、红色卷曲毛虫、鞍背刺蛾、鞍形天社蛾、春秋星尺蠖、云杉蚜虫、天幕毛虫、卷叶蛾和西方毒蛾。类似的，草坪草通常会受到诸如粘虫、草地网虫和热带草地网虫的侵害。由于具有商业价值的作物通常是昆虫侵害的目标，因此在很多场合下都需要对环境敏感的控制或根除昆虫侵害的方法。对于农场主、育苗人、种植业者和寻求利用不损害生态的组合物控制昆虫群体的商业区和居民区来说尤其如此。近年来所开发出的应用最广泛的对环境敏感的杀虫制剂已经包含了来自苏云金芽孢杆菌的微生物杀虫剂。苏云金芽孢杆菌是革兰氏阳性细菌，它能产生专门对某些纲和种的昆虫有毒性的结晶蛋白和包含体。业已证实苏云金芽孢杆菌的很多不同的菌株能产生杀虫性结晶蛋白。含有能产生杀虫蛋白的苏云金芽孢杆菌的组合物业已商业化，并被用作环境可以接受的杀虫剂，因为这种组合物对特定的目标昆虫有很高的毒性，但对植物和其他非目标生物没有危害。1.2.1苏云金芽孢杆菌结晶蛋白δ内毒素δ内毒素被用于控制多种食叶毛虫和甲虫以及蚊子。这些蛋白类伴胞晶体又被称作杀虫结晶蛋白、结晶蛋白、Bt包含体、结晶包含体、包含体、和Bt毒素，它们是由苏云金芽孢杆菌所产生的一大类杀虫蛋白，这些蛋白在易感的昆虫宿主采食后具有毒性。在过去几十年里，对苏云金芽孢杆菌毒素的结构和功能的研究已经包括了所有主要类型的毒素，尽管这些毒素在特定结构和功能方面存在差别，但总结了结构和功能方面的一般相似性。根据所积累的有关苏云金芽孢杆菌毒素的知识，业已建立了苏云金毒素起作用的一般化模式，并且包括被昆虫采食、溶解在昆虫胃肠中部(胃和小肠的组合)，对消化酶的抗性，有时部分消化作用实际上会“激活”该毒素，与胃肠中部的细胞结合，在昆虫细胞上形成一个孔并破坏细胞内部平衡(English和Slatin，1992)。苏云金芽孢杆菌的一个独特特征是在孢子形成期间产生结晶蛋白，这种蛋白专门对某些纲和种的昆虫有毒性。业已证实很多不同的苏云金芽孢杆菌菌株能产生杀虫结晶蛋白。含有能产生对鳞翅目和双翅目昆虫具有杀虫活性蛋白的苏云金芽孢杆菌菌株的组合物业已被商业化，并被用作环境可以接受的杀虫剂，因为该组合物对特定的目标昆虫有很强的毒性，但对植物和其他非目标生物无害。在过去10年业已对苏云金芽孢杆菌结晶蛋白的杀虫活性机制作了深入研究。业已发现，所述结晶蛋白只是在该蛋白被昆虫采食之后才对昆虫有毒性。昆虫胃肠中部的碱性pH和蛋白水解酶将所述蛋白溶解，因此可以释放出对该昆虫有毒性的成分。这些有毒成分破坏了胃肠中部的细胞，导致昆虫停止进食，并最终使昆虫死亡。因此，业已证实了苏云金芽孢杆菌在对付各种昆虫虫害方面是一种有效的并且对环境无害的杀虫剂。正如Hofte和Whiteliey所指出的(1989)，大多数杀虫性苏云金芽孢杆菌菌株对鳞翅目的昆虫，即毛虫类昆虫有活性。而其他苏云金芽孢杆菌菌株对双翅目昆虫，即苍蝇和蚊子具有杀虫活性，或者同时对鳞翅目和双翅目有杀虫活性。近年来，业已报导了少数几种苏云金芽孢杆菌菌株能产生对鞘翅目昆虫，即甲虫有毒性的结晶蛋白(Krieg等，1983；Sick等，1990；Donovan等，1992；Lambert等，1992a；1992b)。1.2.2编码结晶蛋白的基因很多δ内毒素在其氨基酸序列的相似性方面以不同的程度相关。传统上，所述蛋白以及编码这些蛋白的基因主要是根据其杀虫活性的范围分类的。Hofte和Whiteley的综述(1989)讨论了1990年以前在苏云金芽孢杆菌中鉴定的基因和蛋白，并提供了传统上被用于苏云金芽孢杆菌基因和蛋白命名和分类的方案。cryI基因编码鳞翅目毒性CryI蛋白。cryII基因编码对鳞翅目和双翅目昆虫有毒性的CryII蛋白。cryIII基因编码鞘翅目毒性CryIII蛋白，而cryIV基因编码双翅目毒性CryIV蛋白。根据序列相似性的程度，可将所述蛋白进一步分成亚类；为每一类里关系更密切的蛋白确定分类字符，如CryIA、CryIB、CryIC等。并赋予每一小类里关系更密切的蛋白以下名称，如CryIC1、CryIC2等。最近，提出了一种新的命名法，该方法根据氨基酸序列同源性对Cry蛋白进行分类，而不是根据昆虫定向专一性分类(Crickmore等，1998)。包括单一蛋白的等位变异在内的许多已知毒素的分类方法归纳在以下网站中并定期更新http//www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/。最近一次更新的信息是1999年4月27日的信息，将该信息收作本文参考。1.2.3对鳞翅目有毒的结晶蛋白2.0发明概述由Schnepf等最近所作的综述(1998)披露了源于苏云金芽孢杆菌的杀虫结晶蛋白的多样性。Cry1、Cry2和Cry9类型的Cry蛋白以其对鳞翅目幼虫的毒性而著名，不过，毒性的程度根据目标鳞翅目害虫而有很大不同(Hofte和Whiteley，1989)。例如，Cry1Ac对粘虫、海岸夜蛾具有很弱的毒性，但对烟草蚜虫、烟芽夜蛾具有很强毒性。另外，在一种类型Cry蛋白内的氨基酸序列的微小的差别会对杀虫活性产生很大影响(参见Schnepf等，1998，收作本文参考)。例如，Cry3Ba和Cry3Bb基因具有94％的氨基酸序列相同性，但仅有Cry3Bb对南方玉米切根虫、十一星瓜叶甲具有明显的毒性(Donovan等，1992)。类似的，Cry2Aa和Cry2Ab具有87％的氨基酸序列相同性，但仅有Cry2Aa对蚊子具有毒性(Widner和Whiteley，1990)。VonTersch等(1991)证实Cry1Ac蛋白仅在7个氨基酸上有差别(序列相同性大于99％)，但在杀虫活性方面表现出显著的差异。据Lee等(1996)报导，仅在2个氨基酸位点上有差别的Cry1Ab等位基因在对舞毒蛾的毒性方面表现出有10倍的差别。因此，即使被认为是已知Cry蛋白的等位产物或者属于Cry蛋白亚类的Cry蛋白(Crickmore等，1998)，也可能具有独特的和有用的杀虫特性。国际专利申请号WO98/00546和WO98/40490披露了从苏云金芽孢杆菌中获得的多种Cry1-、Cry2-和Cry9-相关的结晶蛋白。2.1CryDNA片段本发明涉及核酸片段，该核酸片段实际上可以从任何来源分离，它不含总的基因组DNA，并且编码本文所披露的新型肽。编码所述多肽的核酸片段可以编码活性蛋白、一种或多种结晶蛋白的肽或多肽片段、多肽亚基、功能性结构域等。另外，本发明包括可以用本领域技术人员所公知的方法完全在体外合成的核酸片段，该片段编码本文所披露的新型Cry多肽、肽、肽片段、亚基、或功能性结构域。在本文中，术语“核酸片段”是指分离的不含特定物种的总的基因组DNA的多核苷酸分子。因此，编码一种内毒素多肽的核酸片段是指这样一种核酸片段，它包括一种或多种从获得该核酸片段的物种的总的基因组DNA中分离的或纯化的结晶蛋白编码序列，在本发明中，它是革兰氏阳性细菌属芽孢杆菌属的基因组，特别是被称为苏云金芽孢杆菌的芽孢杆菌。术语“核酸片段”包括多核苷酸片段和所述片段的更小的片段，以及重组载体，包括质粒、粘粒、噬菌粒、噬菌体、和病毒等。类似地，含有分离的或纯化的结晶蛋白编码基因的DNA片段是指这样的DNA片段，它除了肽编码序列之外还包括其他因子，如基本上从其他天然存在的基因或蛋白编码序列分离出的调控序列。就此而言，术语“基因”被用于简单地表示功能性蛋白、多肽或肽编码单位。正如本领域技术人员所了解的，该功能性术语包括基因组序列、操纵子序列和更小的工程化基因片段，它能表达或者协助表达蛋白、多肽或肽。另外，该术语包括含有至少一个可操作地连接于一个或多个蛋白编码序列上的启动子、可操作地连接于一个转录终止序列上的表达框。“基本上从其他编码序列分离出的”表示感兴趣的基因(在本发明中是编码全部或部分细菌杀虫结晶蛋白的核酸片段或基因)构成了该DNA片段的编码区的主要部分，并且该DNA片段不含天然存在的编码DNA的大部分，如大的染色体片段或其他功能性核酸片段或基因或操纵子编码区。当然，它是指原始分离的DNA片段，并且不排除随后由人工添加到该片段上的基因、重组基因、合成接头、或编码区。在具体实施方案中，本发明涉及含有编码Cry肽的DNA序列的DNA片段和重组载体，在所述肽的氨基酸序列上包括大体上如以下序列所示的氨基酸序列SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO22、SEQIDNO24、SEQIDNO26、SEQIDNO28、SEQIDNO30、SEQIDNO32、SEQIDNO34、SEQIDNO36、SEQIDNO38、SEQIDNO40、SEQIDNO42、SEQIDNO44、SEQIDNO46、SEQIDNO48、SEQIDNO50和SEQIDNO63。例如，术语“大体上如SEQIDNO2、SEQIDNO4、或SEQIDNO6所示的序列”表示该序列基本上相当于SEQIDNO2、SEQIDNO4或SEQIDNO6的一部分，并且具有较少的氨基酸与这些序列中任一个的氨基酸序列不同或者在生物学功能方面相同。术语“生物学功能相同”为本领域所公知，并且在本文作进一步的定义(例如，说明性实施方案)。因此，与SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO22、SEQIDNO24、SEQIDNO26、SEQIDNO28、SEQIDNO30、SEQIDNO32、SEQIDNO34、SEQIDNO36、SEQIDNO38、SEQIDNO40、SEQIDNO42、SEQIDNO44、SEQIDNO46、SEQIDNO48、SEQIDNO50和SEQIDNO63的氨基酸序列具有大约70％-80％，或者更优选大约81、82、83、84、85、86、87、88、89或大约90％或更优选91、92、93、94、95、96、97、98或大约99％的相同性或功能相同性的氨基酸序列就是“基本上与SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO22、SEQIDNO24、SEQIDNO26、SEQIDNO28、SEQIDNO30、SEQIDNO32、SEQIDNO34、SEQIDNO36、SEQIDNO38、SEQIDNO40、SEQIDNO42、SEQIDNO44、SEQIDNO46、SEQIDNO48、SEQIDNO50和SEQIDNO63所示序列相同的”序列。另外，与SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15、SEQIDNO17、SEQIDNO19、SEQIDNO21、SEQIDNO23、SEQIDNO25、SEQIDNO27、SEQIDNO29、SEQIDNO31、SEQIDNO33、SEQIDNO35、SEQIDNO37、SEQIDNO39、SEQIDNO41、SEQIDNO43、SEQIDNO45、SEQIDNO47、SEQIDNO49和SEQIDNO62的核酸序列具有大约70-80％，或者更优选大约81、82、83、84、85、86、87、88、89或大约90％，更优选91、92、93、94、95、96、97、98或大约99％的相同性或功能相同性的核酸序列就是“基本上与SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15、SEQIDNO17、SEQIDNO19、SEQIDNO21、SEQIDNO23、SEQIDNO25、SEQIDNO27、SEQIDNO29、SEQIDNO31、SEQIDNO33、SEQIDNO35、SEQIDNO37、SEQIDNO39、SEQIDNO41、SEQIDNO43、SEQIDNO45、SEQIDNO47、SEQIDNO49和SEQIDNO62所示序列相同的”序列。还应当理解的是，氨基酸和核酸序列可以包括其他残基，如其他N-或C-末端氨基酸或5’或3’序列，并且仍然基本上与本文所披露的序列之一相同，只要这些序列符合上文所提供的标准，包括保持蛋白的生物学活性，其中涉及到蛋白的表达。例如，末端序列的添加，特别是添加到核酸序列上的末端序列包括位于编码区的5’或3’部分旁侧的非编码序列，或者可以包括各种内部序列，即内含子，已知它存在于基因内部。无论编码序列本身的长度如何，本发明的核酸片段都可以与诸如启动子、聚腺苷酸化信号、添加的限制酶位点、多克隆位点、和其他编码片段等的其他DNA序列组合，因此其总长度可以有很大不同。因此，可以认为几乎可以采用任何长度的核酸片段，其总长度优选受制备的方便性和在预期的重组DNA方案中的应用的限制。例如，可以制备包括一个短的连续片段的核酸片段，所述短的连续片段编码披露于SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO22、SEQIDNO24、SEQIDNO26、SEQIDNO28、SEQIDNO30、SEQIDNO32、SEQIDNO34、SEQIDNO36、SEQIDNO38、SEQIDNO40、SEQIDNO42、SEQIDNO44、SEQIDNO46、SEQIDNO48、SEQIDNO50和SEQIDNO63中的任何一种肽序列，或者该DNA片段与编码披露于SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO22、SEQIDNO24、SEQIDNO26、SEQIDNO28、SEQIDNO30、SEQIDNO32、SEQIDNO34、SEQIDNO36、SEQIDNO38、SEQIDNO40、SEQIDNO42、SEQIDNO44、SEQIDNO46、SEQIDNO48、SEQIDNO50和SEQIDNO63中的任一种肽的DNA序列相同或互补，特别是披露于SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15、SEQIDNO17、SEQIDNO19、SEQIDNO21、SEQIDNO23、SEQIDNO25、SEQIDNO27、SEQIDNO29、SEQIDNO31、SEQIDNO33、SEQIDNO35、SEQIDNO37、SEQIDNO39、SEQIDNO41、SEQIDNO43、SEQIDNO45、SEQIDNO47、SEQIDNO49和SEQIDNO62中的DNA片段。例如，还可以使用长度为大约18个核苷酸的DNA序列，以及长度达到大约10000、大约5000、大约3000、大约2000、大约1000、大约500、大约200、大约100、大约50、以及大约14个碱基对(包括所有中间长度)的DNA序列。可以理解的是，在本发明中“中间长度”表示所引用范围内的任何长度，如18、19、20、21、22、23等；30、31、32等；50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包括大约200-500；500-1000；1000-2000；2000-3000；3000-5000范围内的所有整数；以及包括高达大约1000核苷酸的序列等。可以理解的是，本发明不局限于编码本发明的肽或者编码SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO22、SEQIDNO24、SEQIDNO26、SEQIDNO28、SEQIDNO30、SEQIDNO32、SEQIDNO34、SEQIDNO36、SEQIDNO38、SEQIDNO40、SEQIDNO42、SEQIDNO44、SEQIDNO46、SEQIDNO48、SEQIDNO50和SEQIDNO63的氨基酸序列的特定核酸序列，包括具体披露于SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15、SEQIDNO17、SEQIDNO19、SEQIDNO21、SEQIDNO23、SEQIDNO25、SEQIDNO27、SEQIDNO29、SEQIDNO31、SEQIDNO33、SEQIDNO35、SEQIDNO37、SEQIDNO39、SEQIDNO41、SEQIDNO43、SEQIDNO45、SEQIDNO47、SEQIDNO49和SEQIDNO62中的DNA序列。因此重组载体和分离的DNA片段可以各有不同地包括肽编码区本身、在其基本编码区上具有经由选择的改变或修饰的编码区、或者它可以编码较大的多肽，不过，它包括所述肽编码区或可以编码具有不同氨基酸序列的生物学功能等同的蛋白或肽。本发明的DNA片段包括生物学功能等同的肽。所述序列可能是由密码子简并性和功能等同性所产生的，已知这些现象在氨基酸序列以及由它所编码的蛋白内自然发生。另外，可以通过采用重组DNA技术产生功能性等同蛋白或肽，其中，蛋白质结构的改变可以根据对被改变的氨基酸特性的考虑而进行工程改造。可以通过采用定向诱变技术导入人工设计的改变，例如，导入对蛋白免疫原性或测试变体的改进，以便在分子水平上检测活性。如果需要，人们可以制备融合蛋白和肽，例如，其中，所述肽编码区与具有所需功能的其他蛋白或肽的编码区处在相同的表达单位内，以便于纯化或免疫检测目的(例如，分别为可以通过亲和层析纯化的蛋白和酶标记编码区)。重组载体构成了本发明的另一方面。特别有用的载体是这样的载体，所述DNA片段的编码部分受一个启动子的控制，该部分要么编码完整长度的蛋白要么编码较小的肽。所述启动子可以是与编码本发明的肽的基因天然结合的启动子的形式，例如，利用重组克隆和/或PCRTM技术并结合本文所披露的组合物通过分离位于所述编码片段或外显子上游的5’非编码序列而获得。2.2用CryDNA片段作为杂交探针和引物除了其用于指导本发明的结晶蛋白或肽表达之外，本发明所涉及的核酸序列还具有多种其他用途。例如，在核酸杂交实施方案中，还可将其用作探针或引物。这样，可以设想这样的核酸片段具有特殊用途，该片段包括由至少14个核苷酸长度的连续序列所组成的序列，该序列与SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15、SEQIDNO17、SEQIDNO19、SEQIDNO21、SEQIDNO23、SEQIDNO25、SEQIDNO27、SEQIDNO29、SEQIDNO31、SEQIDNO33、SEQIDNO35、SEQIDNO37、SEQIDNO39、SEQIDNO41、SEQIDNO43、SEQIDNO45、SEQIDNO47、SEQIDNO49和SEQIDNO62的14个核苷酸长度连续DNA片段相同或互补。较长的连续的相同或互补序列，例如，编码每一种多肽的大约20、30、40、50、100、200、500、1000、2000、5000bp等的序列(包括所有中间长度以及达到并包括完整长度基因序列)也可用于某些实施方案中。所述核酸探针与结晶蛋白编码序列专一性杂交的能力使其能够用于检测互补序列在特定样品中的存在。不过，还涉及其他用途，包括将所述序列信息用于制备突变型引物，或用于制备其他基因构建物的引物。具有与SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15、SEQIDNO17、SEQIDNO19、SEQIDNO21、SEQIDNO23、SEQIDNO25、SEQIDNO27、SEQIDNO29、SEQIDNO31、SEQIDNO33、SEQIDNO35、SEQIDNO37、SEQIDNO39、SEQIDNO41、SEQIDNO43、SEQIDNO45、SEQIDNO47、SEQIDNO49和SEQIDNO62的DNA序列相同或互补的由大约14-17或18-25、26-35、36-50或达到并包括大约100-200个核苷酸序列的连续核苷酸片段组成的序列区的核酸分子特别适合作为杂交探针，用于诸如Southern和Northern印迹。较小的片段通常可用于杂交实施方案中，其中，所述连续互补区的长度可以变化，如在大约10-14和大约100-200个核苷酸之间变动，不过根据希望检测的互补序列的长度可以使用更大的连续互补性片段。当然，可以通过其他技术获得片段，例如机械剪切或通过限制酶消化。例如，小的核酸片段可以通过化学方式直接合成该片段而方便地制备，该方法通常是使用自动化寡核苷酸合成仪实现的。另外，还可以通过采用核酸再生技术获得片段，如US4683195和4683202中所披露的PCRTM技术(这两份文献分别被收作本文参考)，将特定的序列导入重组载体中进行重组生产，以及通过分子生物学领域的技术人员所公知的其他重组DNA技术获得。因此，可以利用本发明核苷酸序列的能力与互补的DNA片段选择性地形成双链体分子。根据所设计的用途，人们可能希望采用不同的杂交条件来获得探针对靶序列的不同程度的选择性。如果应用需要较高的选择性，人们通常需要采用相对严格的条件来形成杂合体，例如，人们需要选择较低的盐和/或高温条件，如由大约0.02-0.15M氯化钠在大约50-70℃下所提供的条件。这种选择条件能容许在探针和模板或靶链之间有很少的错配(如果有的话)，并且特别适用于分离结晶蛋白编码DNA片段。通过杂交检测DNA片段为本领域技术人员所公知，并且US4965188和5176995(分别被收作本文参考)中被披露的内容可以作为杂交分析方法的典范。特别涉及披露于下列文献中的内容Maloy等，1990；Maloy，1994；Segal，1976；Prokop，1991；和Kuby，1991。当然，对于某些用途来说，例如，当人们希望利用与潜在的模板杂交的突变引物链制备突变体时或当人们试图从相关物种中分离结晶蛋白编码序列或功能性等同物时，通常需要较低严格的杂交条件，以便能够形成异源双链体。在这种场合下，人们需要采用诸如大约0.15-0.9M盐和大约20-55℃温度的条件。因此，根据相对对照杂交的阳性杂交信号可以方便地鉴定交叉杂交物种。在任何情况下，通常可以理解的是，通过增加甲酰胺的用量可以使条件变得更严格，甲酰胺能以与提高温度相同的方式使杂交的双链体去稳定化。因此，杂交条件可以方便地加以操纵，并因此成为根据需要的结果而选择的常用方法。在某些实施方案中，将本发明的核酸序列与诸如标记物的合适的装置组合用于测定杂交是有利的。有多种合适的标记方法为本领域所公知，包括荧光素、放射性元素、酶促活性或其他配体，如能产生可检测信号的亲和素/生物素。在优选实施方案中，人们有可能希望使用荧光素标记或酶标记，如脲酶或碱性磷酸酶或过氧化物酶，而不是使用放射性元素或其他对环境有害的试剂。对于酶标记来说，已知比色指示底物可用于提供人肉眼或分光光度计可见的形式，以便确定与含有互补核酸的样品的专一性杂交。一般，希望本文所披露的杂交探针即可用作溶液杂交的试剂，又可以在采用固相的实施方案中使用。在涉及固相的实施方案中，将测试DNA(或RNA)吸附或以其他方式固定在特定基质或表面上。然后在需要的条件下应用特定探针与所述固定的单链核酸进行专一性杂交。所述特定条件取决于以所需要特定标准为基础的特定环境(例如，取决于G+C含量，靶核酸的类型、核酸的来源、杂交探针的大小等)。在洗涤杂交表面以便除去未专一性结合的探针分子之后，通过标记方法检测专一性杂交甚至是定量。2.3重组表达Cry多肽的载体和方法在其他实施方案中，希望通过将所述编码DNA片段置于重组或异源启动子的控制之后而获得某些优点。在本文中，重组或异源启动子是指在正常情况下不与天然环境中的编码结晶蛋白或肽的DNA片段结合的启动子。所述启动子可以包括正常情况下与其他基因结合的启动子和/或从任何细菌、病毒、真核细胞或植物细胞中分离的启动子。当然，重要的是使用能有效指导所述DNA片段在被选择用于表达的类型的细胞、生物或动物体内表达的启动子。将启动子和细胞类型组合用于蛋白表达为分子生物领域的技术人员所公知，例如，参见Sambrook等，1989。所使用的启动子可以是组成型的或诱导型的，并可以在合适的条件下使用，指导导入DNA片段的高水平表达，这在大规模生产重组蛋白或肽时是有优势的。可用于高水平表达的合适的启动子系统包括，但不限于毕赤酵母属载体表达系统(PharmaciaLKB生物技术)。在制备重组蛋白和肽的表达实施方案中，最常用的是较长的DNA片段，以编码完整肽序列的DNA片段为最佳。不过，可以理解的是，使用较段的DNA片段指导结晶肽或表位核心区的表达，如用于制备抗结晶蛋白抗体也属于本发明的范畴。特别有用的是编码长度大约为8-大约50个氨基酸，更优选大约8-大约30个氨基酸，更优选大约8-大约20个氨基酸的肽抗原的DNA片段。所述肽表位可以是这样的氨基酸序列，它包括来自SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO22、SEQIDNO24、SEQIDNO26、SEQIDNO28、SEQIDNO30、SEQIDNO32、SEQIDNO34、SEQIDNO36、SEQIDNO38、SEQIDNO40、SEQIDNO42、SEQIDNO44、SEQIDNO46、SEQIDNO48、SEQIDNO50和SEQIDNO63的连续氨基酸序列。2.4cry转基因和表达Cry多肽的转基因植物在另一方面，本发明提供了用于生产转基因植物的方法，所述转基因植物能表达编码本发明的新型肽和内毒素的核酸片段。生产转基因植物的方法为本领域所公知。一般，该方法包括用含有可操作地连接于编码区上的启动子的DNA片段转化合适的宿主细胞，所述编码区编码CryET31、CryET40、CryET43、CryET44、CryET45、CryET46、CryET47、CryET49、CryET51、CryET52、CryET53、CryET54、CryET55、CryET56、CryET57、CryET59、CryET60、CryET61、CryET62、CryET63、CryET64、CryET66、CryET67、CryET68、CryET72、CryET73和CryET83多肽中的一种或多种。所述编码区通常可操作地连接于转录终止区上，因此，所述启动子能够在所述细胞中启动该编码区的转录，并因此赋予该细胞在体内生产所述多肽的能力。另外，在希望控制、调节、或降低特定重组结晶蛋白在特定转基因细胞中的表达量的场合下，本发明还提供了表达结晶蛋白反义mRNA。用反义mRNA作为控制或降低细胞中感兴趣的特定蛋白的量的手段为本领域所公知。本发明的另一方面包括能表达编码本文所披露的一种或多种新型多肽组合物的基因或基因片段的转基因植物。在本文中，术语“转基因植物”是指整合了DNA序列的植物，该序列包括，但不限于正常情况下可能不存在的基因，正常情况下不会转录成RNA或翻译成蛋白(表达的)的DNA序列，或人们希望导入非转化植物的任何其他基因或DNA序列，如正常情况下存在于非转化植物中的基因，但人们希望对它进行遗传工程改造或改变其表达。可以预料的是，在某些场合下，本发明转基因植物的细胞核或细胞质基因组或这两者业已通过稳定导入cryET31、cryET40、cryET43、cryET44、cryET45、cryET46、cryET47、cryET49、cryET51、cryET52、cryET53、cryET54、cryET55、cryET56、cryET57、cryET59、cryET60、cryET61、cryET62、cryET63、cryET64、cryET66、cryET67、cryET68、cryET72、cryET73和cryET83转基因中的一种或多种而得到增大，这些转基因是天然的、合成修饰的或突变的。在某些场合下，会将一个以上的转基因整合到所述转化宿主植物细胞的一个或多个基因组中。当将一种结晶蛋白编码DNA片段整合到所述植物的基因组中时就是这种情况。在某些场合下，可能需要整合一种、两种、三种、四种或更多种苏云金芽孢杆菌结晶蛋白(天然的或重组工程的)并在转化的转基因植物中稳定地表达。例如，可以导入的优选基因包括来自细菌的结晶蛋白编码DNA序列，特别是本文所披露的从芽孢杆菌中获得的一种或多种序列。高度优选的核酸序列是从苏云金芽孢杆菌中获得的，或者对这些序列中的任一种进行过遗传工程修饰，以便降低或提高该结晶蛋白在所述转化宿主细胞中的杀虫活性。转化植物细胞和制备转基因细胞系的方法为本领域所熟知，并且在本文中加以讨论。当然，用于转化所述细胞的载体、质粒、粘粒、YACs(酵母人工染色体)和DNA片段一般包括本发明的操纵子、基因、或基因衍生的序列，该序列是天然的或合成产生的，特别是编码本文所披露的结晶蛋白的序列。所述DNA结构还可以包括诸如启动子、增强子、多接头的结构，甚至是对所需要的感兴趣的特定基因具有正向或负向调节活性的基因序列。所述DNA片段或基因可以编码天然或修饰过的结晶蛋白，它们可以在所得到的重组细胞中表达，和/或能赋予再生的植物改进了的表型。通过将编码对鳞翅目昆虫有毒性的CryET31、CryET40、CryET43、CryET44、CryET45、CryET46、CryET47、CryET49、CryET51、CryET52、CryET53、CryET54、CryET55、CryET56、CryET57、CryET59、CryET60、CryET61、CryET62、CryET63、CryET64、CryET66、CryET67、CryET68、CryET72、CryET73和CryET83多肽的一种或多种转基因DNA片段整合到所述转基因植物中，这样的转基因植物有可能提高单子叶或双子叶植物的杀虫剂抗性。特别优选的植物包括草坪草、木棉、高粱、棉花、玉米、大豆、燕麦、黑麦、小麦、亚麻、烟草、水稻、番茄、马铃薯、或其他蔬菜、观赏植物和果树等。在一个相关方面，本发明还包括按照上述方法生产的由所述转化植物产生的种子、所述种子的后代，以及由原始转基因植物的后代所产生的种子。所述后代和种子在其基因组中稳定地整合了结晶蛋白编码转基因，所述后代植物以孟德尔形式继承了由导入稳定的转基因所产生的性状。在其基因组中整合了编码CryET31、CryET40、CryET43、CryET44、CryET45、CryET46、CryET47、CryET49、CryET51、CryET52、CryET53、CryET54、CryET55、CryET56、CryET57、CryET59、CryET60、CryET61、CryET62、CryET63、CryET64、CryET66、CryET67、CryET68、CryET72、CryET73和CryET83结晶蛋白或多肽的一种或多种的转基因DNA片段的所有转基因植物都是本发明的方面。正如本领域技术人员所公知的，植物的后代被理解为表示来自该植物的任何后代或任何后裔，但在本发明中它表示还含有所述转基因的任何后代或任何后裔。2.5位点专一诱变位点专一诱变是通过对特定的DNA进行专一性诱变，用于制备特殊的肽、或生物学功能等同蛋白或肽的技术。该技术还提供了一种制备或测试序列变体的方便的手段，例如，通过在DNA中导入一个或多个核苷酸序列变化整合一种或多种上述特征。位点专一诱变技术为本领域所熟知，并且在各种文献中有所说明。一般，本发明的定向诱变是这样进行的，首先获得单链载体或将双链载体的两条链熔化分离，所述载体的序列中包括编码所需肽的DNA序列。制备具有所需突变序列的寡核苷酸引物，通常是合成制备。然后让该引物与所述单链载体退火，并用诸如大肠杆菌聚合酶IKlenow的DNA聚合酶进行处理，以便完成具有突变的链的合成。因此，形成一种异源双链体，其中，一股链编码原有的非突变序列，而第二股链具有所需要的突变。然后用该异源双链体载体转化合适的细胞，如大肠杆菌细胞，并筛选包括具有突变的序列结构的重组载体的克隆。用定向诱变所制备的内毒素编码核酸片段的序列变体提供了一种生产潜在有用的物种的方法，而且并不意味着局限其它可以获得肽的序列变体和编码它的DNA序列的方法。例如，编码所需要的肽序列的重组载体可以用诸如羟基胺的诱变剂进行处理，以便获得序列变体。2.6抗体组合物及其制备方法在特定实施方案中，本发明人试图利用能结合本文所披露的一种或多种多肽的抗体，包括单克隆抗体或多克隆抗体。制备和鉴定抗体的方法为本领域所公知(例如，Harlow和Lane，1988；收作本文参考)。单克隆抗体可以利用众所周知的技术方便地制备；如在美国专利4196265中所披露的技术，该文献被收作本文参考。2.7ELISAs和免疫沉淀ELISAs可用于与本发明组合。现有用于进行ELISAs的多种不同方法。这些方法为本领域技术人员所熟知。基本ELISA方法的例子可以从任何标准分子生物学实验手册中查阅到(例如，Sambrook，Fritsch，和Maniatis著，分子克隆实验室手册，冷泉港，NY冷泉港实验室，1989)。2.8Western印迹本发明的组合物在免疫吸印或Western印迹分析中具有很大用途。实现免疫吸印和Western印迹分析的方法为本领域技术人员所公知(参见Sambrook等，同上)。用于与Western印迹组合的以免疫学为基础的检测方法包括抗所述毒素部分的酶促、放射性标记、或荧光标记的二级抗体，它被认为在这一方面是特别有用的。2.9结晶蛋白筛选和检测试剂盒本发明涉及用于筛选被怀疑含有结晶蛋白多肽或与结晶蛋白相关的多肽或产生多肽细胞的样品的方法和试剂盒。一种试剂盒可以含有本发明的一种或多种抗体，并且还可以含有用于检测样品和本发明抗体之间的相互作用的试剂。所提供的试剂可以是放射性、荧光或酶标记过的，或者是表位或配体标记过的。该试剂盒可以含有一种能够与本发明的核酸或抗体结合或相关作用的已知的放射性标记试剂。所述试剂盒的试剂可以是液体溶液，与固体支持物结合或作为干粉。当所述试剂是以液体溶液形式提供的时，该液体溶液优选是水溶液。当所述试剂是以与固体支持物结合形式提供的时，该固体支持物优选可以是层析介质、具有多个孔的实验平板或显微镜载玻片。当所述试剂是以干粉形式提供时，所述干粉可以通过添加所提供的合适的溶剂进行重建。在另一种实施方案中，本发明涉及免疫检测方法和相关的试剂盒。建议将本发明的结晶蛋白或肽用于检测能与它起反应的抗体，或者按照本发明方法制备的抗体，可将其用于检测结晶蛋白或含有与结晶蛋白相关的表位的肽。一般，所述方法包括首先获得被怀疑含有所述蛋白、肽或抗体的样品，在能有效形成免疫复合物的条件下让所述样品与本发明的抗体或肽接触，然后检测该免疫复合物的存在。一般，免疫复合物形成的检测为本领域所公知，并且可以通过采用多种方法实现。例如，本发明涉及应用ELISA、RIA、免疫吸印(例如，斑点吸印)，或间接免疫荧光技术等。正如本领域所公知的，通过使用二级结合配体，如二级抗体或生物素/亲和素配体结合结构可以获得额外的优势。对于测定用途来说，可以采用需要检测的任何被怀疑含有结晶蛋白或肽或与结晶蛋白相关的肽或抗体的样品。预计，所述实施方案可用于滴定抗原或抗体样品，和用于筛选杂交瘤等。在相关实施方案中，本发明涉及可用于检测样品中结晶蛋白或相关肽和/或抗体的存在的试剂盒的制备。样品可以包括被怀疑含有结晶蛋白或肽的细胞、细胞上清液、细胞悬浮液、细胞提取物、酶部分、蛋白提取物或其他无细胞组合物。一般而言，本发明的试剂盒包括一种合适的结晶蛋白、肽或针对所述蛋白或肽的抗体，以及免疫检测试剂和用于容纳所述抗体或抗原和试剂的装置。所述免疫检测试剂通常包括与所述抗体或抗原结合或与二级结合配体结合的标记。典型的配体可以包括具有结合的标记的针对第一种抗体的二级抗体或抗原或生物素或亲和素(或链霉亲和素)，当然，正如上文所指出的，有多种典型的标记物为本领域所公知，并且所有这样的标记都可用于本发明中。所述容器通常包括可将所述抗体、抗原或检测试剂放入其中的小瓶，并优选进行过合适的分装。本发明的试剂盒通常还包括用于将抗体、抗原和试剂容器容纳在一个密封的装置中进行商业销售的装置。所述容器可以包括可将需要的小瓶装入其中的注塑或吹塑而成的塑料容器。2.10表位核心序列本发明还涉及不含完整细胞和其他肽的蛋白或肽组合物，该组合物包括一种纯化的蛋白或肽，这种蛋白或肽具有能与一种或多种抗结晶蛋白抗体发生免疫交叉反应的表位。具体地讲，本发明涉及源于Cry蛋白或肽的抗原核心序列。在本文中，术语“具有能与一种或多种抗结晶蛋白抗体发生免疫交叉反应的表位”是指一种肽或蛋白抗原，它包括与位于结晶蛋白或多肽上的表位相似的一级、二级或三级结构。相似性水平通常达到这样的程度，使得针对所述结晶蛋白或多肽的单克隆或多克隆抗体能够与所述交叉反应性肽或蛋白抗原结合、起反应或者能够识别该抗原。可将各种免疫测定方法用于所述抗体，例如，Western印迹、ELISA、和RIA等。所有这些方法为本领域技术人员所公知。适用于疫苗中的Cry免疫决定表位和/或其功能等同物的鉴定是比较简单的事情(例如，US4554101；Jameson和Wolf，1988；Wolf等，1988；US4554101)。然后可以通过采用肽合成或重组技术将所述“表位核心序列”的氨基酸序列方便地整合到肽上。用于本发明中的优选的肽通常其长度为大约8-大约20个氨基酸，更优选大约8-15个氨基酸。通过制备包括修饰过的和/或延伸的表位/免疫原性核心序列的合成肽可以实现本发明的特殊优点，这样会产生针对结晶蛋白的“通用”表位肽，特别是CryET31、CryET40、CryET43、CryET44、CryET45、CryET46、CryET47、CryET49、CryET51、CryET52、CryET53、CryET54、CryET55、CryET56、CryET57、CryET59、CryET60、CryET61、CryET62、CryET63、CryET64、CryET66、CryET67、CryET68、CryET72、CryET73和CryET83和相关序列。这些表位核心序列在本发明的特定方面被确定为特定多肽抗原的亲水区。还可将计算化的肽序列分析程序(例如，DNAStar软件，DNAStar公司，Madison，WI)用于设计本发明所披露的合成肽。使用诸如固相方法的常规合成技术(例如，通过使用商业化的肽合成仪，如应用生物系统430A型肽合成仪)可以方便地实现在其序列上包括一个抗原表位的表位序列或肽的合成。2.11生物学功能等同物可以对本发明的肽和编码这些肽的DNA片段的结构进行修饰和改变，但仍然能获得编码具有所需特征的蛋白或肽的功能性分子。下面讨论基于对蛋白的氨基酸进行改变，以便产生一种等同、甚至是改善了的第二代分子。在本发明的特定实施方案中，希望突变的结晶蛋白可用于提高该蛋白的杀虫活性，并因此提高重组转基因在植物细胞中的杀虫活性和/或表达。氨基酸的改变可以通过按照表1所给出的密码子改变DNA序列的密码而实现。表1氨基酸密码子内氨酸AlaAGCAGCCGCGGCU半胱氨酸CysCUGCUGU天冬氨酸AspDGACGAU谷氨酸GluEGAAGAG苯丙氨酸PheFUUCUUU甘氨酸GlyGGGAGGCGGGGGU组氨酸HisHCACCAU异亮氨酸IleIAUAAUCAUU赖氨酸LysKAAAAAG亮氨酸LeuLUUAUUGCUACUCCUGCUU甲硫氨酸MetMAUG天冬酰胺AsnNAACAAU脯氨酸ProPCCACCCCCGCCU谷氨酰胺GlnQCAACAG精氨酸ArgRAGAAGGCGACGCCGGCGU丝氨酸SerSAGCAGUUCAUCCUCGUCU苏氨酸ThrTACAACCACGACU缬氨酸ValVGUAGUCGUGGUU色氨酸TrpWUGG酪氨酸TyrYUACUAU例如可以用某些氨基酸取代一种蛋白结构上的其他氨基酸，而不会明显损失与诸如抗体的抗原结合区或底物分子上的结合位点的相互结合能力。由于正是蛋白的相互作用能力和性质决定了蛋白的生物学功能活性，可以对蛋白序列进行某些氨基酸序列取代，并对其潜在的DNA编码序列进行取代，但仍然能获得具有类似特性的蛋白。因此，本发明人希望可以对所披露的组合物的肽序列或编码所述肽的相应的DNA序列进行各种改变，但不会明显损失其生物学用途或活性。在进行所述改变时，要考虑氨基酸的亲水指数。亲水性氨基酸指数在赋予一种蛋白相互作用生物学功能方面的重要性为本领域所公知(Kyte和Doolittle，1982，被收作本文参考)。人们认为氨基酸的相对亲水特征决定了所得到的蛋白的二级结构，而二级结构又决定了该蛋白与其他分子，例如，酶、底物、受体、DNA、抗体和抗原等的相互作用。根据氨基酸的疏水性和电荷特征给每一种氨基酸确定了亲水指数(Kyte和Doolittle，1982)，它们是异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。本领域众所周知的是，某些氨基酸可以被具有类似亲水指数或得分的其他氨基酸所取代，但仍然能得到具有类似生物学活性的蛋白，即仍然能获得生物学功能等同蛋白。在进行这种改变时，优选取代亲水指数在±2范围内的氨基酸，更优选在±1范围内的氨基酸，更优选在±0.5范围内的氨基酸。本领域还了解的是，类似氨基酸的取代可以根据亲水性有效进行。被收作本文参考的US4554101指出由其相邻氨基酸的亲水性所决定的蛋白的最大局部平均亲水性与该蛋白的生物学特性相关。正如在US4554101中所披露的，氨基酸残基具有以下亲水性值精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5+1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。众所周知的是，氨基酸可以被具有类似亲水性值的其他氨基酸所取代，但仍然能获得生物学等同物，具体地讲，获得一种免疫学等同蛋白。在这种改变中，优选取代其亲水性值在±2范围内的氨基酸，更优选±1范围内的氨基酸，更优选在±0.5范围内的氨基酸。因此，如上文所述，氨基酸取代通常是取决于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，其疏水性、亲水性、电荷和大小等。考虑到了上述各种特征的典型的取代为本领域技术人员所熟知，并且包括精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。2.12杀虫组合物及其使用方法本发明人希望本文所披露的结晶蛋白组合物能特别用作对大田作用、牧草、果树和蔬菜以及观赏植物局部和/或系统使用的杀虫剂。在一种优选实施方案中，生物杀虫组合物包括细菌细胞中油性可流动的悬浮液，所述细菌细胞能表达本文所披露的新型结晶蛋白。所述细胞优选是苏云金芽孢杆菌NRRLB-21921、NRRLB-21922、NRRLB-21923、NRRLB-21924、NRRLB-21925、NRRLB-21926、NRRLB-21927、NRRLB-21928、NRRLB-21929、NRRLB-21930、NRRLB-21931、NRRLB-21932、NRRLB-21933、NRRLB-21934、NRRLB-21935、NRRLB-21936、NRRLB-21937、NRRLB-21938、NRRLB-21939、NRRLB-21940、NRRLB-21941、NRRLB-21942、NRRLB-21943、NRRLB-21944。不过，能表达本文所披露的新型核酸片段并产生结晶蛋白的任何这样的细菌宿主细胞都可以使用，如苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或假单胞菌。在另一个重要实施方案中，所述生物杀虫组合物含有一种水可分散的颗粒。该颗粒含有能表达本文所披露的新型结晶蛋白的细菌细胞。优选的细菌细胞是苏云金芽孢杆菌NRRLB-21921、NRRLB-21922、NRRLB-21923、NRRLB-21924、NRRLB-21925、NRRLB-21926、NRRLB-21927、NRRLB-21928、NRRLB-21929、NRRLB-21930、NRRLB-21931、NRRLB-21932、NRRLB-21933、NRRLB-21934、NRRLB-21935、NRRLB-21936、NRRLB-21937、NRRLB-21938、NRRLB-21939、NRRLB-21940、NRRLB-21941、NRRLB-21942、NRRLB-21943、NRRLB-21944，不过，预计用本文所披露的DNA片段转化过的并且能表达所述结晶蛋白的细菌，如苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或假单胞菌也可以使用。在第三种重要实施方案中，所述生物杀虫组合物含有一种可湿性粉、尘、颗粒、或胶体浓缩物。该粉含有能表达本文所披露的新型结晶蛋白的细菌细胞。优选的细菌细胞是苏云金芽孢杆菌NRRLB-21921、NRRLB-21922、NRRLB-21923、NRRLB-21924、NRRLB-21925、NRRLB-21926、NRRLB-21927、NRRLB-21928、NRRLB-21929、NRRLB-21930、NRRLB-21931、NRRLB-21932、NRRLB-21933、NRRLB-21934、NRRLB-21935、NRRLB-21936、NRRLB-21937、NRRLB-21938、NRRLB-21939、NRRLB-21940、NRRLB-21941、NRRLB-21942、NRRLB-21943、NRRLB-21944细胞，不过，预计用本文所披露的DNA片段转化过的并且能表达所述结晶蛋白的细菌，如苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或假单胞菌也可以使用。可将这种干燥形式的杀虫复合体制成在湿润后能马上溶解的，或者以控制释放、缓释、或其他时间决定形式的溶解。在第四个重要实施方案中，所述杀虫组合物含有一种细菌细胞的水悬浮液，如上述能表达结晶蛋白的细胞。所述水悬浮液可以浓缩母液的形式提供，该母液在使用之前稀释，或者以能直接使用的稀释过的溶液形式提供。对于这些涉及应用细菌细胞的方法来说，含有结晶蛋白基因的细胞宿主可以在任何常用营养培养基中生长，其中，所述DNA结构提供了一种选择优点，提供一种选择培养基，以便基本上所有或所有细胞都具有该苏云金芽孢杆菌基因。然后可以根据常规方法收获这些细胞。另外，可以在收获之前对细胞进行处理。当所述杀虫组合物含有完整的能表达感兴趣蛋白的苏云金芽孢杆菌细胞时，可以用多种方法配制这种细菌。可以通过与各种稀释剂、惰性材料，如无机矿物质(叶硅酸盐、碳酸盐、硫酸盐、和磷酸盐等)或植物材料(粉碎的玉米棒子芯、稻壳和核桃壳等)混合将其作为可湿性粉、颗粒或尘使用。该制剂可以包括分散-粘附佐剂、稳定剂、其他杀虫添加剂或表面活性剂。液体制剂可以是水基的或无水的并被用作泡沫、悬浮液、乳化浓缩液等。其成分可以包括流变剂、表面活性剂、乳化剂、分散剂或聚合物。另外，所述新型杀虫多肽可以通过天然或重组细菌表达系统在体外制备，并分离以便随后在大田中应用。所述蛋白可以存在于粗制细胞裂解液、悬浮液、胶体等中，或者可以进行纯化、精练、缓冲和/或进一步的加工，然后配制成活性杀生物制剂。类似的，在某些场合下，可能希望从能表达结晶蛋白的细菌培养物中分离结晶和/或孢子，并以所述结晶和/或孢子的溶液、悬浮液或胶体制剂作为活性生物杀昆虫组合物使用。无论使用方法如何，所述活性成分都是以杀虫有效的量使用，该有效量根据以下因素而变化，例如，要控制的特定鞘翅目昆虫，要处理的特定植物或作物，环境条件，以及使用该杀虫活性组合物的方法、比例和量。所披露的杀虫组合物可以通过将细菌细胞、结晶和/或孢子悬浮液或分离的蛋白成分与需要的农业上可以接受的载体配制在一起而制成。在以合适的方法使用之前，该组合物以诸如冻干、冷冻干燥、脱水形式制备，或者用含水载体、介质或合适的稀释剂，如盐水或其他缓冲液制备。所制成的组合物可以是粉尘或颗粒材料形式，或者用油(植物油或矿物油)制成的悬浮液，或水或油/水乳液，或作为可湿性粉，或与任何其他适用于农业用途的载体材料组合。合适的农用载体可以是固体或液体，并且为本领域所公知。术语“农业上可以接受的载体”包括所有佐剂、大肠杆菌、惰性成分、分散剂、表面活性剂、增粘剂、粘接剂等，这些成分通常被用于杀虫制备技术中；并且为杀虫制剂领域的技术人员所公知。所述制剂可以与一种或多种液体佐剂混合，并且通过各种方式制备，大肠杆菌，通过用常规制备技术将所述杀虫组合物与合适的佐剂均匀混合、搅拌和/或研磨。本发明的杀虫组合物被用于目标鳞翅目昆虫的环境中，通常通过常规方法，喷洒在要保护的植物或作物的叶面上，优选使用喷雾方法。杀虫应用的强度和持续时间将根据要处理的特定害虫、作物的具体条件以及特定的环境条件而确定。活性成分与载体的比例理所当然地取决于该杀虫组合物的化学性质、溶解度和稳定性，以及所涉及到的特定制剂。其他应用技术包括喷粉、喷洒、浸泡、土壤注射、种子包衣、幼苗包衣、喷雾、烟雾、迷雾、和雾化等也是容易实施的，并且在某些场合下是必须的，例如，会导致根或茎侵害的昆虫，或用于脆弱的蔬菜用植物或观赏植物。这些应用方法同样为本领域技术人员所公知。本发明的杀虫组合物可以单独或者与包括，但不限于其他杀虫剂的其他化合物组合应用于本发明方法中。本发明方法还可用于其他处理剂组合，如表面活性剂、洗涤剂、聚合物或缓释制剂。本发明的杀虫组合物可以制成用于系统性或局部使用。用于环境、系统或叶面使用的杀虫组合物的浓度可以根据特定制剂的性质、使用方法、环境条件、和杀生物活性度而有很大的不同。通常，生物杀虫组合物在应用制剂中的浓度至少占重量的大约1％，并且可以高达(包括)占重量的大约99％。所述多肽组合物的干燥制剂可以占该蛋白组合物重量的大约1-99％或更高，而液体制剂通常包括重量百分比大约为1-99％或更高的活性成分。含有完整细菌细胞的制剂通常含有大约104～107细胞/毫克。所述杀虫制剂可以根据需要一次或多次应用于特定植物或目标区域上，每英亩的常见大田用量为大约50-500克活性成分，或者大约500-1000克活性成分，或者大约1000-5000克或更高活性成分。5.0说明性实施方案的说明5.1本发明的某些优点将苏云金芽孢杆菌杀虫结晶蛋白基因用于杀虫蛋白的植物生产，并因此赋予重要的农艺植物抗虫性在美国和国外正迅速得到商业上的认可。对新的杀虫性状的需求不仅没有减弱而是成功地形成了对植物中cry基因的操纵。例如，对抗虫性发展潜力的关注使得迫切需要组装一种杀虫蛋白武器(即cry基因)，以便提供未来杀虫特征所必需的遗传材料。另外，能产生苏云金芽孢杆菌Cry蛋白的转基因植物仍然容易受到二次虫害的损害，因此，有必要研究针对这些害虫效力改善了的其他Cry蛋白。本发明的苏云金芽孢杆菌结晶蛋白是多种杀虫蛋白的总称，包括若干对鳞翅目菌落有毒性的杀虫蛋白，所述菌落对特定类型的Cry1蛋白有抗性。对多种鳞翅目害虫所作的生物分析证实，这些蛋白具有杀虫活性，并且这些蛋白对多种目标昆虫的效力有所不同。由所述毒素蛋白所引起的昆虫谱系的变化表明作用的不同模式对于未来的抗虫管理策略来说可能是重要的。本发明cry基因的植物表达，可以赋予该宿主植物抗虫性，正如在来自苏云金芽孢杆菌cry基因业已证实了的。5.2探针和引物在另一方面，本发明所提供的DNA序列信息可用于制备具有与本文所披露的特定多核苷酸的基因序列专一性杂交能力的较短的DNA(或RNA)序列。在这些方面，根据特定结晶蛋白基因序列制备了合适长度的核酸探针，例如，根据披露于SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15、SEQIDNO17、SEQIDNO19、SEQIDNO21、SEQIDNO23、SEQIDNO25、SEQIDNO27、SEQIDNO29、SEQIDNO31、SEQIDNO33、SEQIDNO35、SEQIDNO37、SEQIDNO39、SEQIDNO41、SEQIDNO43、SEQIDNO45、SEQIDNO47、SEQIDNO49和SEQIDNO62所示的序列。所述DNA和核酸探针与结晶蛋白编码基因序列专一性杂交的能力使得它们特别适用于多种实施方案。最重要的是，所述探针可用于多种测定中，用于检测特定样品中互补序列的存在。在某些实施方案中，使用寡核苷酸引物是有利的。所述引物的序列是用本发明的多核苷酸设计的，用于通过PCRTM技术检测、扩增或诱变源于苏云金芽孢杆菌的结晶蛋白基因的特定片段。还可以用所述引物通过PCRTM扩增来自其他物种的相关结晶蛋白基因的片段。为了提供本发明的某些优点，用于杂交研究或实验的优选核酸序列包括与结晶蛋白编码序列互补的至少14-30个核苷酸序列，如在SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15、SEQIDNO17、SEQIDNO19、SEQIDNO21、SEQIDNO23、SEQIDNO25、SEQIDNO27、SEQIDNO29、SEQIDNO31、SEQIDNO33、SEQIDNO35、SEQIDNO37、SEQIDNO39、SEQIDNO41、SEQIDNO43、SEQIDNO45、SEQIDNO47、SEQIDNO49和SEQIDNO62中所示序列。至少大约14个核苷酸的长度有助于确保该片段具有形成双链体分子的足够长度，它是稳定的并且具有选择性。通常优选在长度上超过大约14个碱基的互补序列分子，以便提高杂合体的稳定性和选择性，并因此改进所获得的特定杂交分子的质量和程度。人们通常优选设计具有大约14-大约20个核苷酸的基因互补片段的核酸分子，甚至需要更长的互补区。所述片段可以方便地制备，例如，通过化学方法直接合成该片段，采用核酸再生技术，如US4683195和4683202中所披露的PCRTM技术，以上专利被收作本文参考，或者从含有合适的插入片段和合适的限制位点的重组质粒上切除特定的DNA片段。5.3表达载体本发明涉及包括本发明多核苷酸的表达载体。因此，在一种实施方案中，表达载体是包括可操作地连接于编码本发明多肽的编码区上的启动子的分离、纯化DNA分子，该编码区可操作地连接于转录终止区上，以便由所述启动子启动该编码区的转录。在本文中，术语“可操作地连接”表示启动子与编码区的连接形式使得该编码区的转录受该启动子的控制和调节。将启动子可操作地连接于编码区上的方法为本领域所公知。在一种优选实施方案中，编码本发明结晶蛋白的DNA重组表达优选是在芽孢杆菌属宿主细胞中进行的。优选的宿主细胞包括苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、和相关的芽孢杆菌，最优选苏云金芽孢杆菌属的细胞。能在细菌中起作用的启动子为本领域所公知，用于芽孢杆菌结晶蛋白的代表性和优选启动子包括已知结晶蛋白基因启动子中的任一种，包括cryET31、cryET40、cryET43、cryET44、cryET45、cryET46、cryET47、cryET49、cryET51、cryET52、cryET53、cryET54、cryET55、cryET56、cryET57、cryET59、cryET60、cryET61、cryET62、cryET63、cryET64、cryET66、cryET67、cryET68、cryET72、cryET73和cryET83基因启动子。另外，还可以人工制备诱变的或重组结晶蛋白编码基因启动子，并用于促进本文所披露的新型基因片段的表达。在另一种实施方案中，编码本发明结晶蛋白的DNA重组表达是用转化过的革兰氏阴性细菌进行的，如大肠杆菌或假单胞菌宿主细胞。能够使目标多肽在大肠杆菌和其他革兰氏阴性宿主细胞中高水平表达的启动子在本领域中也是众所周知的。当用本发明的表达载体转化植物时，选择在植物中具有启动表达能力的启动子。能在植物中起作用的启动子在本领域中也是公知的。正如所披露的(Poszkowski等，1989；Odell等，1985)可用于在植物中表达所述多肽的启动子是诱变型的、病毒的、合成的、组成型的，时序调控的、空间调控的和空间-时序调控的(Chau等，1989)。还要选择启动子指导转化过的植物细胞或转基因植物的转录编码区的活性能力。结构基因可以由植物组织中的多种启动子启动。启动子可以是能影响双子叶或单子叶植物的接近组成型的，如CaMV35S启动子，或组织专一性或发育专一性的启动子。当启动子是诸如CaMV35S的接近组成型的启动子时，在多种转化过的植物组织中可以提高多肽的表达(例如，愈伤组织、叶片、种子和根)。另外，可以利用含有组织专一性启动子的整合植物载体实现对特定植物组织转化的指导。一种典型的组织专一性启动子是凝集素启动子，它对种子组织有专一性。大豆种子中的凝集素蛋白是由单一基因(Le1)编码的，该基因仅在种子成熟期间表达，并且占总的种子mRNA的2-5％。业已全面鉴定了凝集素基因和种子专一性启动子，并用于在转基因烟草植物中指导种子专一性表达(Vodkin等，1983；Lindstrom等，1990)。将含有编码感兴趣多肽的编码区的表达载体工程改造成受凝集素启动子的控制，并利用诸如原生质体转化方法的方法将该载体导入植物(Dhir等，1991)。所述多肽的表达是专一性地在转基因植物的种子中进行的。由组织专一性启动子转化过的植物细胞所产生的本发明转基因植物可以与由不同的组织专一性启动子转化过的植物细胞所产生的第二种转基因植物进行杂交，以便产生在一种以上特定组织中表现出转化效果的杂交转基因植物。代表性组织专一性启动子有玉米蔗糖合成酶1(Yang等，1990)，玉米醇脱氢酶1(Vogel等，1989)，玉米集光复合体(Simpson，1986)，玉米热激蛋白(Odell等，1985)，豌豆小亚基RuBP羧化酶(Poulsen等，1986；Cashmore等，1983)，Ti质粒甘露氨酸合成酶(Langridge等，1989)，Ti质粒胭脂氨酸合成酶(Langridge等，1989)，矮牵牛查尔酮异构酶(VanTunen等，1988)，菜豆富甘氨酸蛋白1(Keller等，1989)，CaMV35S转录物(Odell等，1985)和马铃薯patatin(Wenzler等，1989)。优选的启动子包括花椰菜花叶病毒(CaMV35S)启动子、S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子，水稻肌动蛋白启动子、玉米组蛋白启动子、融合的CaMV35S-拟南芥属组蛋白启动子、CaMV35S启动子、CaMV19S启动子、nos启动子、Adh启动子、肌动蛋白启动子、组蛋白启动子、核酮糖二磷酸羧化酶启动子、R-等位启动子、根细胞启动子、α-微管蛋白启动子、ABA-诱导型启动子、膨胀诱导型启动子、rbcS启动子、玉米蔗糖合成酶1启动子、玉米醇脱氢酶1启动子、玉米集光复合体启动子、玉米热激蛋白启动子、豌豆小亚基RuBP羧化酶启动子、Ti质粒甘露氨酸合成酶启动子、Ti质粒胭脂氨酸合成酶启动子、矮牵牛查尔酮异构酶启动子、菜豆富甘氨酸蛋白1启动子、CaMV35S转录物启动子、马铃薯patatin启动子、cab启动子、PEP羧化酶启动子和S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子。选择哪一种表达载体以及最终将一种多肽编码区可操作地连接于哪一种启动子上直接取决于所需要的功能特性，例如，蛋白表达的位点和时间，以及要转化的宿主细胞。这些特征是构建重组DNA分子领域所固有的公知局限性。不过，用于实施本发明的载体能够指导可操作地与它连接的多肽编码区的表达。用于在高等植物中基因表达的典型载体为本领域所公知，并且包括源于所披露的根癌农杆菌的肿瘤诱导(Ti)质粒的载体(Rogers等，1987)。不过，已知若干其他的植物整合载体系统能够在植物中起作用，包括所公开的pCaMVCN转移控制载体(Fromm等，1985)。质粒pCaMVCN(购自Pharmacia，Piscataway，NJ)包括花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子。在优选实施方案中，用于表达所述多肽的载体包括能在植物细胞中起作用的选择标记，优选抗药性选择标记。一种优选的抗药性标记是这样的基因，其表达会导致卡那霉素抗性；即含有所披露的胭脂氨酸合成酶启动子，Tn5新霉素磷酸转移酶II(nptII)和胭脂氨酸合成酶3’非翻译区的嵌合基因(Rogers等，1988)。RNA聚合酶能通过发生聚腺苷酸化的位点转录编码DNA序列。通常，位于聚腺苷酸化位点下游数百个碱基对处的DNA序列是转录终止区。这些区是转录的mRNA有效聚腺苷酸化所必需的。制备表达载体的方法为本领域所公知。用于转化植物的表达载体(转化载体)和制备这种载体的方法披露于US4971908，4940835，4769061和4757011中，这些专利的内容被收作本文参考。可以对所述载体进行修饰，以使其含有本发明的编码序列。业已开发了多种方法用于通过互补的粘性末端或平端将DNA可操作地连接到载体上。例如，可以将互补的均聚物尾添加到要插入的DNA片段上和载体DNA上。所述载体和DNA片段然后通过互补均聚物尾之间的亲键结合在一起，形成重组DNA分子。编码具有赋予一种细胞杀虫活性的能力的多肽的编码区优选是CryET31、CryET40、CryET43、CryET44、CryET45、CryET46、CryET47、CryET49、CryET51、CryET52、CryET53、CryET54、CryET55、CryET56、CryET57、CryET59、CryET60、CryET61、CryET62、CryET63、CryET64、CryET66、CryET67、CryET68、CryET72、CryET73和CryET83多肽编码基因。5.7新型多肽的命名本发明人将本发明的多肽随意命名为CryET31、CryET40、CryET43、CryET44、CryET45、CryET46、CryET47、CryET49、CryET51、CryET52、CryET53、CryET54、CryET55、CryET56、CryET57、CryET59、CryET60、CryET61、CryET62、CryET63、CryET64、CryET66、CryET67、CryET68、CryET72、CryET73和CryET83。类似地，还将编码这些多肽的新型核酸序列分别随意命名为cryET31、cryET40、cryET43、cryET44、cryET45、cryET46、cryET47、cryET49、cryET51、cryET52、cryET53、cryET54、cryET55、cryET56、cryET57、cryET59、cryET60、cryET61、cryET62、cryET63、cryET64、cryET66、cryET67、cryET68、cryET72、cryET73和cryET83。根据结晶蛋白内毒素的修订过的命名法而对基因或蛋白命名的正式确定应该由苏云金芽孢杆菌命名协会作出，成立该协会是为了对苏云金芽孢杆菌结晶蛋白进行系统分类。本发明人希望本发明所提供的随意确定的命名能够被官方命名机构采纳作为这些序列的名称。5.8转化过的宿主细胞和转基因植物用含有结晶蛋白编码基因片段的一种或多种表达载体转化细菌、酵母细胞、植物细胞、或完整植株的方法和组合物是本发明的其他方面。由所述转化方法所产生的转基因细菌、酵母细胞、植物细胞、或植物或由所述转基因植物所产生的后代和种子也是本发明的进一步实施方案。转化细菌和酵母细胞的方法为本领域所公知。通常，转化方法与用于转化诸如大肠杆菌或酿酒酵母的其他细菌或酵母的众所周知的方法相似。对植物细胞进行DNA转化的方法包括农杆菌属植物介导的转化、原生质体转化、将基因转入花粉、注射到生殖器官、注射到未成熟的胚胎和粒子轰击。上述每一种方法各自具有独特的优点和不足。因此，将基因导入一种特定植物品系的特定方法对于其他植物品系来说并不一定最有效。但众所周知的是，哪一种方法适用于特定的植物品系。有多种用于将转化DNA片段导入细胞的方法，但并不是所有方法都适用于将DNA输送到植物细胞中。据信，合适的方法实际上包括可将DNA导入细胞的任何方法，如通过农杆菌属感染、直接输送DNA，例如通过PEG介导的原生质体转化(Omirulleh等，1993)，通过脱水/抑制介导的DNA摄取、通过电穿孔、通过用碳化硅纤维激发、通过对DNA包衣的颗粒进行加速等。在某些实施方案中，加速方法是优选的，并且包括，例如，微粒轰击等。用于将DNA导入细胞的技术为本领域技术人员所公知。业已披露了用于将基因导入细胞的四种通用方法(1)化学方法(Graham和vanderEb，1973；Zatloukal等，1992；(2)物理方法，如显微注射(Capecchi，1980)，电穿孔(Wong和Neumann等，1982；Fromm等，1985；US5384253)和基因枪(Johnston和Tang，1994；Fynan等，1993)；(3)病毒载体(Clapp，1993；Lu等1993；Eglitis和Anderson，1988a；1988b)；和(4)受体介导的机制(Curiel等，1991；1992；Wagner等，1992)。5.8.3农杆菌属介导的转移农杆菌属介导的转移是普遍被应用于将基因导入植物细胞的系统，因为DNA可以导入完整的植物组织中，因此没有必要由原生质体再生完整的植株。利用农杆菌属介导的植物整合载体将DNA导入植物细胞为本领域所公知。例如，参见已经公开的方法(Fraley等，1985；Rogers等，1987)。另外，Ti-DNA的整合是一个比较精确的过程，只会产生很少的重组。要转移的DNA区域是由其边界序列确定的，通常将介入DNA插入植物基因组中，正如所披露的(Spielmann等，1986；Jorgensen等，1987)。正如所披露的，现代农杆菌属转化载体能够在大肠杆菌和农杆菌属中复制，可以进行方便地操作(Klee等，1985)。另外，农杆菌属介导的基因转移载体上所取得的最新技术进展业已改善了该载体上基因和限制位点的排列，以便有利于构建能够表达多种多肽编码基因的载体。所披露的载体(Rogers等，1987)具有常见的多接头区，其旁侧是启动子和聚腺苷酸化位点，用于指导所插入的多肽编码基因表达，这样的载体适用于本发明的目的。另外，可将含有有臂和无臂Ti基因的农杆菌用于转化。在农杆菌属介导的转化有效的植物品系上，要选择上述方法，因为基因转移的方便性和特定性质。对叶片和诸如子叶和下胚轴的其他组织所进行的农杆菌属介导的转化似乎局限于农杆菌属能天然感染的植物。农杆菌属介导的转化在双子叶植物中最有效。只有少数的单子叶植物似乎是农杆菌属的天然宿主，尽管正如所披露的，业已用农杆菌属载体在芦笋上生产出了转基因植物(Bytebier等，1987)。因此，在商业上重要的谷类作物，如水稻、玉米和小麦必须用其他方法转化。不过，正如上文所提到的，芦笋的转化也可以用农杆菌属实现(例如，参见Bytebier等，1987)。用农杆菌属转化方法所产生的转基因植物通常在一个染色体上含有一个基因。所述转基因植物可以被称为在添加的基因上是杂合的。不过，因为术语“杂合的”通常被用于表示在一对染色体中的第二个染色体的相同基因座上存在一个互补基因，而在含有一个添加基因的植物中没有这样的基因，因此认为这种植物的更确切的名称应当是独立分离体，因为所添加的外源基因在有丝分裂和减数分裂期间会独立地分离。更优选的是在添加的结构基因上纯合的转基因植物，即含有两个添加的基因的转基因植物，在染色体对的每一个染色体的相同基因座上存在一个基因。纯合的转基因植物可以通过下述步骤获得，如对含有单一的添加基因的独立分离的转基因植物进行有性交配(自交)，让某些所产生的种子发芽，并分析所产生的植株相对于对照(天然的非转基因的)或独立分离的转基因植物而言，羧化酶活性增强。可以理解的是，可以让两种不同的转基因植物交配，以便产生含有两个独立分离的添加的外源基因的后代。合适后代的自交能够产生在编码感兴趣的多肽的两种所添加的外源基因上纯合的植物。还可以与亲本植物进行回交和与非转基因植物进行异型杂交。植物原生质体的转化可以用基于磷酸钙沉淀、聚乙二醇处理、电穿孔、以及上述处理的组合的方法实现(例如，参见Potrykus等，1985；Lorz等，1985；Fromm等，1985；Uchimiya等，1986；Callis等，1987；Marcotte等，1988)。上述系统在不同植物品系上的应用取决于由原生质体再生特定植物品系的能力。业已披露了由原生质体再生禾本科作物的代表性方法(Fujimura等，1985；Toriyama等，1986；Yamada等，1986；Abdullah等，1986)。5.8.4其他转化方法植物原生质体的转化可以用基于磷酸钙沉淀、聚乙二醇处理、电穿孔、以及上述处理的组合的方法实现(例如，参见Potrykus等，1985；Lorz等，1985；Fromm等，1985；Uchimiya等，1986；Callis等，1987；Marcotte等，1988)。业已披露了由原生质体再生禾本科作物的代表性方法(Fujimura等，1985；Toriyama等，1986；Yamada等，1986；Abdullah等，1986)。5.8.5植物中的基因表达尽管近年来在制备能表达诸如苏云金芽孢杆菌结晶蛋白的细菌蛋白的转基因植物方面取得了很大进展，但在植物中表达天然细菌基因的结果通常是失败的。不过，近年来，业已发现若干潜在的因素决定着特定编码序列的蛋白表达水平的程度。例如，科学家现在已经了解到在细胞中保持大量的特定mRNA实际上是一个关键因素。另人遗憾的是，导致编码外源蛋白的mRNA较低的稳定状态水平的原因是多种多样的。首先，完整长度RNA合成的出现机会不高。这可能是由于，诸如在转录期间RNA的提前终止或者是由于在转录期间出人意料的mRNA加工所导致的。其次，完整长度RNA可以在植物细胞中产生，但然后在细胞核中进行加工(剪接、添加聚腺苷酸)，加工的方式产生了无功能的mRNA。如果RNA不是正确合成、终止和聚腺苷酸化的，它就不能转移到细胞质中进行翻译。类似的，在细胞质中，如果mRNA的半衰期缩短(它的半衰期是由它的一级或二级序列决定的)，就会产生数量不足的蛋白产物。另外，翻译效率对mRNA的半衰期也有影响(影响的程度不确定)。另外，每一种RNA分子折叠成一种特定的结构或者是结构家族，该结构是由其序列决定的。任何RNA的特定结构都可能导致在细胞质中具有更高或更低的稳定性。结构本身也可能是mRNA在细胞核中进行加工的决定因素。明显改变RNA的序列有可能对其折叠结构产生大的影响。所述结构本身或特定的结构特征还有可能起着决定RNA稳定性的作用。为了克服外源基因表达中的上述局限，研究人员业已在RNA上鉴定了有可能对RNA的稳定性产生特殊影响的特定序列和信号。因此，在本发明的某些实施方案中，需要优化所披露的核酸片段在植物中的表达。实现这一目的的一种特定方法是通过改变所述细菌基因，以便除去会减弱在转化过的植物细胞中表达的序列或基序。工程改造编码序列以便优化在植物中的表达的过程通常被称为将DNA序列“植物化”。特别成问题的序列是富含A+T的序列。另人遗憾的是，由于苏云金芽孢杆菌具有富含A+T的基因组，必须对天然结晶蛋白基因序列进行修饰，以便优化在植物中的表达。序列基序ATTTA(或在RNA中为AUUUA)业已被认为是哺乳动物细胞mRNA上的去稳定化序列(Shaw和Kamen，1986)。很多存活期短的mRNA具有富含A+T的3’非翻译区，并且，这些区通常具有ATTTA序列，有时候以多拷贝形式或作为多聚体存在(例如，ATTTATTTA...)。Shaw和Kamen证实将不稳定mRNA的3’末端转移到稳定的RNA(珠蛋白或VA1)上，会明显降低该稳定RNA的半衰期。它们还进一步证实了，ATTTA五聚体对稳定的mRNA具有明显的去稳定化作用，并且无论该信号位于其3’末端或者是位于其编码序列内部都能发挥其作用。不过，ATTTA序列的数量和/或该序列所处的序列环境在决定其是否能作为去稳定化序列起作用方面起着重要作用。Shaw和Kamen证实，ATTTA三聚体对mRNA稳定性的影响明显低于五聚体的影响，而二聚体或单聚体对稳定性没有影响(Shaw和Kamen，1987)。要指出的是，ATTTA的多聚体，如五聚体能自动产生富含A+T的区。这被证实是细胞质的作用而不是细胞核的作用。在其他不稳定的mRNA上，ATTTA序列可能只是以单一拷贝存在，但通常包括在富含A+T的区域内。从到目前为止所收集到的动物细胞的数据可以看出，至少在某些情况下ATTTA对稳定性来说是重要的，但尚不可能预测所出现的哪一个ATTTA是去稳定化因子或者在植物中是否会出现这种影响。在动物细胞中对mRNA降解的某些研究还证实了在某些情况下RNA降解可能始于在富含A+T区域上所发生的核酸侵袭。尚不清楚这种裂解作用是否发生在ATTTA序列上。还有例子表明mRNA所具有的不同的稳定性取决于它们被表达的细胞类型或取决于它们被表达时所处的细胞周期的阶段。例如，组蛋白mRNA在DNA合成期间是稳定的，但如果终止DNA合成它就不稳定。某些组蛋白mRNA的3’末端似乎决定着这种作用(Pandey和Marzluff，1987)。这似乎不是由ATTTA引起的，也不清楚是什么控制着该mRNA的有差别的稳定性。另一个例子是在B细胞成熟期间在B淋巴细胞中IgGmRNA稳定性的差别(Genovese和Milcarek，1988)。最后一个例子是突变型β-地中海贫血珠蛋白mRNA的不稳定性。在骨髓细胞中该基因是正常表达的，在这里所述突变型mRNA是不稳定的，而野生型mRNA是稳定的。当所述突变基因在HeLa或L细胞中体外表达时，其突变型mRNA没有表现出不稳定性(Lim等，1988)。上述例子都提供了mRNA的稳定性可以由细胞类型或细胞周期特定因子介导的证据。另外，这种类型的不稳定性与特定序列没有关系。由于上述不确定性，不可能预测哪一种RNA在特定细胞中可能是不稳定的。另外，甚至是ATTTA基序也有可能根据该RNA所存在的细胞的性质而以不同的方式起作用。Shaw和Kamen(1987)业已报导了激活蛋白激酶C可以阻断由ATTTA介导的降解。对于植物和动物的大多数真核mRNA来说，在3’末端添加聚腺苷酸序列是常见的。目前被接受的添加聚腺苷酸的看法是，新生的转录物超过了成熟的3’末端。在该转录物上包含了聚腺苷酸化和形成正确的3’末端的信号。在3’末端所进行的这一加工过程包括裂解mRNA和在成熟的3’末端添加聚腺苷酸。通过在植物和动物mRNA上寻找靠近聚腺苷酸尾的共有序列，有可能鉴定看上去与添加聚腺苷酸和3’末端裂解相关的共有序列。共同的共有序列似乎对于这些加工来说是重要的。这些信号通常是序列AATAAA的变异形式。在动物细胞中，业已鉴定了有功能的该序列的某些变体。在植物细胞中，似乎有多种有功能的序列(Wickens和Stephenson，1984；Dean等，1986)。由于所有这些共有序列都是AATAAA的变体，因此它们都是富含A+T的序列。该序列通常出现在成熟mRNA的聚腺苷酸尾前面15-20bp处。对动物细胞所做的研究表明，该序列与聚腺苷酸的添加和3’成熟相关。在该序列上进行的定向诱变可以破坏其功能(Conway和Wickens，1988；Wickens等，1987)。不过，业已发现，距离推测的聚腺苷酸信号3’末端多达50-100bp的序列也是必要的；即具有正常的AATAAA但在其下游已经被取代或破坏了以至不能正确聚腺苷酸化的基因(Gil和Proudfoot，1984；Sadofsky和Alwine，1984；McDevitt等，1984)。就是说，聚腺苷酸化信号本身不足以完成完整、正确的加工。尚不清楚除了聚腺苷酸信号之外还需要什么样的特殊下游序列，或者是否存在具有该功能的特殊序列。因此，序列分析只能够鉴定潜在的聚腺苷酸化信号。在天然存在的正常聚腺苷酸化的mRNA上，业已观察到了这一过程的中断，是通过改变该mRNA上的聚腺苷酸化信号或其他序列而实现的，可以在功能性mRNA水平上获得显著影响。业已在若干种天然存在的mRNA上观察到了这一结果，到目前为止其结果都是基因专一性的。业已证实，在天然mRNA上，正确的聚腺苷酸化对于mRNA的积累是重要的，并且破坏这一过程可能明显影响mRNA的含量。不过，还没有足够的知识来预测改变正常基因的后果。在异源基因上，更难于预测其后果。不过，所鉴定的推测位点有可能是功能异常的。就是说这些位点有可能不是作为正常的聚腺苷酸位点，而是起着异常位点的作用，从而产生不稳定的mRNA。在动物细胞系统中，AATAAA到目前为止是在mRNA的聚腺苷酸位点上游所鉴定到的最常见的信号，不过，业已发现了至少4种变体(Wickens和Stephenson，1984)。在植物中，所做的研究不是那么多，但已经了解到可以使用类似于AATAAA的多种序列。表2中的植物位点只是在Dean等(1986)的研究中被称为主要和次要，该研究仅分析了三种类型的植物基因。将聚腺苷酸化位点确定为主要或次要仅仅表示其在业已分析的天然存在的基因上作为有功能的位点出现的频率。对于植物来说，这是一个非常有限的数据库。要以任何确定性预测被命名为主要或次要的位点在异源基因中部分或完全起作用的可能性是大还是小是困难的，所述异源基因如编码本发明的结晶蛋白的基因。表2-植物基因上的聚腺苷酸化位点PAAATAAA主要共有位点P1AAATAAT主要植物位点P2AAACCAA次要植物位点P3AATATAA″P4AAATCAA″P5AATACTA″P6AATAAAA″P7AATGAAA″P8AAAGCAT″P9AATTAAT″P10AATACAT″P11AAAAATA″P12AATTAAA次要动物位点P13AAATTAA″P14AAATACA″P15ACATAAA″本发明提供了用于制备合成的植物基因的方法，该基因能以明显高于野生型基因的水平表达其蛋白产物，所述野生型基因此前通常被用于植物转化。在另一方面，本发明还提供了编码非植物蛋白的新型合成植物基因。如上文所述，天然苏云金芽孢杆菌基因在植物中的表达通常是成问题的。苏云金芽孢杆菌基因编码序列的性质不同于植物基因以及在植物中表达的很多其他异源基因。具体地讲，苏云金芽孢杆菌基因的腺苷(A)和胸苷(T)的含量很高(大约62％)，而植物基因和大多数业已在植物中表达的其他细菌基因A+T的含量为45-55％。由于遗传密码的简并性以及任何氨基酸的密码子选择的数量有限，某些芽孢杆菌的结构编码序列上绝大部分“过多的”A+T出现在密码子的第三个位置上。就是说，某些芽孢杆菌的基因在很多密码子中的第三个核苷酸是A或T。因此，A+T的含量能部分决定密码子使用的倾向。另外，已经了解到基因能在它进化的生物体内进化出最大的功能。这意味着来自一种生物的基因上出现的特定核苷酸序列在该生物中除了编码特定的氨基酸片段之外可能不起作用，但它在其他生物中有可能被认为是基因控制因子(如转录启动子或终止子，聚腺苷酸添加位点，内含子剪接位点，或特殊的mRNA降解信号)。另人吃惊的是，这些错读的信号不是异源基因表达的更常见的特征，但可以通过很多生物的相对同源A+T含量(大约50％)来得到部分解释。这种A+T含量加上遗传密码的性质明确限制了任何特定寡核苷酸序列出现的可能性。因此，来自大肠杆菌的A+T含量为50％的基因含有任何特定富含A+T片段的可能性比来自苏云金芽孢杆菌的基因的要低。通常，为了获得S-内毒素基因在植物中的高水平表达，通过对含有该结构基因的DNA进行定向诱变，除去ATTTA序列和推测的聚腺苷酸化信号，对现有的编码S-内毒素的结构编码序列(结构基因)进行修饰。最好是将所有聚腺苷酸化信号和ATTTA序列几乎完全除去，尽管在仅部分除去上述特定序列的情况下也观察到了提高了的表达水平。另外，如果制备编码目标蛋白表达的合成基因的话，要选择密码子，以避免ATTTA序列和推测的聚腺苷酸化信号。对于本发明来说，推测的聚腺苷酸化信号包括，但不一定局限于AATAAA、AATAAT、AACCAA、ATATAA、AATCAA、ATACTA、ATAAAA、ATGAAA、AAGCAT、ATTAAT、ATACAT、AAAATA、ATTAAA、AATTAA、AATACA和CATAAA。在取代ATTTA序列和聚腺苷酸化信号时，优选使用这样的密码子，要避免使用植物基因组中罕见的密码子。对特定的DNA序列进行扫描，以鉴定具有超过4个连续的腺苷或胸苷核苷酸的区域。对A+T区域进行扫描以便寻找潜在的植物聚腺苷酸化信号。尽管5个或更多个连续A或T核苷酸的缺乏消除了大多数植物聚腺苷酸化信号，如果在10个核苷酸中鉴定到了一个以上的次要聚腺苷酸化信号，那么最好改变该区域的核苷酸序列，以便除去上述信号，同时保持原有编码的氨基酸序列。第二个步骤是考虑在第一个步骤中鉴定的富含A+T区域周围的大约15-大约30个核苷酸残基。如果其周围区域的A+T含量低于80％，就要检查该区域的聚腺苷酸化信号。根据聚腺苷酸化信号对该区域所做的改变取决于(1)所存在的聚腺苷酸化信号的数量和(2)主要植物聚腺苷酸化信号的存在。检查延伸区域中植物聚腺苷酸化信号的存在。通过对DNA序列进行定向诱变除去聚腺苷酸化信号。还要检查所述延伸区域中ATTTA序列的多个拷贝，也要通过诱变将该序列除去。破坏含有多个连续A+T碱基或G+C碱基的区域同样是优选的，因为这样的区域被推测为具有由于自身互补性而形成发卡结构的更高的可能性。因此，插入异源碱基对可以降低形成自身互补二级结构的可能性，已知在某些生物中该二级结构能抑制转录和/或翻译。在大多数情况下，使用含有不超过5个连续A+T或G+C的序列可以降低上述负面影响。5.8.6用于诱变的合成寡核苷酸在将寡核苷酸用于诱变时，需要保持正确的氨基酸序列和阅读框，没有将常见的限制位点导入修饰过的基因，如BglII、HindIII、SacI、KpnI、EcoRI、NcoI、PstI和SalI。上述限制位点出现在很多克隆载体的多接头插入位点上。当然，也要避免导入新的聚腺苷酸化信号、ATTTA序列或超过5个A+T或G+C的连续片段。寡核苷酸的优选大小为大约40-大约50个碱基，但在大约18-大约100个碱基内的片段都可以使用。在大多数情况下，在合成片段的两端要保持与模板DNA的至少大约5-大约8个碱基对的同源性，以便确保引物与模板的正确杂交。所述寡核苷酸要避免长于5个碱基对的A+T或G+C的序列。用于取代野生型密码子的密码子如果可能的话优选应当避免TA或CG双联体。密码子是从植物优选的密码子列表中选择的(如下面的表3所示)，以避免在植物基因组中罕见的密码子，并且应当尽量筛选优选将G+C的含量调整到大约50％的密码子。推测具有很多连续的A+T碱基或G+C碱基的区域具有因为自身互补性而形成发卡结构的更大的可能性。优选通过插入异源碱基对破坏该区域，并应当降低形成诸如发卡结构的自身互补性二级结构的可能性，已知这种结构在某些生物中能抑制转录(转录终止子)和翻译(弱化子)。另外，可以制备编码特定氨基酸序列的完全合成的基因，避免出现5个或更多连续的A+T或G+C核苷酸区域。如果可能的话，要选择在密码子中避免出现TA和CG双联体的密码子。密码子使用可以根据植物优选密码子使用表(如表3)进行正常化，并将GC含量优选调整到大约50％。应当对所得到的序列进行检查，以确保具有最少的推测的植物腺苷酸化信号和ATTTA序列。表3-植物中优选的密码子使用氨基酸密码子植物中的利用百分比氨基酸密码子植物中的利用百分比ARGCGA7LEUCUA8CGC11CUC20CGG5CUG10CGU25CUU28AGA29UUA5AGG23UUG30SERUCA14ALAGCA23UCC26GCC32UCG3GCG3UCU21GCU41AGC21GLYGGA32AGU15GGC20THRACA21GGG11ACC41GGU37ACG7ILEAUA12ACU31AUC45PROCCA45AUU43CCC19VALGUA9CCG9GUC20CCU26GUG28HISCAC65GUU43CAU35LYSAAA36GLUGAA48AAG64GAG52ASNAAC72ASPGAC48AAU28GAU52GLNCAA64TYRUAC68CAG36UAU32PHEUUC56CYSUGC78UUU44UGU22METAUG100TRPUGG100同样最好避免应用经常出现在克隆载体上的限制位点。不过，在所述基因上插入若干独特的限制位点对于分析基因表达或构建基因变体来说是有利的。5.8.7“植物化的”基因结构以双链DNA形式存在的植物基因的表达包括通过RNA聚合酶从该DNA的一股链转录mRNA，以及随后在细胞核内对该mRNA初级转录物进行加工。该加工包括向RNA的3’末端添加聚腺苷酸核苷酸的3，非翻译区。DNA向mRNA的转录通常是由被称为启动子的DNA片段调控的。该启动子片段含有一个碱基序列，该序列发出信号使RNA聚合酶与DNA结合，并利用一股DNA链作模板产生相应的RNA链启动mRNA的转录。在现有文献中业已披露了能在植物细胞中起作用的多种启动子，其中包括胭脂氨酸合成酶(NOS)和章鱼氨酸合成酶(OCS)启动子(这两个启动子是由根癌农杆菌的Ti质粒携带的)，花椰菜花叶病毒(CaMV)19S和35S启动子，来自核酮糖二磷酸羧化酶的小亚基光诱导型启动子(ssRUBISCO，一种含量很高的植物多肽)，以及甘露氨酸合成酶(MAS)启动子(Velten等，1984；Velten和Schell，1985)。上述所有启动子都已经被用于产生各种类型的DNA结构，这些结构已经在植物中表达(例如，参见国际专利申请公开流水号WO84/02913)。在本发明中可以使用已知或者发现其能在植物细胞中引起RNA转录的启动子。所述启动子可以从植物或植物病毒中获得，包括，但不局限于CaMV35S启动子和从诸如ssRUBISCO基因的植物基因中分离的启动子。正如下文所披露的，所选择的特定启动子最好能够导致充分的表达，以便产生有效量的蛋白。如果必要，可以对用于本发明的DNA结构(即嵌合的植物基因)中的启动子进行修饰，以便改变其控制特征。例如，可将CaMV35S启动子连接到ssRUBISCO基因部分上，以便在缺少光照的情况下抑制ssRUBISCO的表达，从而产生一种能在叶片中起作用但不能在根中起作用的启动子。所得到的嵌合启动子可以在本发明中使用。因此，对于本说明书来说，术语“CaMV35S启动子”包括CaMV35S启动子的变体，例如，通过与操纵子区连接、随机或控制诱变等所产生的启动子。另外，可以改变所述启动子，使其含有多个“增强子序列”，以便提高基因的表达。由本发明的DNA结构所产生的RNA还含有一个5’非翻译前导序列。该序列可以来自被选择用于表达该基因的启动子，并可以进行特殊修饰，以便增强mRNA的翻译。所述5’非翻译区还可以从病毒RNA、合适的真核基因、或合成基因序列中获得。本发明并不局限于在下面的实施例中所提供的结构。相反，所述非翻译前导序列可以是病毒外被蛋白编码序列的非翻译区的5’末端的一部分，或者是启动子序列的一部分，或者可以来自一种不相关的启动子或编码序列。在任何情况下，起始位点的旁侧序列都最好遵循Kozak(1984)所报导的增强转录启动的翻译共有序列规则。本发明的cryDNA结构还可以含有一个或多个修饰过的或完全合成的结构编码序列，该序列做过改变，以便增强cry基因在植物中的性能。本发明的结构基因可以选择性地编码一种融合蛋白，该蛋白包括氨基末端叶绿体转运肽或分泌信号序列。所述DNA结构还包括一个3’非翻译区。3’非翻译区含有能在植物中起作用的聚腺苷酸化信号，以便导致在病毒RNA的3’末端添加聚腺苷酸。合适的3’区的例子有(1)含有农杆菌属Ti质粒基因的聚腺苷酸化信号的3’转录、非翻译区，如胭脂氨酸合成酶(NOS)基因和(2)植物基因，如大豆储存蛋白(7S)基因，和RuBP羧化酶(E9)基因的小亚基。5.9生产抗虫转基因植物的方法通过用含有重组的cryET31、cryET40、cryET43、cryET44、cryET45、cryET46、cryET47、cryET49、cryET51、cryET52、cryET53、cryET54、cryET55、cryET56、cryET57、cryET59、cryET60、cryET61、cryET62、cryET63、cryET64、cryET66、cryET67、cryET68、cryET72、cryET73和cryET83基因的片段转化诸如植物细胞的合适的宿主细胞，所编码的结晶蛋白的表达(即对鞘翅目昆虫具有杀虫活性的细菌结晶蛋白或多肽)可以导致抗虫植物的产生。举例来说，人们可以用含有苏云金芽孢杆菌结晶蛋白的编码区和一种合适的选择标记的表达载体转化植物胚芽细胞的悬浮液，如小麦或玉米细胞，利用诸如粒子轰击的方法(Maddock等，1991；Vasil等，1992)，将用DNA包衣的微粒输送到受体细胞内。然后由转化过的胚性愈伤组织再生能表达所述杀虫蛋白的转基因植物。转基因植物的形成还可以用本领域已知的其他细胞转化方法实现，如农杆菌属介导的DNA转移(Fraley等，1983)。另外，可以通过将DNA直接转入花粉(Zhou等，1983；Hess，1987；Luo等，1988)、通过将DNA注射到植物的生殖器官(Pena等，1987)、或者通过将DNA直接注射到未成熟的胚胎细胞中然后使脱水的胚胎再水合(Neuhaus等，1987；Benbrook等，1986)将DNA导入植物中。单一的植物原生质体转化体或各种转化过的外殖体再生、发育、和培养植物的方法为本领域所公知(Weissbach和Weissbach，1988)。该再生和生长方法通常包括以下步骤选择转化过的细胞，使这种单一化的细胞通过胚胎发育的常见阶段并通过长根的小植株阶段。以类似方法再生转基因胚胎和种子。然后将所得到的转基因的长根的幼苗种植到诸如土壤的合适的生长介质中。由叶片外殖体发育或再生含有通过农杆菌属导入的编码感兴趣多肽的外源基因的植物可以通过业已公开的本领域所公知的方法实现(Horsch等，1985)。在该方法中，在存在选择试剂的条件下，在能诱导转化过的植物品系的幼苗再生的培养基中培养转化体(Fraley等，1983)。该方法通常能在2-4个月内生成幼苗，然后将这些幼苗转移到合适的根诱导培养基中，该培养基含有选择试剂和抗生素以便抑制细菌生长。在有选择试剂的条件下能长根形成小植株的幼苗随后被移植到土壤或其他培养基中，以便产生根。上述方法根据所采用的具体植物品系而有所不同，这些不同为本领域所公知。如上文所述，优选让再生的植物自花授粉以便产生纯合的转基因植物。或者，让从再生的植物上获得的花粉与由种子长成的在农业上重要的植物，优选自交系进行杂交。相反，用来自上述重要的自交系植物的花粉对再生的植物进行授粉。用本领域技术人员所公知的方法培养含有所需多肽的本发明转基因植物。因此，本发明的转基因植物具有编码CryET31、CryET40、CryET43，CryET44、CryET45，CryET46，CryET47，CryET49，CryET51、CryET52、CryET53、CryET54、CryET55、CryET56、CryET57、CryET59、CryET60、CryET61、CryET62、CryET63、CryET64、CryET66、CryET67、CryET68、CryET72、CryET73和CryET83多肽中的一种或多种的较高含量的编码区(例如，cryET31、cryET40、cryET43、cryET44、cryET45、cryET46、cryET47、cryET49、cryET51、cryET52、cryET53、cryET54、cryET55、cryET56、cryET57、cryET59、cryET60、cryET61、cryET62、cryET63、cryET64、cryET66、cryET67、cryET68、cryET72、cryET73和cryET83基因)。优选的转基因植物是独立的分离体，并且能将该基因及其活性传给其后代。一种更优选的转基因植物在该基因上是纯合的，并且能以有性交配的方式将该基因传给其所有后代。来自转基因植物的种子可以在大田中或温室中生长，并让所得到的性成熟的转基因植物自花授粉，以便产生不分离的植物。来自上述植物的后代成为不分离的品系，例如，优选在大田中，在多种环境条件下评估该品系对鞘翅目昆虫的提高了的杀虫能力。本发明人期望本发明能特别适用于生产具有商业价值的转基因植物，包括各种草坪草、小麦、玉米、水稻、大麦、燕麦，各种观赏植物和蔬菜，以及多种结坚果和水果的树木和植物。5.10定义下面的名词或短语具有下文所提供的含义。表达细胞内过程的组合，包括由诸如结构基因的编码DNA分子所进行的转录和翻译，以便产生多肽。相同性或相同百分比是指两种核酸或蛋白序列之间的相似性程度。两个序列的排比是通过合适的计算机程序完成的。一种被普遍采用和接受的用于进行序列排比的计算机程序是CLUSTALWv1.6(Thompson等，核酸研究，224673-4680，1994)。用匹配的碱基或氨基酸的数量除以碱基或氨基酸的总数，并乘以100，以便获得相同百分比。例如，如果两个具有580个碱基对的序列具有145个匹配的碱基的话，它们的相同百分比为25％。如果两个比较的序列具有不同的长度，就用匹配的数量除以这两种长度中较短的一个。例如，如果在具有200个氨基酸和400个氨基酸的蛋白之间有100个匹配的氨基酸的话，相对较短的序列而言它们的相同百分比为50％。如果较短序列的长度低于150个碱基或50个氨基酸的话，用匹配数量的除以150(对核酸碱基而言)或50(对氨基酸而言)，并乘以100，以便获得相同百分比。启动子一种DNA序列或一组DNA序列上的识别位点，它提供了结构基因的表达控制因子，RNA聚合酶能专一性地结合在它上面，并启动所述基因的RNA合成(转录)。再生由植物细胞(例如，植物原生质体或外殖体)长出植物的过程。结构基因编码一种多肽的多核苷酸序列，该序列能表达以便产生多肽，或者它在其天然宿主细胞中是隐性的或不能够表达，但可以分离并纯化，并可操作地连接于能够在一种或多种类型的宿主细胞中起作用的至少一个启动子上，以便表达所编码的多肽。转化将外源DNA序列(例如，载体、重组DNA分子)导入细胞或原生质体中的过程，其中，所述外源DNA被整合到染色体上或者能够自主复制。转化过的细胞业已通过将外源DNA分子导入其中而改变了它的DNA的细胞。转基因细胞由转化过的细胞产生或再生的或由转基因细胞产生的任何细胞。典型的转基因细胞包括由转化的植物细胞，特别是由转基因植物获得的诸如叶、根、茎的细胞，例如，体细胞或生殖细胞所产生的植物愈伤组织。转基因植物由转化的植物细胞或原生质体所产生的植物或其后代，其中，该植物DNA中含有原先在相同品系的天然的非转基因植物中不存在的导入的外源DNA分子。术语“转基因植物”和“转化过的植物”在本领域中有时候被用作同义语，用来定义其DNA中含有外源DNA分子的植物。不过，将由转化过的植物细胞或原生质体再生的植物或愈伤组织称为转基因植物更科学一些，并且在下文中将采用这一用法。载体能够在宿主细胞中复制和/或能可操作地连接其他DNA片段以便使所连接的片段复制的DNA分子。质粒是一种典型的载体。5.11分离同源基因和基因片段本发明的基因和δ内毒素不仅包括本文所披露的完整长度的序列，而且还包括这些序列的片段或融合蛋白，它们保留了本文所披露的该序列特有的杀虫活性。本领域技术人员可以理解的是，可以通过若干种方法鉴定并获得杀虫性δ内毒素。特定的基因或其部分可以从培养物保藏所获得或者通过合成构建，例如，通过使用基因合成仪。所述基因的变异可以利用产生点突变的标准技术方便地构建。另外，利用商业化的外切核酸酶或内切核酸酶按照标准方法可以制备所述基因的片段。例如，可以利用诸如Bal31的酶或定向诱变从所述基因的末端进行系统的核苷酸切除。另外，可以利用多种其他的限制酶获得编码活性片段的基因。可以用蛋白酶直接获得δ内毒素的活性片段。还可以用本文所披露的技术从芽孢杆菌菌株和/或DNA文库中分离等同的δ内毒素和/或编码所述等同的δ内毒素的基因。例如，可以用本文所披露的并要求保护的δ内毒素的抗体从蛋白混合物中鉴定并分离其他δ内毒素。具体地讲，可以制备针对δ内毒素的最稳定的并且与其他苏云金芽孢杆菌的δ内毒素差别最大的部分的抗体。然后可以利用上述抗体通过免疫沉淀、酶联免疫测定(ELISA)或Western印迹专一性地鉴定具有所述特有的杀虫活性的等同的δ内毒素。用于鉴定本发明的δ内毒素和基因的另一种方法是通过使用寡核苷酸探针。所述探针是具有一个可检测标记的核苷酸序列。正如本领域所公知的，如果所述探针分子和核酸样品能通过在这两种分子之间形成强的键而杂交的话，就有理由认为所述探针和样品是基本上相同的。所述探针的可检测标记提供了用已知方式确定是否发生了杂交的手段。所述探针分析提供了一种鉴定本发明的了不起的δ内毒素基因的快速方法。可以用作本发明探针的核苷酸片段可以利用DNA合成仪通过标准方法合成。在用核苷酸片段作探针时，可以用本领域技术人员所公知的任何合适的标记物标记特定的探针，包括放射性和非放射性标记。典型的放射性标记物包括32P、125I、或35S等。用放射性同位素标记过的探针可以用互补于DNA样品的核苷酸序列利用DNase和DNA聚合酶通过常规的缺口翻译反应构建。然后将所述探针和样品混合在杂交缓冲液中，并保持在合适的温度下，直到发生退火。然后，洗去膜上的外来材料，留下所述样品和结合的探针分子，通常通过放射性自显影和/或液体闪烁技术计数检测并定量。例如，非放射性标记包括生物素或甲状腺素的配体，以及诸如水解酶或过氧化物酶的酶，或诸如荧光素的各种化学发光剂，或诸如荧光素及其衍生物的荧光化合物。还可以用不同类型的标记物在两端对探针进行标记，以便于分离，例如，利用同位素标记物对上述末端进行标记，并用生物素标记物对另一个末端进行标记。双链体的形成和稳定性取决于杂合体两股链之间的显著的互补性，并且正如上文所指出的，允许一定程度的错配。因此，本发明的探针包括所述序列的突变(单一突变和多突变)、缺失、插入、及其组合，其中，所述突变、插入和缺失可以与感兴趣的目标多核苷酸形成稳定的杂合体。可以用多种方法在特定的多核苷酸序列上产生突变、插入和缺失，可以采用本领域技术人员目前所知的方法以及将来会被本领域技术人员所知的其他方法。上述探针上的潜在的变异在某种程度上是由于遗传密码的丰余性。由于丰余性，即有一种以上的编码核苷酸三联体(密码子)可用于编码用来形成蛋白的大多数的氨基酸。因此，不同的核苷酸序列可能编码一种特定的氨基酸。因此，苏云金芽孢杆菌δ内毒素和肽的氨基酸序列可以通过编码该蛋白或肽的相同氨基酸序列的等同的核苷酸序列制备。因此，本发明包括这样的等同核苷酸序列。另外，反向或互补序列是本发明的一方面，并且可以方便地为本领域技术人员所采用。另外业已证实，通过改变氨基酸序列可以构建具有特定结构和功能的蛋白，如果所述改变不会改变该蛋白的二级结构的话(Kaiser和Ketdy，1984)。因此，本发明包括本文所披露的氨基酸序列的突变体，该突变体不改变该蛋白的二级结构，或者如果其结构被改变了的话，其生物学活性被基本上保留。另外，本发明还包括具有编码本发明δ内毒素的全部或部分基因的生物变体。所述变体可以用本领域技术人员所公知的技术制备。例如，可以用紫外线辐射制备宿主生物的变体。类似的，所述变体可以包括无孢子宿主细胞，这种细胞也可以用本领域公知的方法制备。6.0实施例下面的实施例是用于说明本发明的优选实施方案的。本领域技术人员应当理解的是，在实施例中所披露的技术是本发明人发现的能很好实施本发明的代表性技术，因此，可以本认为是实施本发明的组成性的优选方式。不过，在阅读本说明书的前提下，本领域技术人员应当理解的是，在不脱离本发明构思和范围的前提下可以对所披露的具体实施方案进行多种改变，但仍然能获得类似或相似的结果。6.1例1-鉴定含有新型δ内毒素的苏云金芽孢杆菌菌株通过采用特殊DNA探针进行Southern印迹杂交鉴定含有新型杀虫蛋白基因的野生型苏云金芽孢杆菌菌株。发现有24个独特的cry基因与苏云金芽孢杆菌基因中的cry1、cry2或cry9类型的毒素基因相关。采用各种方法克隆所述新型基因，并在苏云金芽孢杆菌的结晶蛋白阴性(Cry-)菌株中表达这些基因。所述方法包括PCRTM扩增编码所述毒素基因的活性部分的cry-相关基因的部分。然后将所述PCRTM产物与来自编码原毒素的C-末端区的cry1Ac基因的片段连接。然后在苏云金芽孢杆菌重组菌株中表达该基因融合体，以便产生杂合的原毒素。在这种场合下，已经认识到所扩增的DNA序列可用于设计杂交探针，用于从野生型苏云金芽孢杆菌菌株中分离编码新型cry基因的完整的编码序列。通过生物测定筛选野生型苏云金芽孢杆菌菌株并鉴定对鳞翅目昆虫的幼虫有毒性的菌株(方法披露于例10中)。然后对活的菌株进行遗传学检查，以便确定它是否含有新型毒素基因。用于进行该测定的方法在下文披露，并且包括从苏云金芽孢杆菌菌株中分离基因组DNA，限制酶消化，Southern印迹杂交，以及分析杂交的限制片段，以便确定在菌株中存在哪一个基因。通过以下方法提取总的基因组DNA。将营养细胞重新悬浮在含有50mM葡萄糖、20mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA和4毫克/毫升溶菌酶的裂解缓冲液中。在37℃下培养该悬浮液1小时。在培养之后，用等体积的苯酚提取该悬浮液一次，然后用等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(50∶48∶2)提取一次，再用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)提取一次。通过添加1/10体积的3M乙酸钠和2倍体积的100％乙醇使DNA从水相中沉淀出来。通过离心收集沉淀的DNA，用70％的乙醇洗涤，并重新悬浮在蒸馏水中。用限制酶ClaI和PstI消化DNA样品。这两种酶的组合所产生的消化片段的形式在用探针wd207(如下文所述)杂交时能够鉴定很多已知的cry1相关的毒素基因。与已知基因的预期片段大小不一致的杂交片段被归类为未知，并且被用作克隆和鉴定的候选片段。通过1.0％的琼脂糖凝胶在1倍TBE(0.089MTris硼酸，0.089M硼酸，0.002MEDTA)中以2伏/厘米凝胶长度的电压电泳一夜对消化的DNA进行大小分离。然后按照Southern的方法(1975)将分离的DNA片段转移到MilliporeImmobilon-NC硝酸纤维素滤膜(Millipore公司，Bedford，MA)上。通过在真空烘箱中在80℃下烤干所述滤膜将DNA片段固定在硝酸纤维素膜上。为了鉴定含有与cry1基因相关的序列的DNA片段，对寡核苷酸wd207的5’末端进行放射性标记，并用作杂交探针。为了对探针进行放射性标记，将1-5皮摩尔wd207添加到含有3微升[γ-32P]ATP(3000Ci/mM，使mCi/毫升)、70mMTris-HCl，pH7.8，10mM氯化镁，5mMDTT，和10单位T4多核苷酸激酶(Promega公司，Madison，WI)的反应物(20微升总体积)中。在37℃下培养该反应物20分钟，使放射性磷酸转移到寡核苷酸的5’末端，并使它能被用作杂交探针。在该分析中所使用的被称为wd207的寡核苷酸探针具有以下序列5’-TGGATACTTGATCAATATGATAATCCGTCACATCTGTTTTTA-3’(SEQIDNO51)将该寡核苷酸设计成能与cry1基因的位于原毒素蛋白水解活化位点下游的保守区专一性杂交。表4给出了某些苏云金芽孢杆菌毒素基因及其与wd207的性质。Wd207序列的方向是颠倒的，并且与cry基因的编码序列相反。表4然后在45℃下在3×SSC(1×SSC＝0.15M氯化钠，0.015M柠檬酸钠)，0.1％SDS、10×Denhardt’s试剂(0.2％BSA、0.2％聚乙烯吡咯烷酮、0.2％Ficoll)和0.2毫克/毫升肝素中将标记过的探针与硝酸纤维素滤膜培养一夜。在该培养阶段之后，在45℃下通过若干次更换3×SSC、0.1％SDS洗涤所述滤膜。然后将滤膜吸干，并在-70℃下对柯达X-OMATARX光胶片(Eastman柯达公司，Rochester，NY)曝光一夜，使用增感屏，以便获得放射性自显影。然后对该放射性自显影进行分析，以便确定哪一种野生型苏云金芽孢杆菌菌株含有可能是新的cry1基因。由于该探针仅有42个核苷酸，限制内切酶ClaI和PstI的识别位点不可能出现在cry1-相关基因的杂交区域内。因此，推测每一个杂交限制片段表示一个cry1相关基因。根据该片段在琼脂糖凝胶中相对已知大小的DNA片段的迁移距离测定杂交限制片段的大小(以千碱基对计算)。所述片的的大小可用于确定该片段是否代表已知的cry1基因。例如，从cry1Ac基因的DNA序列了解到，wd207能够与在用ClaI和PstI消化cry1AcDNA之后所产生的0.43kb的片段杂交。如果一种菌株的S0uthern印迹出现了0.43kb的杂交片段，该菌株就被界定为cry1Ac的可能的基因型。选择不能够轻易地确认为可能基因型的片段作为进一步分析的候选物。由于很多含有cry1的菌株具有一个以上cry1相关基因，给所有片段一个推测的命名。表5-基因和蛋白概述1包括构建含有部分Mbol片段的基因组文库(例4)，构建含有大小筛选的BamHI或HindIII限制片段的基因组文库(例5)，通过PCRTM扩增新型cry和构建新型cry基因融合体(例6)的方法。2杂交探针，包括通过消化cry1Aa基因获得的700bp的EcoRI片段，来自cry2Aa、cryET59、和cryET83基因的基因片段，以及合成的寡核苷酸(wd207，pr56)。6.2例2-鉴定含有新型CRY2相关基因的苏云金芽孢杆菌菌株由苏云金芽孢杆菌的毒素基因的cry2型所编码的蛋白对鳞翅目和双翅目昆虫的幼虫具有活性。通过对从鳞翅目活性菌株中提取的DNA进行Southern印迹杂交分析鉴定新型cry2相关基因。按6.1节所披露的方法分离总基因组DNA。用限制内切核酸酶Sau3A消化该DNA，按上述方法在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳。将消化过的DNA转移到硝酸纤维素滤膜上，以便用含有cry2Aa基因的DNA片段检测。在55℃下进行杂交，洗涤滤膜，并对X光胶片进行曝光，以便获得放射性自显影。在Sau3A消化之后用cry2Aa基因进行的杂交得到了杂交片段的特有形式，从而能够鉴定cry2Aa、cry2Ab、和cry2Ac基因。不同于该杂交形式的杂交片段表明了在该菌株中存在新型cry2相关基因。一旦鉴定一种菌株含有一个或多个新型cry2相关基因，就再次进行Southern印迹杂交。这一过程与上述过程相同，所不同的是，使用另一种限制酶，通常是HindIII。由于向HindIII这样的酶(6碱基裂解酶)对DNA的裂解频率低于Sau3A或MpoI，它更有可能产生含有完整的cry2相关基因的限制片段，然后可以方便地克隆该片段。6.3例3-鉴定含有新型cry9类型基因的苏云金芽孢杆菌菌株设计被称为pr56的cry9专一性寡核苷酸，以便鉴定具有cry9型基因的菌株。该寡核苷酸相当于所述基因的4349-4416号核苷酸(GenBank保藏号Z37527)。Pr56的序列如下5’-AGTAACGGTGTTACTATTAGCGAGGGCGGTCCATTCTTTAAAGGTCGTGCACTTCAGTTAGC-3’(SEQIDNO52)。将苏云金芽孢杆菌分离物成斑或成片涂在SGNB平板上，每一个平板不超过50个分离物，并在25℃下生长一夜。将苏云金芽孢杆菌克隆转移到硝酸纤维素膜上，并将该滤膜放置在新的SGNB平板上使菌落一侧向上，在30℃下生长一夜。然后，将该滤膜放在Whartman滤纸上使菌落一侧向上，在变性溶液(1.5M氯化钠，0.5N氢氧化钠)中浸泡20分钟。在变性后，将该滤膜放在Whartman滤纸上，在中和溶液(3M氯化钠，1.5MTris-HCl，pH7.0)中浸泡20分钟。最后，用3×SSC(1×SSC＝0.15M氯化钠和0.015M柠檬酸钠)洗涤滤膜，以便除去细胞碎片，并在真空烘箱中在80℃下烘烤90分钟。用T4多核苷酸激酶用[γ-32P]ATP对cry9专一性寡核苷酸pr56(大约10皮摩尔)进行末端标记。该标记反应在37℃下进行20分钟，并通过在100℃下培养该反应物3分钟终止反应。在乙醇沉淀之后，将标记过的寡核苷酸重新悬浮在100微升蒸馏水中。在47℃下在6×SSC、10×denhardt’s溶液、0.5％甘氨酸、0.2％SDS中将所述滤膜与cry9专一性探针一起培养一夜。在47℃下用3×SSC、0.1％SDS洗涤滤膜2次，每次15分钟，并在47℃下用1×SSC、0.1％SDS洗涤滤膜2次，每次15分钟。在-70℃下用干燥的滤膜对X-OMATXAR-5胶片(Eastman柯达公司)进行曝光，使用增感屏。所产生的放射性自显影出现了含有能与cry9探针杂交的DNA的苏云金芽孢杆菌的24种分离物。为了鉴定这些菌株中cry9C型基因，设计了对cry9C基因(GenBank保藏号Z37527)专一的两种相反的寡核苷酸引物，以便用于聚合酶链式反应分析。Pr58的序列为5’-CGACTTCTCCTGCTAATGGAGC-3’(SEQIDNO53)。Pr59的序列为5’-CTCGCTAATAGTAACACCGTTACTTGCC-3’(SEQIDNO54)。从被认为含有cry9型基因的苏云金芽孢杆菌的分离物中分离质粒DNA。苏云金芽孢杆菌分离物在30℃下在Luria琼脂平板上生长一夜，并将每一种分离物的二接种环的细胞悬浮在50mM葡萄糖、10mMTris-HCl、1mMEDTA(1×GTE)中，其中含有4毫克/毫升溶菌酶。在室温下培养10分钟之后，用标准碱性裂解方法提取质粒DNA(Maniatis等，1982)。将该质粒DNA重新悬浮在20微升1×TE(10mMTris-HCl、1mMEDTA、pH7.5)中。将2微升质粒DNA制剂用于PCRTM反应。扩增是用Perkin-ElmerDNA热循环仪(Perkin-ElmerCetus，FosterCity，CA)在100微升体积中进行的，使用Perkin-ElmerGeneAmpTM试剂盒中所提供的材料和方法。PCRTM的条件如下95℃30秒，46℃30秒，70℃1分钟；30轮。以cry9基因为模板使用上述引物进行的PCRTM应当得到大约970bp的DNA片段。在能与cry9探针杂交的24个菌株中仅有1个菌株EG9290产生了预测的扩增DNA片段。6.4例4-通过构建MBOI部分消化文库克隆苏云金芽孢杆菌毒素基因在构建基因组DNA文库时使用限制性内切酶MboI是因为它具有4个碱基对的识别序列，该序列通常出现在长的DNA片段上。按6.1节所披露的方法从苏云金芽孢杆菌中分离总基因组DNA。在能对DNA链进行有限的裂解的条件下消化该DNA。业已披露了确定上述条件的方法(Maniatis等，1982)。以这种方式消化DNA，产生了一组基本上随机裂解的、重叠片段，用这些片段制备代表完整基因组的文库。通过在0.6％的琼脂糖，1×TBE凝胶上以2伏/厘米凝胶长度的电压进行琼脂糖凝胶电泳过夜，根据大小分离消化过的DNA片段。用溴化乙锭对凝胶进行染色，以便在长波紫外光下可以观察到消化过的DNA。用剃须刀片切除含有大约9-12kb的DNA片段的凝胶条。通过将该凝胶条放入透析袋中用足够的TE(10mMTris-HCl、1mMEDTA)覆盖该凝胶条从琼脂糖中除去DNA片段。然后将透析袋密封并放入装有1×TBE缓冲液的水平电泳装置中。以100伏的电压用2小时时间将DNA从凝胶条中电洗脱到TE中。除去透析袋中的TE，用苯酚∶氯仿(1∶1)提取，然后用氯仿提取。然后通过乙醇沉淀的标准技术收集DNA片段(参见Maniatis等，1982)。为了在大肠杆菌中建立所述部分消化过的DNA的文库，将所述片段连接到穿梭载体pHT315(Arantes和Lereclus，1991)上。该质粒含有大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌的复制起点，编码对抗生素红霉素和氨苄青霉素的抗性的基因，以及多克隆位点。将所述MboI的片段与BamHI消化过的pHT315混合，所述pHT315用小牛肠或细菌碱性磷酸酶(GibcoBRL，Gaithersburg，MD)处理过，以便除去消化过的质粒上的5’-磷酸，避免该载体本身的重新连接。在纯化之后，将T4连接酶和连接缓冲液(Promega公司，Madison，WI)添加到含有消化过的载体和MboI片段的反应物中。在15℃下培养该反应物一夜，或者在室温下培养1小时，以便MboI片段插入并连接到pHT315载体DNA上。然后按照生产商所介绍的方法将连接混合物导入转化感受态大肠杆菌SURE细胞中(Stratagene克隆系统，LaJolla，CA)。然后将转化过的大肠杆菌细胞铺平板到含有50-75微克/毫升氨苄青霉素的LB琼脂平板上，并在37℃下培养一夜。在每一个平板上生长的数百个氨苄青霉素抗性克隆表明了在上述每一个菌落的细胞中重组质粒的存在。为了分离具有编码毒素基因序列的菌落，首先将所述菌落转移到硝酸纤维素滤膜上。这一目的是通过简单地将圆形硝酸纤维素滤膜(MilliporeHATF08525，Millipore公司，Bedford，MA)直接放置到含有转化过的菌落的LB氨苄青霉素琼脂平板上而实现的。当将所述滤膜从所述平板上缓慢剥去时，粘附在滤膜上的菌落就形成了原始平板上菌落图案的真实的复制品。有来自每一个菌落的足够的细胞留在平板上，这些细胞在37℃下生长5-6小时就能恢复其菌落。然后将该平板在4℃下保存待用。然后用具有转移菌落的硝酸纤维素滤膜放在新的LB氨苄青霉素琼脂平板上，使菌落一侧向上，在37℃下让其生长直径大约1毫米。为了从重组大肠杆菌细胞中释放出DNA，将硝酸纤维素滤膜放在两张Whatman3MM层析纸上(Whatman国际有限公司，Maidstone，英格兰)，使菌落一侧向上，在0.5N氢氧化钠，1.5M氯化钠中浸泡15分钟。这一处理能够裂解细胞并使所释放的DNA变性，使它粘附在硝酸纤维素滤膜上。然后通过将该滤膜放在两张Whatman纸上，使菌落一侧向上，在1M乙酸铵，0.02M氢氧化钠浸泡10分钟，中和该滤膜。在3×SSC中漂洗该滤膜，风干，并在真空烘箱中在80℃下烘烤1小时。然后该滤膜就可以用探针进行杂交研究，以便鉴定不同类型的苏云金芽孢杆菌基因，如在上面的实施例中所披露的。为了鉴定含有克隆的cry1相关基因的菌落，用[γ-32P]ATP和T4多核苷酸激酶对cry1专一性寡核苷酸wd207的5’末端进行标记。将标记过的探针添加到放在3×SSC、0.1％SDS、10×denhardt’s试剂(0.2％BSA、0.2％聚乙烯吡咯烷酮、0.2％Ficoll)、0.2毫克/毫升肝素中的滤膜上，并在47℃下培养一夜。上述条件使得所述标记过的寡核苷酸能与存在于转化的大肠杆菌菌落的硝酸纤维素膜印迹上的相关序列杂交。在培养之后，通过在45℃下若干次更换3×SSC、0.1％SDS洗涤所述滤膜。将滤膜吸干，并在-70℃下对柯达X-OMATATX光胶片(Eastman柯达公司，Rochester，NY)曝光一夜，使用增感屏。通过将放射性自显影上的信号与原始转化平板上的菌落进行比较鉴定含有克隆的cry1-相关序列的菌落。然后在LB氨苄青霉素液体培养基中生长分离的菌落，可以从该培养基中收获细胞，并按照标准碱性裂解微量制备方法制备重组质粒(Manistis等，1982)。然后将质粒DNA用作模板进行必要的DNA测序反应，以便证实克隆的基因是新的。如果所克隆的基因是新的，就将该质粒导入苏云金芽孢杆菌的结晶蛋白阴性菌(Cry-)中，以便能够表达并鉴定所编码的蛋白。上述方法详细披露于以下步骤。6.5例5-克隆特殊的内切酶限制片段在第二节业已结合cry2相关基因披露了鉴定含有新型苏云金芽孢杆菌基因的特殊限制片段的方法。克隆已知大小的限制片段的方法基本上与所述用于克隆MboI片段的方法相同。用限制酶(例如，HindIII)消化DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳，以便根据大小分离其片段。用剃须刀片切除通过Southern印迹分析(例2)所确定的具有适当大小的片段，并将其从凝胶条上电洗脱到TE缓冲液中，然后从TE缓冲液中沉淀。然后将分离的限制片段连接到大肠杆菌/苏云金芽孢杆菌穿梭载体上，并转入大肠杆菌中，以便构建按大小选择的文库。然后按例4所述方法用特殊的基因探针与该文库杂交，以便分离含有克隆的新型基因的菌落。6.6例6-克隆PCRTM扩增的片段一种用于克隆并表达来自苏云金芽孢杆菌新型的cry1基因片段的快速方法是用聚合酶链式反应发展起来的。设计旁侧引物以便与cry1基因的5’末端和内部的保守区退火，除了某些cry3基因之外，大多数苏云金芽孢杆菌cry基因是转录调控的，至少在一定程度上是由含有亲本细胞专一性σE或sigE、σ因子的RNA聚合酶调控的。所述σE-调控的cry基因具有被σE识别的5’启动子序列。比较这些启动子序列发现了明显的序列变异，尽管可以鉴定到共有序列(Baum和Malvar，1995)。设计了一种被称为“sigE”的引物，它含有与cry1AcσE序列相同的序列，该引物能与未鉴定的cry基因的5’末端相关σE启动子序列退火。SigE引物还含有BbuI位点(同切点酶SphI)，以便克隆扩增的片段。SigE引物的序列如下5’-ATTTAGTAGCATGCGTTGCACTTTGTGCATTTTTTCATAAGATGAGTCATATGTTTTAAAT-3’(SEQIDNO55)。被称为KpnR的反向引物能与cry1基因的3’附近的区域退火，该区域通常是保守的。该引物具有一个在cry1A基因之间保守的Asp718位点(同切点酶KpnI)，以便克隆扩增的片段，并能够构建含有Cry1Ac蛋白的羧基末端部分的融合蛋白。KpnR引物的序列如下5’-GGATAGCACTCATCAAAGGTACC-3’(SEQIDNO56)用PerkinElmerDNA热循环仪和以下参数进行PCRTM94℃，2分钟；94℃30秒，40轮；40℃2分钟；72℃3分钟；在72℃下进行20轮培养之后再进行10秒钟的延伸。对标准PCRTM缓冲液(体积100微升)进行改进，使其含有1×TaqExtender缓冲液，sigE和KpnR引物各25微摩尔，0.5-1.5微升Taq(Stratagene公司)和0.5-1.0微升Taq聚合酶。通常，在PCRTM中含有来自新型苏云金芽孢杆菌分离物的1-2微升DNA制剂。用结合了上述引物的cry基因进行的PCRTM能导致大约2.3kb的DNA片段扩增，其旁侧是BbuI和Asp718的限制位点。为了克隆并表达上述基因片段，使用cry1Ac穿梭载体pEG1064。该质粒来自cry1Ac穿梭载体pEG857(Baum等，1990)，进行了以下改进。通过用限制性内切酶NcoI裂解pEG857在cry1Ac编码区内的单一的NcoI位点上产生移码突变，用Klenow聚合酶补平NcoI产生的末端，并用T4连接酶连接所述平端。用类似方法除去位于cry1Ac基因的3’末端的多克隆位点上的Asp718位点，只留下包含在cry1Ac编码序列的单一的Asp718位点。在导入苏云金芽孢杆菌的结晶蛋白阴性菌株内之后由于所述移码突变所得到的不能指导质粒pEG1064结晶蛋白的生产，为了克隆并表达未知的cry基因，用BbuI和Asp718裂解pEG1064，并通过凝胶电泳纯化载体片段。通过PCRTM扩增总的苏云金芽孢杆菌DNA获得未知cry基因的扩增片段，用限制性内切酶BbuI和Asp718进行消化，并连接到pEG1064载体片段的BbuI和Asp718位点上。用以前所披露的电穿孔方法(Mettus和Macaluso，1990)用所述连接混合物转化氯霉素抗性的Cry-苏云金芽孢杆菌菌株EG10368或EG10650。通过相差显微镜评估氯霉素抗性分离物的结晶蛋白生产能力。然后让能形成结晶的分离物(Cry+)在C2液体培养基(Donovan等，1988)中生长，以便获得结晶蛋白用于SDS-PAGE分析和昆虫生物实验。由于发生在cry1Ac基因上的移码突变，从转化体中所获得的结晶蛋白不可能来自载体pEG1064。因此，Cry-转化体含有未知的cry基因片段，该片段在Asp718位点上与cry1Ac基因的3’部分融合。推测该基因融合体在苏云金芽孢杆菌中的转录是由整合在扩增的cry基因片段上的SigE启动子启动的。所述融合蛋白含有未知Cry蛋白的完整的活性毒素区、它能够在苏云金芽孢杆菌中产生结晶。6.7例7-克隆cry9相关基因从苏云金芽孢杆菌菌株EG9290中分离总的DNA用于克隆研究。让EG9290在30℃下在1倍脑心浸渍液、0.5％甘油(BHIG)中生长一夜。在上午，将过夜生长物悬浮在50微升BHIG中，并在30℃下搅拌培养该培养物，直到培养物的Klett读数达到150(红色滤膜)。通过离心收集细胞，悬浮在含有4毫克/毫升溶菌酶和100微克/毫升RNaseA的5毫升1×GTE缓冲液中，并在37℃下培养20分钟。通过添加0.5毫升20％SDS裂解细胞。通过添加2.5毫升7.5M的乙酸铵和1毫升异丙醇使所释放出的DNA沉淀。用玻璃微量移液管缠绕沉淀的DNA将其从混合物中取出，并用80％乙醇洗涤。将DNA重新悬浮在1×TE中，分别用1体积的缓冲过的苯酚和氯仿∶异戊醇(24∶1)提取，并按上述方法沉淀。缠绕取出的DNA用80％乙醇洗涤，风干数分钟，并悬浮在600微升1×TE中。估计DNA的浓度为500微克/毫升。利用部分消化的EG9290DNA的MboI片段和本文所披露的一般方法构建EG9290总DNA的文库。将部分MboI片段插入克隆载体pHT315的单一的BamHI位点，利用电感受态细胞和由Stratagene(LaJolla，CA)所提供的方法以及BioRadGenePulserTM装置(Bio-Rad实验室，Hercules，CA)通过电穿孔将所述连接混合物用于转化抗氨苄青霉素的大肠杆菌SureTM细胞。用32P标记过的探针进行菌落吸印杂交鉴定具有cry9型基因的重组克隆，所述探针由通过用引物pr58和pr59扩增EG9290DNA所产生的推测的cry9C片段组成。通过Mettus和Macaluso(1990)所披露的电穿孔方法用来自大肠杆菌重组克隆的质粒DNA转化抗红霉素的苏云金芽孢杆菌菌株EG10368。将细胞铺平板到含有20微克/毫升红霉素的淀粉琼脂平板上，并在30℃下培养。6天之后，从所述平板上回收具有透明度较低外观的菌落，并划线接种到含有20微克/毫升红霉素的新的淀粉琼脂平板上，以便分离单菌落。通过相差显微镜发现具有透明度较低的外观的菌落能产生大的伴胞包含体/结晶。在液体培养基中评估能产生伴胞包含体/结晶的重组EG10368克隆结晶蛋白产量。将单一菌落接种到含有10微克/毫升红霉素的C2培养基，并在30℃下生长3天，在此期间，该培养物充分产生了孢子并裂解。通过离心使孢子和结晶沉淀，并重新悬浮在20mMTris-HCl、1mMEDTA，pH7.0中。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析该材料的样品。发现最初被确定为9290-2和9290-3的两个EG10368重组克隆能产生特有的大约130kDa的蛋白。将9290-2命名为EG12102，而9290-3被，命名为EG12103。EG12102蛋白被命名CryET59，EG12103蛋白被命名CryET60。利用标准碱性裂解方法由EG12102和EG12103制备质粒DNA。用限制性内切酶XbaI消化该质粒证实这两种菌株具有独特的cry基因。EG12102和EG12103的cry质粒被分别命名为pEG945和pEG946，将其用于通过电穿孔转化抗氨苄青霉素的大肠杆菌SureTM细胞，采用由stratagene公司所提供的电感受态细胞和方法。含有pEG945的大肠杆菌重组菌株被命名为EG12132，含有pEG946的大肠杆菌重组菌株被命名为EG12133。利用Qiagenmidi柱质粒纯化试剂盒和方法(Qiagen公司，Valencia，CA)从所述大肠杆菌重组菌株中纯化pEG945和pEG946。用类似方法从苏云金芽孢杆菌菌株EG6346的aizawai亚种克隆cryET83基因。对来自EG6346的基因组DNA进行Southern印迹分析发现了能与cryET59探针杂交的独特的限制片段。设计一系列简并寡核苷酸引物pr95、pr97和pr98，以便扩增来自基因组DNA的与cry9相关的序列。所述引物的序列如下pr955’-GTWTGGACSCRTCGHGATGTGG-3’(SEQIDNO57)pr975’-TAATTTCTGCTAGCCCWATTTCTGGATTTAATTGTTGATC-3’(SEQIDNO58)pr985’-ATWACNCAAMTWCCDTTRG-3’(SEQIDNO59)其中，D＝A，G；H＝A，C，T；M＝A，C；N＝A，C，G，T；R＝A，G；S＝C，G；和W＝A，T。利用Taq聚合酶、TaqExtenderTM、反向引物pr95和pr97以及总的EG6346DNA进行的PCRTM得到了一种DNA片段，该片段在溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶上看上去很微弱。将该DNA用作利用反向引物pr97和pr98进行第二轮PCRTM的模板。所得到的扩增DNA片段适用于克隆并用作随后的克隆实验的杂交探针。将EG6346DNA的部分消化过的9-12kb的MboI片段连接到克隆载体pHT315的独特的BamHI位点上构建EG6346总DNA的文库。通过菌落吸印杂交鉴定具有cryET83基因的重组大肠杆菌克隆，利用EG6346专一性DNA片段作为化学发光杂交探针，并利用购自NENTM生命科学制品(Boston，MA)的CDP-StarTM核酸化学发光制剂试剂盒制备该杂交探针。将具有cryET83基因的重组质粒命名为pEG397。将含有pEG397的大肠杆菌重组菌株命名为EG11786。将含有pEG397的苏云金芽孢杆菌重组菌株命名为EG11785。6.8例8-对克隆的苏云金芽孢杆菌毒素基因进行测序按照已经建立的双脱氧链终止DNA测序方法(Sanger等，1977)制定克隆的毒素基因的部分序列。双链质粒模板DNA的制备是用标准显性裂解方法或利用Qiagen质粒纯化试剂盒(Qiagen公司，Valencia，CA)实现的。测序反应是用SequenaseTM2.0版DNA测序试剂盒(美国生物化学/Amersham生命科学公司，Cleveland，OH)，按照生产商的方法，并使用35S-dATP作为标记同位素(购自杜邦NEN研究制品，Boston，MA)进行的。在6％(重量/体积)丙烯酰胺，42％(重量/体积)尿素测序凝胶上进行该反应物的变性凝胶电泳。在室温下让干燥的凝胶对柯达X-OMATARX光胶片(Eastman柯达公司，Rochester，NY)曝光一夜。另外，用自动测序方法对某些cry基因进行测序。用ABIPRISMTM染料脱氧测序化学试剂盒(应用生物系统，FosterCity，CA)按照生产商推荐的方法对DNA样品进行测序。完成的反应物在ABI377自动DNA测序仪上测序。用SequencherTM3.0版DNA分析软件(基因编码公司，AnnArbor，MI)分析DNA序列数据。根据前面反应的测序数据设计用于启动测序反应的连续的寡核苷酸。将利用在例2所披露的寡核苷酸探针wd207所测定的cry1相关基因的序列用作原始测序引物。该寡核苷酸能与cry基因的保守区退火。但由于wd207的方向是颠倒的和相反的，它产生朝向编码区5’末端的序列，使得该基因的可变区的序列可读。通常对250-300个核苷酸进行测序就足于测定该基因的身份。如果需要更多的资料，可以合成一种或多种其他的寡核苷酸，以便延续该序列，直到能够确定该序列是否是单一的。在wd207不能作为引物很好地发挥作用的情况下，使用被设计用于与cry基因的保守区退火的其他寡核苷酸。一种这样的寡核苷酸是上文所披露的KpnR引物。对克隆的cry2相关基因的测序采用所述对cry1基因进行测序的相同的通用方法，所不同的是，使用对cry2基因上的保守区专一的寡核苷酸作为测序引物。用于该实施例中的两种引物是wd268和wd269，如下文所示。引物wd268相当于cry2Aa的579-597号核苷酸5’-AATGCAGATGAATGGGG-3’(SEQIDNO60)。引物wd269相当于cry2Aa的1740-1757号核苷酸5’-TGATAATGGAGCTCGTT-3’(SEQIDNO61)。CryET59和cryET60的测序是用引物pr56开始的。CryET83的测序是用引物pr98开始的。用于测序反应的连续的寡核苷酸是根据以前反应的测序资料设计的。使用PC/GENE序列分析包(Intelligenetics，MoontainView，CA)中的FSTNSCAN程序将所得到的序列与已知cry基因序列进行比较。该分析可以对克隆的cry基因相对已知的cry基因作出初步的分类(表11)。表6.DNA序列的同源性比较11FSTNSCAN的Ktup值设定为2。利用PC/GENE序列分析包中的FASTA程序(Ktup＝6)比较cryET59和cryET60序列。6.9例9-在苏云金芽孢杆菌宿主中表达克隆的毒素基因从通过与一种基因专一性探针杂交鉴定的大肠杆菌菌落中分离质粒DNA。然后利用Mettus和Macaluso(1990)的电穿孔方法将所分离的质粒导入苏云金芽孢杆菌的结晶蛋白阴性菌株中。所使用的每一种克隆载体(参见表5)具有一个能赋予获得该质粒细胞抗生素抗性的基因。通过在含有25毫克/毫升红霉素(pHT315)或5毫克/毫升氯霉素(pEG597或pEG1064)的琼脂平板上生长筛选苏云金芽孢杆菌转化体。然后通过相差显微镜评估抗生素抗性菌落的结晶蛋白生产能力。然后在C2培养基(Donovan等，1988)上生长能产生结晶的菌落，以便获得通过SDS-PAGE和昆虫生物实验进行分析的培养物。用来自Cry+菌落的细胞接种C2培养物，并在25-30℃下，在有合适抗生素的条件下生长3天。在此期间，培养物生长到稳定阶段，产生孢子并裂解，将蛋白包含体释放到培养基中。通过离心收获培养物，离心能够使孢子和结晶沉淀。用0.005％TritonX-100，2mMEDTA溶液洗涤该沉淀，并再次离心。将洗涤的沉淀以1/10原始体积重新悬浮在0.005％TritonX-100，2mMEDTA中。通过在100℃下将该所述悬浮液在溶解缓冲液中培养5分钟将结晶蛋白从孢子-结晶悬浮液中溶解出来。利用丙烯酰胺浓度为10％的凝胶通过SDS-PAGE对溶解的结晶蛋白进行大小分离。在大小分离之后，通过用考马斯亮兰R-250染色观察蛋白。Cry1和Cry9相关结晶蛋白的预期大小大约为130kDa。Cry2相关结晶蛋白的预期大小大约为65kDa。6.10例10-克隆的苏云金芽孢杆菌毒素基因的杀虫活性在C2培养基中生长能产生单一克隆的cry基因的苏云金芽孢杆菌重组菌株，直到该培养物充分地产生孢子并裂解。将C2培养物用于评估所产生的结晶蛋白的杀虫活性。每一种培养物用0.005％TritonX-100进行稀释，以便获得用于两剂生物测定筛选的合适的稀释液。将50微升每一种稀释液局部加样到32个孔中，每一个孔含有1.0毫升人工饮食(表面积为175平方毫米)。在每一个处理过的孔中放入一条鳞翅目幼虫，并用透明的有孔的米拉布覆盖托盘。除了P.xylostella生物实验之外，该实验使用的三龄期幼虫，所有生物实验都是用新生幼虫进行的。在28-30℃下饲养7天之后统计幼虫死亡率，并将百分死亡率表达为死亡的幼虫数量相对处理过的幼虫总数的比例(表12)。在某些场合下，在7天之后观察到了对幼虫生长的严重阻碍，同样记录受到阻碍/未受到阻碍幼虫的比例。在表7中所给出的生物实验结果表明，由重组苏云金芽孢杆菌菌株所产生的结晶蛋白确实具有杀虫活性，而且，该结晶蛋白对所实验过的鳞翅目昆虫具有不同的活性。表7A.用ET结晶蛋白进行的生物实验评估甜菜夜蛾草地贪夜蛾表7B.用ET结晶蛋白进行的生物实验评估PlutellaxylostellaOstrinianubilalis250nl/孔2500nl/孔#受到阻碍250nl/孔2500nl/孔#受到阻碍％死亡率％死亡率/#处理％死亡率％死亡率/#处理Cry1Ac10010001001000ET310201001000ET400680002/32ET4351000461000ET44000003/32ET45000004/32ET46080000ET4710010001001000ET49050000ET51000000ET52243001416/32ET5389704465/32ET5414100025891/32ET56000000ET570970070ET591001000961000ET601001000100960ET610110002/32ET629710001001000ET6310010001001000ET64401000681000ET661001000861000ET678710000791/32ET72000000ET73220931000对照220000表7C.用ET结晶蛋白进行的生物实验评估HeliothisvirescensHelicoverpazea表7D.用ET结晶蛋白进行的生物实验评估AgrotisipsilonTrichoplustani其他的生物实验是用被称为CryET59、CryET60、CryET66和CryET83的结晶蛋白进行的。利用Brussock，S.M.和Currier，T.C.所披露的方法通过SDS-PAGE和粒度测定方法对在C2培养基中所产生的结晶蛋白进行定量1990，“利用SDS-PAGE对苏云金芽孢杆菌δ内毒素进行定量”，参见苏云金芽孢杆菌的分析化学(L.A.Hickle和W.L.Fitch著)，美国化学协会，78-87页。表8-CryET59和CryET60的生物实验评估1AI＝Agrotisipsilon，HV＝Heliothisvirescerns，HZ＝HelicoverpazeaON＝Ostrinianubilalis，PX＝Plutellaxylostella，rPX＝PlutellaxylostellacolonyresistanttoCrylAandCryIFtoxins，SE＝Spodopteraexigua，TN＝Trichoplusiani.2对照＝不添加毒素对所述方法进行改进，以便取消用3MHEPES进行的综合步骤。通过用分子动态模型300A计算密度测定仪和纯化的牛血清白蛋白(Pierce，Rockford，IL)作模板进行的密度测定对通过SDS-PAGE分离的结晶蛋白进行定量。在表8中所示的生物实验结果表明，CryET59和CryET60对多种鳞翅目昆虫有毒素，包括对Cry1A和Cry1F结晶蛋白有抗性的P.xylostella菌落。用CryET66进行的8种剂量测定证实了对P.xylostella的易感和抗性菌落的良好的毒素(表14)。在这种情况下，通过用0.005％TritonX-100对结晶蛋白悬浮液进行系列稀释制备8种结晶蛋白浓度，并将50微升每一种浓度的稀释液局部添加到含有1.0毫升人工饮食的孔中。在所述孔干燥以后，将一条幼虫放入每一种处理过的孔中，并用透明的有孔的米拉布覆盖托盘(每一种结晶蛋白浓度使用32条幼虫)。在28-30℃下饲养7天之后，统计幼虫死亡率，死亡率数据表达为LC50和LC95，分别为导致50％和95％死亡率的结晶蛋白浓度(纳克/175平方毫米饮食孔)(Daum，1970)。表9CryET66对Plutellaxylostella的毒性CryET66对Cry1A抗性Plutellaxylostella的毒性1结晶蛋白浓度，为要达到50％的死亡率每孔所需要的结晶蛋白纳克数2结晶蛋白浓度，为要达到95％的死亡率每孔所需要的结晶蛋白纳克数表15表示CryET83蛋白对多种鳞翅目害虫具有毒性，并且与其他Cry9型蛋白CryET59和CryET60相比对S.exigua和H.virescens具有改善了的毒性。表10-CryET83对鳞翅目幼虫的毒性11以处理过的幼虫的百分死亡率计算的毒性2纳克CryET83结晶蛋白/175平方毫米饮食孔3表8中所披露的缩略语；SF＝草地滩夜蛾表5中的重组苏云金芽孢杆菌菌株交由ARS专利培养物保藏中心保藏，并被授予了表11所示的NRRL保藏号。表11.生物学保藏物6.11例11-修饰cry基因，以便在植物中表达已知无论是完整长度的或是截短的野生型cry基因在植物中的表达都很差。通常cry基因的G+C含量较低(37％)，并且通常含有很多富含A+T的区，潜在的聚腺苷酸化位点和多个ATTTA序列。表12示出了潜在的聚腺苷酸化序列，这些序列在制备“植物化”基因结构时应当避免表12-潜在聚腺苷酸化信号的序列表*表示潜在的主要植物聚腺苷酸化位点**表示潜在的次要动物聚腺苷酸化位点所有其他的是潜在次要植物聚腺苷酸化位点可以诱变的区域可以按以下方式选择。对cry基因的DNA序列的所有区进行了鉴定，这些区含有5个或5个以上连续的碱基对，这些碱基对是A或T。根据长度在20-30个碱基对区域上的周围序列中A+T的最高百分比将其分类。分析所述DNA的有可能含有聚腺苷酸化位点或ATTTA序列的区域。然后设计寡核苷酸，它能最大限度地A+T连续区，它含有一个或多个聚腺苷酸化位点或ATTTA序列。根据已经发表的报导，有2个潜在的植物聚腺苷酸化位点业已被证实更为重要。筛选能提高G+C含量的密码子，但不能产生可用于克隆并组装该修饰过的基因的酶的限制位点(例如，BamHI、BglII、SacI、NcoI、EcoRV等)。要避免含有双链体TA或GC的类似密码子，有报导这些密码子是植物中经常出现的密码子。尽管CaMV35S启动子通常在大多数植物组织中是高水平的组成型启动子，但相对在叶片组织中的水平而言，在花组织中有CaMV35S启动子启动的基因的表达水平较低。由于受到某些昆虫损害的经济学上重要的目标是花部分或由花产生的部分(例如，棉蕾和棉桃、烟草花芽、番茄芽和果实)，相对由CaMV35S启动子所获得的水平而言增强在上述组织结晶蛋白的表达通常是有利的。玄参花叶病毒(FMV)35S启动子与CaMV35S启动子类似。业已分离了该启动子并且工程连接到植物转化载体上。相对CaMV35S启动子，FMV35S启动子在花组织中是高水平表达的，同时还能在诸如叶片的其他组织中提供同样高水平的基因表达。可以构建一种植物转化载体，其中，完整长度的合成cry基因是由FMV35S启动子启动的。可以用所述载体转化烟草植物，并通过Western印迹或ELISA免疫测定比较结晶蛋白在叶片和花组织中的表达。业已将FMV启动子用于在花组织中产生相对CaMV启动子而言较高水平的结晶蛋白。6.12例12-用fsRUBISCO启动子和叶绿体转运肽表达合成的cry基因植物中编码RUBISCO小亚基(SSU)的基因通常是高水平表达的，受光线调控的，并且有时候表现出组织专一性。上述表达特殊在很大程度上取决于该基因的启动子序列。在转化过的植物中用SSU启动子表达异源基因是可能的。通常，植物含有多个SSU基因，并且不同SSU基因的表达水平和组织专一性也不同。SSU蛋白是在细胞核中编码的，并且以前体形式在细胞质中合成，它含有被称为叶绿体转运肽(CTP)的N-末端延长部分。CTP将所述前体引导至叶绿体中，并促进SSU蛋白被吸收到叶绿体中。在这一过程中，CTP被从SSU蛋白上裂解下来。业已将CTP序列用于将异源蛋白引导至转化植物的叶绿体中。SSU启动子具有用于在植物中表达异源基因的若干优点。某些SSU启动子是高水平表达的，并且能产生与它一样高或高于用CaMV35S启动子所获得的表达水平。由SSU启动子表达的组织分布与CaMV35S启动子的分布不同，因此，为了控制某些害虫，将结晶蛋白的表达定向到SSU能最高水平表达的细胞中是有利的。例如，尽管相对来说它是组成型的，在叶片中，CaMV35S启动子在微管组织中的表达高于在叶片其他部分的表达，而大多数SSU启动子在叶片的叶肉细胞中表达水平最高。某些SSU启动子也是组织专一性较高的，因此，可以利用专一性SSU启动子仅在一小类植物组织中表达本发明的蛋白，如果发现这种蛋白在某些细胞中的表达对该细胞是有害的话。例如，为了控制科罗拉多马铃薯象甲，最好利用SSU启动子指导结晶蛋白在叶片中表达，而不是在可食用的块茎中表达。利用SSUCTP序列将结晶蛋白定位到叶绿体中也可能是有利的。将苏云金芽孢杆菌结晶蛋白定位到叶绿体中可以保护这种蛋白不受细胞质中的蛋白酶的破坏。这可以稳定该蛋白，并导致积累较高含量的活性毒素。含有CTPcry基因可以与SSU启动子或诸如CaMV35S的其他启动子组合使用。6.13例13-利用信号肽将Cry蛋白定向到胞外空间或液泡中由本文所披露的合成基因所产生的苏云金芽孢杆菌蛋白位于植物细胞的细胞质中，并且这种细胞质定位会使得该植物具有杀虫效果。对于某些用途来说，将苏云金芽孢杆菌蛋白引导至植物细胞的其他区室可能是有利的。将苏云金芽孢杆菌蛋白定位于除细胞质以外的其他区室可能会导致使苏云金芽孢杆菌蛋白较少地接触细胞质蛋白酶，从而更多地积累这种蛋白增强杀虫活性。胞外定位可以导致使某些昆虫更有效地接触苏云金芽孢杆菌蛋白，产生更大的效力。如果发现苏云金芽孢杆菌蛋白对植物细胞功能有损伤，将这种蛋白定位于非细胞质区室可以保护该细胞不受这种蛋白的破坏。在植物以及其他真核生物中，被指定定位于胞外或若干特定的区室中的蛋白通常是以具有被称为信号肽的N-末端氨基酸延长部分形式合成的。该信号肽能指导所述蛋白进入区室化途径，并且在区室化过程中作为早期步骤从成熟蛋白上裂解下去。对于胞外蛋白来说，分泌途径通常包括共同翻译插入内质网中，并在这一阶段裂解信号肽。然后成熟蛋白通过高尔基体进入小泡，小泡与质膜融合从而将蛋白释放到胞外空间。预定进入其他区室的蛋白也遵循类似的途径。预定进入内质网或高尔基体的蛋白也遵循该方案，但这种蛋白特别局限于合适的区室中。在植物中，某些蛋白也定向于液泡，它是很多植物细胞的细胞质中另一种膜结合区室。液泡定向蛋白在高尔基体处偏离上述途径，从这里它进入会与液泡融合的小泡。这种蛋白定向的共同特征是启动区室化过程的信号肽。将信号肽与蛋白融合在很多场合下会导致该蛋白向内质网定向。这一步骤的效率也有可能取决于成熟蛋白本身的序列。将蛋白定向到特定区室而不是胞外间隙的信号尚未明确定义。将所述蛋白引导至特定区室的很多所述信号似乎包含在所述成熟蛋白的氨基酸序列内。对于某些液泡定向蛋白来说已经证实了这一点，但尚不可能精确地确定所述序列。对于含有信号序列而不是其他区室化信号的蛋白来说，分泌到胞外间隙中似乎是“预设的”。因此，将苏云金芽孢杆菌蛋白引导至细胞质外面的方法是将合成的苏云金芽孢杆菌基因与编码已知植物信号肽的DNA序列融合。这种融合基因能产生进入分泌途径的苏云金芽孢杆菌蛋白，并导致朝向液泡或其他区室的胞外分泌或定向。业已披露了若干植物基因的信号序列。早先已经公开了烟草致病相关蛋白PR1b的上述序列(Cornelissen等，1986)。PR1b蛋白通常定位于胞外空间。另一种类型的信号肽包含在豆类的种子储存蛋白上。所述蛋白定位于种子的蛋白体上，它是存在于种子中的液泡样区室。业已披露了菜豆7S储存蛋白β亚基的信号肽DNA序列PvuB(Doyle等，1986)。根据公开的上述序列，可以用寡核苷酸化学合成编码PR1b和PvuB的信号肽的基因。在某些场合下，为了实现异源蛋白的分泌或区室化，有必要在信号肽的正常裂解位点之外包括某些氨基酸序列。这对于确保信号肽的正确裂解来说是必要的。6.13例14-利用cry转基因分离抗虫的转基因植物6.14.1植物基因构建以双链DNA形式存在的植物基因的表达包括通过RNA聚合酶由所述DNA的一股链转录mRNA，然后在细胞核内对mRNA初级转录物进行加工。这一过程涉及到3’非翻译区，它向RNA的3’末端添加聚酰苷酸核苷酸。从DNA向mRNA的转录是由一个通常被称为启动子的DNA区遥控的。所述启动子区包括一个碱基序列，它向RNA聚合酶发信号，使它与DNA结合，并启动mRNA的转录，利用所述DNA链之一作模板生产相应的RNA链。在现有文献中业已披露了能在植物细胞中起作用的多种启动子。所述启动子可以从植物或植物病毒获得，并且包括，但不限于胭脂氨酸合成酶(NOS)和章鱼氨酸合成酶(OCS)启动子(由根癌农杆菌Ti质粒携带)，花椰菜花叶病毒(CaMV)19S和35S启动子，来自核糖1，5-二磷酸羧化酶的小亚基的光诱导型启动子(ssRUBISCO，在一种含量很高的植物多肽)，和玄参花叶病毒(FMV)35S启动子。业已将上述所有启动子用于制备已经在植物中表达了的各种类型的DNA结构(例如，参见US5463175，被专门收作本文参考)。所选择的特定启动子应当能够导致酶编码序列的充分表达，以便导致产生有效量的蛋白。一类优选的启动子是组成型启动子，如CaMV35S或FMV35S启动子，它们能在大多数植物器官中高水平表达(例如，参见US5378619，被专门收作本文参考)。另一种类型的优选启动子是根增强或专一性启动子，如CaMV衍生的4as-1启动子或小麦pox1启动子(US5023179，被专门收作本文参考；Hertig等，1991)。将根增强或专一性启动子用于在转基因玉米植物上控制玉米切根虫是特别优选的。如果需要，可以对用于本发明的DNA结构(即嵌合植物基因)上的启动子进行修饰，以便改变其控制特性。例如，可将CaMV35S启动子连接到ssRUBISCO基因部分，以便在缺乏光照的情况下抑制ssRUBISCO的表达，从而产生能在叶片中起作用但不能在根中起作用的启动子。所得到的嵌合启动子可以在本发明中使用。因此，对于本说明书来说，术语“CaMV35S”启动子包括CaMV35S启动子的变异，例如，通过与操纵子连接、随机或控制诱变等所产生的启动子。另外，可以改变所述启动子以便包括多个“增强子序列”，从而有助于增强基因表达。通过本发明的DNA结构所产生的RNA还含有5’非翻译前导序列。该序列可以来自被选择用于表达该基因的启动子，并可以进行特别修饰，以便增强mRNA的翻译。所述5’非翻译区还可以从病毒RNA获得，从合适的真核基因获得，或从合成基因序列获得。本发明不局限于其非翻译区来自与启动子序列相伴的5’非翻译序列的结构。为了优化在诸如玉米的单子叶植物中的表达，所述DNA表达结构应当包括一个内含子，该内含子通常被放在非翻译序列中靠近mRNA的5’末端处。该内含子可以获自，但不限于下列一组内含子玉米hsp70内含子(US5424412；被专门收作本文参考)或水稻Act1内含子(McElroy等，1990)，正如下文所述，将玉米hsp70内含子用于本发明中。如上文所述，本发明的嵌合植物基因的3’非翻译区包括能在植物中起作用的聚腺苷酸化信号，导致在RNA的3’末端添加腺苷酸核苷酸。优选3’区的例子有(1)含有农杆菌属Ti质粒基因的聚腺苷酸化信号的3’转录、非翻译区，所述基因如胭脂氨酸合成酶(NOS)基因和(2)诸如豌豆ssRUBISCOE9基因的植物基因(Fischhoff等，1987)。6.14.2植物转化和表达可以用任何合适方法将含有本发明的结构编码序列的基因插入基因组中。合适的植物转化载体包括源于根癌农杆菌Ti质粒的载体，以及披露于以下文献中的载体，例如，Herrera-Estrella(1983)，Bevan(1983)，Klee(1985)和欧洲专利申请公开号EP0120516。除了来自农杆菌属的Ti或Ri质粒的植物转化载体之外，还可以用其他方法将本发明的DNA结构插入植物细胞。例如，所述方法可以包括使用脂质体、电穿孔、能增强游离DNA摄取的化合物，通过微粒轰击进行的游离DNA输送，以及用病毒或花粉进行转化(Fromm等，1986；Armstrong，1990；Fromm等，1990)。6.14.3构建cry基因的单子叶植物表达载体为了在转基因植物是有效表达cry基因，该基因必须具有合适的序列组成(Diehn，1996)。为了将cry基因放在适于在单子叶植物中表达的载体上(即受强化的花椰菜花叶病毒35S启动子控制，并与hsp70内含子连接，随后是胭脂氨酸合成酶聚腺苷酸化位点(如在被专门收作本文参考文献的US5424412中所披露的)，可以使用诸如pMON19469的载体。所述载体便于用NcoI和EcoRI限制酶消化。然后对大约4.6kb的较大的载体带进行电泳、纯化、并用T4DNA连接酶连接到含有合成的cry基因的NcoI-EcoRI片段上。然后将该连接混合物转入大肠杆菌，回收羧苄青霉素抗性菌落，并通过DNA微量制备方法回收质粒DNA。然后使用诸如NcoI和EcoRI(同时)，NotI和/或PstI单独或组合的酶对所述DNA进行限制性内切酶分析，以便鉴定含有与诸如hsp70内含子融合的cry编码序列的，受强化CaMV35S启动子控制的克隆。为了将所述基因插入适合回收稳定转化的抗虫植物的载体上，通过凝胶电泳分离并纯化来自pMON33708的含有与hsp70内含子融合的赖氨酸氧化酶编码序列并受强化CaMV35S启动子控制的3.75kbNotI限制片段。然后将该片段与诸如pMON30460的事先用NotI和小牛肠碱性磷酸酶处理过的载体连接(pMON30460含有受CaMV35S启动子控制的新霉素磷酸转移酶编码序列)。通过将该连接混合物转入大肠杆菌获得卡那霉素抗性菌落，并可以通过对质粒微量制DNA进行限制性内切酶消化鉴定含有所需质粒的菌落。可将诸如NotI、EcoRV、HindIII、NcoI、EcoRI和BglII的限制酶用于鉴定两个基因的方向为串联关系的合适的克隆(即cry表达框的3’末端与nptII表达框的5’末端连接。通过将载体DNA电穿孔转移到原生质体中，然后通过蛋白质印迹和ELISA分析证实所得到的质粒在玉米原生质体中表达的Cry蛋白。大体上按在被专门收作本文参考的US5424412中所披露的方法通过粒子枪轰击将该载体导入玉米胚胎的基因组DNA，然后通过巴龙霉素选择获得能表达cry基因的玉米植物。举例来说，所述载体可以通过与能产生潮霉素抗性的质粒一起共同轰击导入玉米的未成熟的胚胎盾片(IES)中，然后进行潮霉素选择并再生。然后通过ELISA分析鉴定能表达cry蛋白的转基因玉米品系。然后将来自上述过程的后代种子用于测试对昆虫采食的保护作用。7.0参考文献下面的参考文献以及提供对本文所列举的文献的补充的代表性方法或其他细节的程度被专门收作本文参考。U.S.Patent4,196,265，issuedApr.1，1980.U.S.Patent4,554,101，issuedNov.19，1985.U.S.Patent4,683,195，issuedJul.28，1987.U.S.Patent4,683,202，issuedJul.28，1987.U.S.Patent4,757,011，issuedJul.12，1988.U.S.Patent4,769,061，issuedSep.6，1988.U.S.Patent4,940,835，issuedFeb.23，1990.U.S.Patent4,965,188，issuedOct.23，1990.U.S.Patent4,971,908，issuedNov.20，1990.U.S.Patent4,987,071，issuedJan.22，1991.U.S.Patent5,023,179，issuedJun11，1991.U.S.Patent5,176,995，issuedOct.15，1991.U.S.Patent5,334,711，issuedAug.2，1994.U.S.Patent5,378,619，issuedJan3，1995.U.S.Patent5,384,253，issuedJan.24，1995.U.S.Patent5,424,412，issuedJun13，1995.U.S.Patent5,463,175，issuedOct31，1995.U.S.Patent5,631,359，issuedMay20，1997.Int.Pat.Appl.Publ.No.WO84/02913.Int.Pat.Appl.Publ.No.WO91/03162.Int.Pat.Appl.Publ.No.WO92/07065.Int.Pat.Appl.Publ.No.WO93/15187.Int.Pat.Appl.Publ.No.WO93/23569.Int.Pat.Appl.Publ.No.WO94/02595.Int.Pat.Appl.Publ.No.WO94/13688.Eur.Pat.Appl.Publ.No.EP0120516.Eur.Pat.Appl.Publ.No.EP0360257.Eur.Pat.Appl.Publ.No.92110298.4ArantesandLereclus，Gene，108115-119，1991.Abdullahetal.，Biotechnology，41087，1986.Baumetal.，Appl.Environ.Microbiol.，563420-3428，1990.Benbrooketal.，InProceedingsBioExpo1986，Butterworth，Stoneham，MA，pp.27-54，1986.Bevanetal.，NucleicAcidsRes.，11(2)369-85，1983.Bytebieretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，845345，1987.Callisetal.，GenesandDevelopment，11183，1987.Campbell，″MonoclonalAntibodyTechnology，LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology，″Vol.13，BurdenandVonKnippenberg，Eds.pp.75-83，Elsevier，Amsterdam，1984.Capecchi，″HighefficiencytransformationbydirectmicroinjectionofDNAintoculturedmammaliancells，″Cell，22(2)479-488，1980.Cashmoreetal.，Gen.Eng.ofPlants，PlenumPress，NewYork.29-38，1983.Charleseta.，Annu.Rev.Entomol.，41451-472，1996.Chauetal.，Science，244174-181，1989.Chenetal.，Nucl.AcidsRes.，204581-9，1992.ChowriraandBurke，Nucl.AcidsRes.，202835-2840，1992.Clapp，″Somaticgenetherapyintohematopoieticcells.Currentstatusandfutureimplications，″Clin.Perinatol.，20(1)155-168，1993.CollinsandOlive，Biochem.，322795-2799，1993.ConwayandWickens，InRNAProcessing，p.40，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY，1988.Cornelissenetal.，Nature，321(6069)531-2，1986.Crickmoreetal.，Microbiol.Mol.Biol.Rev.62807-813，1998.Cristouetal.，PlantPhysiol.，87671-674，1988.Curiel，Agarwal，Wagner，Cotten，″Adenovirusenhancementoftransferrin-polylysine-mediatedgenedelivery，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88(19)8850-8854，1991.Curiel，Wagner，Cotten，Bimstiel，Agarwal，Li，Loechel，Hu，″High-efficiencygenetransfermediatedbyadenoviruscoupledtoDNA-polylysinecomplexes，″Hum.Gen.Ther.，3(2)147-154，1992.Deanetal.，Nucl.AcidsRes.，14(5)2229，1986.Dhir，S.K.，Dhir，S.，Hepburn，A.，andWidholm，J.M.，“FactorsaffectingtransientgeneexpressioninelectroporatedGlycine-maxprotoplasts，”PlantCellRep.，10(2)106-110，1991.Dhir，S.K.，Dhir，S.，Sturtevant，A.P.，andWidholm，J.M.，“RegenerationoftransformedshootsforelectroporatedsoybeanGlycine-maxL.Merr.Protoplasts，PlantCellRep.，10(2)97-101，1991.Diehnetal.，Genet.Eng.(N.Y.)，1883-99，1996.Donovanetal.，J.Biol.Chem.263561-567，1988.Donovanetal.，Appl.Environ.Microbiol.583921-3927，1992.Doyleetal.，J.Biol.Chem.，261(20)9228-38，1986.Dropulicetal.，J.Virol.，661432-41，1992.EglitisandAnderson，″Retroviralvectorsforintroductionofgenesintomammaliancells，″Biotechniques，6(7)608-614，1988.Eglitis，Kantoff，Kohn，Karson，Moen，Lothrop，Blaese，Anderson，″Retroviral-mediatedgenetransferintohemopoieticcells，″Avd.Exp.Med.Biol.，24119-27，1988.Elroy-SteinandMoss，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，876743-7，1990.EnglishandSlatin，InsectBiochem.Mol.Biol.，221-7，1992.Fraleyetal.，Biotechnology，3629，1985.Fraleyetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，804803，1983.Frommetal.，Biotechnology(N.Y.)，8(9)833-9，1990.Frommetal.，Nature，319791-793，1986.Fromm，Taylor，Walbot，″Expressionofgenestransferredintomonocotanddicotplantcellsbyelectroporation，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82(17)5824-5828，1985.Fujimuraetal.，PlantTiss.Cult.Lett.，274，1985.Fynan，Webster，Fuller，Haynes，Santoro，Robinson，″DNAvaccinesprotectiveimmunizationsbyparenteral，mucosal，andgeneguninoculations，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90(24)11478-11482，1993.GaoandHuang，Nucl.AcidsRes.，212867-72，1993.Gefteretal.，Somat.CellGenet.，3231-236，1977.GenoveseandMilcarek，InRNAProcessing，p.62，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY，1988.GilandProudfoot，Nature，312473，1984.Goding，″MonoclonalAntibodiesPrinciplesandPractice，″pp.60-74.2ndEdition，AcademicPress，Orlando，FL，1986.GrahamandvanderEb，″TransformationofratcellsbyDNAofhumanadenovirus5，″Virology，54(2)536-539，1973.Guerrier-Takadaetal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终止密码字<400>41atgaaatctaagaatcaaaatatgcatcaaagcttgtctaacaatgcg48MetLysSerLysAsnGlnAsnMetHisGlnSerLeuSerAsnAsnAla151015acagttgataaaaactttacaggttcactagaaaataacacaaatacg96ThrValAspLysAsnPheThrGlySerLeuGluAsnAsnThrAsnThr202530gaattacaaaactttaatcatgaaggtatagagccgtttgttagtgta144GluLeuGlnAsnPheAsnHisGluGlyIleGluProPheValSerVal354045tcaacaattcaaacgggtattggtattgctggtaaaatccttggtaac192SerThrIleGlnThrGlyIleGlyIleAlaGlyLysIleLeuGlyAsn505560ctaggcgttccttttgctgggcaagtagctagcctctatagttttatc240LeuGlyValProPheAlaGlyGlnValAlaSerLeuTyrSerPheIle65707580ctaggtgagctttggcccaaagggaaaagccaatgggaaatctttatg288LeuGlyGluLeuTrpProLysGlyLysSerGlnTrpGluIlePheMet859095gaacatgtagaagagcttattaatcaaaagatatcgacttatgcaaga336GluHisValGluGluLeuIleAsnGlnLysIleSerThrTyrAlaArg100105110aacaaagcacttgcagatttaaaaggattaggagatgctttggctgtc384AsnLysAlaLeuAlaAspLeuLysGlyLeuGlyAspAlaLeuAlaVal115120125taccatgaatcgctggaaagttggattgaaaatcgcaataacacaaga432TyrHisGluSerLeuGluSerTrpIleGluAsnArgAsnAsnThrArg130135140accagaagtgttgtcaagagccaatacatcaccttggaacttatgttc480ThrArgSerValValLysSerGlnTyrIleThrLeuGluLeuMetPhe145150155160gtacaatcattaccttcttttgcagtgtctggagaggaagtaccacta528ValGlnSerLeuProSerPheAlaValSerGlyGluGluValProLeu165170175ttaccaatatatgctcaagctgcaaatttacacttattgctattacga576LeuProIleTyrAlaGlnAlaAlaAsnLeuHisLeuLeuLeuLeuArg180185190gatgcttctatttttggaaaataatgggggttatcagactcagaaatt624AspAlaSerIlePheGlyLysXaaTrpGlyLeuSerAspSerGluIle195200205tccacattttataatcgccaatccggaaaatcgaaagaatattctgac672SerThrPheTyrAsnArgGlnSerGlyLysSerLysGluTyrSerAsp210215220cactgcgtaaaatggtataatacaggcctaaatcgcttgatggggaac720HisCysValLysTrpTyrAsnThrGlyLeuAsnArgLeuMetGlyAsn225230235240aatgccgaaagttgggtacgatataatcaattccgtagagacatgact768AsnAlaGluSerTrpValArgTyrAsnGlnPheArgArgAspMetThr245250255ttaatggtactagatttagtggcactatttccaagctatgatacacaa816LeuMetValLeuAspLeuValAlaLeuPheProSerTyrAspThrGln260265270atgtatccaattaaaactacagcccaacttacaagagaagtatataca864MetTyrProIleLysThrThrAlaGlnLeuThrArgGluValTyrThr275280285gacgcaattgggacagtacatccgcatccaagttttacaagtacgact912AspAlaIleGlyThrValHisProHisProSerPheThrSerThrThr290295300tggtataataataatgcaccttcgttctctaccatagaggctgctgtt960TrpTyrAsnAsnAsnAlaProSerPheSerThrIleGluAlaAlaVal305310315320gttcgaaacccgcatctactcgattttctagaacaagttacaatttac1008ValArgAsnProHisLeuLeuAspPheLeuGluGlnValThrIleTyr325330335agcttattaagtcgatggagtaacactcagtatatgaatatgtgggga1056SerLeuLeuSerArgTrpSerAsnThrGlnTyrMetAsnMetTrpGly340345350ggacataaactagaattccgaacaataggaggaacgttaaatacctca1104GlyHisLysLeuGluPheArgThrIleGlyGlyThrLeuAsnThrSer355360365acacaaggatctactaatacttctattaatcctgtaacattaccgttc1152ThrGlnGlySerThrAsnThrSerIleAsnProValThrLeuProPhe370375380acttctcgagacgtctataggactgaatcattggcagggctgaatcta1200ThrSerArgAspValTyrArgThrGluSerLeuAlaGlyLeuAsnLeu385390395400tttttaactcaacctgttaatggagtacctagggttgattttcattgg1248PheLeuThrGlnProValAsnGlyValProArgValAspPheHisTrp405410415aaattcgtcacacatccgatcgcatctgataatttctattatccaggg1296LysPheValThrHisProIleAlaSerAspAsnPheTyrTyrProGly420425430tatgctggaattgggacgcaattacaggattcagaaaatgaattacca1344TyrAlaGlyIleGlyThrGlnLeuGlnAspSerGluAsnGluLeuPro435440445cctgaagcaacaggacagccaaattatgaatcttatagtcatagatta1392ProGluAlaThrGlyGlnProAsnTyrGluSerTyrSerHisArgLeu450455460tctcatataggactcatttcagcatcacatgtgaaagcattggtatat1440SerHisIleGlyLeuIleSerAlaSerHisValLysAlaLeuValTyr465470475480tcttggacgcatcgtagtgcagatcgtacaaatacaattgagccaaat1488SerTrpThrHisArgSerAlaAspArgThrAsnThrIleGluProAsn485490495agcattacacaaataccattagtaaaagcgttcaatctgtcttcaggt1536SerIleThrGlnIleProLeuValLysAlaPheAsnLeuSerSerGly500505510gccgctgtagtgagaggaccaggatttacaggtggggatatccttcga1584AlaAlaValValArgGlyProGlyPheThrGlyGlyAspIleLeuArg515520525agaaagaatactggtacatttggggatatacgagtaaatattaatcca1632ArgLysAsnThrGlyThrPheGlyAspIleArgValAsnIleAsnPro530535540ccatttgcacaaagatatcgcgtgaggattcgctatgcttctaccaca1680ProPheAlaGlnArgTyrArgValArgIleArgTyrAlaSerThrThr545550555560gatttacaattccatacgtcaattaacggtaaagctattaatcaaggt1728AspLeuGlnPheHisThrSerIleAsnGlyLysAlaIleAsnGlnGly565570575aatttttcagcaactatgaatagaggagaggacttagactataaaacc1776AsnPheSerAlaThrMetAsnArgGlyGluAspLeuAspTyrLysThr580585590tttagaactgtaggctttaccaccccatttagcttttcagatgtacaa1824PheArgThrValGlyPheThrThrProPheSerPheSerAspValGln595600605agtacattcacaataggtgcttggaacttctcttcaggtaacgaagtt1872SerThrPheThrIleGlyAlaTrpAsnPheSerSerGlyAsnGluVal610615620tatatagatagaattgaatttgttccggtagaagtaacatatgaggca1920TyrIleAspArgIleGluPheValProValGluValThrTyrGluAla625630635640gaatatgattttgaaaaagcgcaagaggaggttactgcactgtttaca1968GluTyrAspPheGluLysAlaGlnGluGluValThrAlaLeuPheThr645650655tctacgaatccaagaggattaaaaacagatgtaaaggattatcatatt2016SerThrAsnProArgGlyLeuLysThrAspValLysAspTyrHisIle660665670gaccaggtatcaaatttagtagagtctctatcagataaattctatctt2064AspGlnValSerAsnLeuValGluSerLeuSerAspLysPheTyrLeu675680685gatgaaaagagagaattattcgagatagttaaatacgcgaagcaactc2112AspGluLysArgGluLeuPheGluIleValLysTyrAlaLysGlnLeu690695700catattgagcgtaacatgtag2133HisIleGluArgAsnMet705710<210>42<211>710<212>PRT<213>苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)<220><221>misc_特征<222>(200)..(200)<223>非编码<400>42MetLysSerLysAsnGlnAsnMetHisGlnSerLeuSerAsnAsnAla15101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730735AsnPheThrSerIleHisGluGlnSerGluHisGlyTrpTrpGlySer740745750GluAsnIleThrIleGlnGluGlyAsnAspValPheLysGluAsnTyr755760765ValThrLeuProGlyThrPheAsnGluCysTyrProThrTyrLeuTyr770775780GlnLysIleGlyGluAlaGluLeuLysAlaTyrThrArgTyrGlnLeu785790795800SerGlyTyrIleGluAspSerGlnAspLeuGluIleTyrLeuIleArg805810815TyrAsnAlaLysHisGluThrLeuAspValProGlyThrGluSerVal820825830TrpProLeuSerValGluSerProIleGlyArgCysGlyGluProAsn835840845ArgCysAlaProHisPheGluTrpAsnProAspLeuAspCysSerCys850855860ArgAspGlyGluLysCysAlaHisHisSerHisHisPheSerLeuAsp865870875880IleAspValGlyCysIleAspLeuHisGluAsnLeuGlyValTrpVal885890895ValPheLysIleLysThrGlnGluGlyHisAlaArgLeuGlyAsnLeu900905910GluPheIleGluGluLysProLeuLeuGlyGluAlaLeuSerArgVal915920925LysArgAlaGluLysLysTrpArgAspLysArgGluLysLeuGlnLeu930935940GluThrLysArgValTyrThrGluAlaLysGluAlaValAspAlaLeu945950955960PheValAspSerGlnTyrAspArgLeuGlnAlaAspThrAsnIleGly965970975MetIleHisAlaAlaAspLysLeuValHisArgIleArgGluAlaTyr980985990LeuSerGluLeuSerValIleProGlyValAsnAlaGluIlePheGlu99510001005GluLeuGluGlyArgIleIleThrAlaIleSerLeuTyrAspAla101010151020ArgAsnValValLysAsnGlyAspPheAsnAsnGlyLeuAlaCys102510301035TrpAsnValLysGlyHisValAspValGlnGlnSerHisHisArg104010451050SerValLeuValIleProGluTrpGluAlaGluValSerGlnAla105510601065ValArgValCysProGlyArgGlyTyrIleLeuArgValThrAla107010751080TyrLysGluGlyTyrGlyGluGlyCysValThrIleHisGluIle108510901095GluAsnAsnThrAspGluLeuLysPheLysAsnCysGluGluGlu110011051110GluValTyrProThrAspThrGlyThrCysAsnAspTyrThrAla111511201125HisGlnGlyThrAlaValCysAsnSerArgAsnAlaGlyTyrGlu113011351140AspAlaTyrGluValAspThrThrAlaSerValAsnTyrLysPro114511501155ThrTyrGluGluGluThrTyrThrAspValArgArgAspAsnHis116011651170CysGluTyrAspArgGlyTyrValAsnTyrProProValProAla117511801185GlyTyrMetThrLysGluLeuGluTyrPheProGluThrAspLys119011951200ValTrpIleGluIleGlyGluThrGluGlyLysPheIleValAsp120512101215SerValGluLeuLeuLeuMetGluGlu1220122权利要求1.一种分离的多肽，它与SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO24、SEQIDNO40或SEQIDNO44的相同性至少为85％。2.一种分离的多肽，它与SEQIDNO2、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO24、SEQIDNO38、SEQIDNO40或SEQIDNO44的相同性至少为91％。3.一种分离的多肽，它与SEQIDNO2、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO16、SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO22、SEQIDNO24、SEQIDNO28、SEQIDNO36、SEQIDNO38、SEQIDNO40、SEQIDNO44或SEQIDNO50的相同性至少为95％。4.一种分离的多肽，它与SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO22、SEQIDNO24、SEQIDNO26、SEQIDNO28、SEQIDNO30、SEQIDNO32、SEQIDNO34、SEQIDNO36、SEQIDNO38、SEQIDNO40、SEQIDNO42、SEQIDNO44、SEQIDNO46、SEQIDNO48、SEQIDNO50或SEQIDNO63的相同性至少为99％。5.如权利要求4的多肽，包括选自下列一组的氨基酸序列SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO22、SEQIDNO24、SEQIDNO26、SEQIDNO28、SEQIDNO30、SEQIDNO32、SEQIDNO34、SEQIDNO36、SEQIDNO38、SEQIDNO40、SEQIDNO42、SEQIDNO44、SEQIDNO46、SEQIDNO48、SEQIDNO50和SEQIDNO63。6.一种编码上述权利要求中任一项的多肽的分离的核酸序列。7.一种组合物，含有权利要求1-5中任一项的多肽和稀释剂。8.如权利要求7的组合物，其中，所述多肽选自下列一组SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO22、SEQIDNO24、SEQIDNO26、SEQIDNO28、SEQIDNO30、SEQIDNO32、SEQIDNO34、SEQIDNO36、SEQIDNO38、SEQIDNO40、SEQIDNO42、SEQIDNO44、SEQIDNO46、SEQIDNO48、SEQIDNO50和SEQIDNO63。9.如权利要求7的组合物，含有苏云金芽孢杆菌细胞的细胞提取物、细胞悬浮液、细胞匀浆物、细胞裂解液、细胞上清液、细胞过滤液或细胞沉淀。10.如权利要求7的组合物，其中，所述组合物是粉末、粉尘、小团、颗粒、喷雾剂、乳液、胶体、或溶液。11.如权利要求7的组合物，所述多肽的重量占大约1-99％。12.通过一种方法制备的杀虫多肽，该方法以下步骤(a)在能有效产生杀虫多肽的条件下培养具有以下保藏号的苏云金芽孢杆菌NRRLB-21784、NRRLB-21783、NRRLB-21917、NRRLB-21786、NRRLB-21787、NRRLB-21785、NRRLB-21788、NRRLB-21915或NRRLB-21916；和(b)从所述细胞获得所产生的杀虫多肽。13.一种苏云金芽孢杆菌细胞，它的NRRL保藏号为NRRLB-21784、NRRLB-21783、NRRLB-21917、NRRLB-21786、NRRLB-21787、NRRLB-21785、NRRLB-21788、NRRLB-21915或NRRLB-21916。14.一种分离多核苷酸，它与SEQIDNO17、SEQIDNO19、SEQIDNO23、SEQIDNO39或SEQIDNO43的相同性至少为85％。15.如权利要求15的多核苷酸，其中，所述多核苷酸与SEQIDNO1、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO15、SEQIDNO17、SEQIDNO19、SEQIDNO21、SEQIDNO23、SEQIDNO27、SEQIDNO35、SEQIDNO37、SEQIDNO39、SEQIDNO43或SEQIDNO49的相同性至少为95％。16.如权利要求15的多核苷酸，其中，所述多核苷酸与SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15、SEQIDNO17、SEQIDNO19、SEQIDNO21、SEQIDNO23、SEQIDNO25、SEQIDNO27、SEQIDNO29、SEQIDNO31、SEQIDNO33、SEQIDNO35、SEQIDNO37、SEQIDNO39、SEQIDNO41、SEQIDNO43、SEQIDNO45、SEQIDNO47、SEQIDNO49或SEQIDNO62的相同性至少为99％。17.如权利要求15的多核苷酸，包括SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15、SEQIDNO17、SEQIDNO19、SEQIDNO21、SEQIDNO23、SEQIDNO25、SEQIDNO27、SEQIDNO29、SEQIDNO31、SEQIDNO33、SEQIDNO35、SEQIDNO37、SEQIDNO39、SEQIDNO41、SEQIDNO43、SEQIDNO45、SEQIDNO47、SEQIDNO49或SEQIDNO62的核酸序列。18.如权利要求14-17中任一项的多核苷酸，其中，所述分离的多核苷酸是以载体形式提供的。19.如权利要求14-17中任一项的多核苷酸，其中，所述分离的多核苷酸可操作地连接于启动子上。20.如权利要求19的多核苷酸，其中，所述启动子是植物可表达的启动子。21.如权利要求20的多核苷酸，所述植物可表达的启动子选自下列一组玉米蔗糖合成酶1启动子、玉米醇脱氢酶1启动子、玉米集光复合体启动子、玉米热激蛋白启动子、豌豆小亚基RuBP羧化酶启动子、Ti质粒甘露氨酸合成酶启动子、Ti质粒胭脂氨酸合成酶启动子、矮牵牛查尔酮异构酶启动子、菜豆富甘氨酸蛋白1启动子、马铃薯蛋白启动子、凝集素、CaMV35S、和S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子。22.如权利要求18的多核苷酸，其中，所述载体是质粒、杆状病毒、人工染色体、毒粒、粘粒、噬菌粒、噬菌体或病毒载体。23.一种转化过的宿主细胞，包括编码权利要求1-5中任一项多肽的核酸序列。24.如权利要求23的转化过的宿主细胞，其中，所述核酸选自下列一组SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15、SEQIDNO17、SEQIDNO19、SEQIDNO21、SEQIDNO23、SEQIDNO25、SEQIDNO27、SEQIDNO29、SEQIDNO31、SEQIDNO33、SEQIDNO35、SEQIDNO37、SEQIDNO39、SEQIDNO41、SEQIDNO43、SEQIDNO45、SEQIDNO47、SEQIDNO49和SEQIDNO62。25.如权利要求23的转化过的宿主细胞，它被进一步限定为原核或真核宿主细胞。26.如权利要求23的转化过的宿主细胞，它被进一步限定为细菌细胞或植物细胞。27.如权利要求26的转化过的宿主细胞，其中，所述细菌细胞是苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、埃希氏菌属、沙门氏菌属、农杆菌属或假单胞菌属细胞。28.如权利要求26的转化过的宿主细胞，其中，所述细菌细胞是苏云金芽孢杆菌NRRLB-21784、NRRLB-21783、NRRLB-21917、NRRLB-21786、NRRLB-2177、NRRLB-21785、NRRLB-21788、NRRLB-21915或NRRLB-21916细胞。29.如权利要求27的转化过的宿主细胞，其中，所述细菌细胞是根癌农杆菌细胞。30.如权利要求26的转化过的宿主细胞，被进一步限定为单子叶或双子叶植物细胞。31.如权利要求30的转化过的宿主细胞，其中，所述植物细胞选自下列一组玉米、小麦、大豆、燕麦、棉花、水稻、黑麦、高粱、甘蔗、番茄、烟草、木棉、亚麻、马铃薯、大麦、草坪草、牧草、浆果、水果、豆类、蔬菜、观赏植物、灌木、仙人掌、多汁植物和树木细胞。32.如权利要求30的转化过的宿主细胞，其中，所述植物细胞是玉米、小麦、水稻、或甘蔗细胞。33.如权利要求30的转化过的宿主细胞，其中，所述植物细胞是大豆、棉花、马铃薯、番茄、或烟草细胞。34.一种转基因植物，在其基因组中整合了一种特定的多核苷酸，该核苷酸包括编码权利要求1-5中任一项的多肽的第一个序列区。35.如权利要求34的转基因植物，其中，所述第一个序列区编码SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO22、SEQIDNO24、SEQIDNO26、SEQIDNO28、SEQIDNO30、SEQIDNO32、SEQIDNO34、SEQIDNO36、SEQIDNO38、SEQIDNO40、SEQIDNO42、SEQIDNO44、SEQIDNO46、SEQIDNO48、SEQIDNO50或SEQIDNO63。36.如权利要求34的转基因植物，其中，所述第一个序列区包括SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15、SEQIDNO17、SEQIDNO19、SEQIDNO21、SEQIDNO23、SEQIDNO25、SEQIDNO27、SEQIDNO29、SEQIDNO31、SEQIDNO33、SEQIDNO35、SEQIDNO37、SEQIDNO39、SEQIDNO41、SEQIDNO43、SEQIDNO45、SEQIDNO47、SEQIDNO49或SEQIDNO62。37.如权利要求34的转基因植物，被进一步限定为单子叶植物。38.如权利要求34的转基因植物，被进一步限定为玉米、小麦、燕麦、水稻、大麦、草坪草或牧草植物。39.如权利要求34的转基因植物，被进一步限定为双子叶植物。40.如权利要求34的转基因植物，被进一步限定为豆类植物、大豆、烟草、番茄、马铃薯、棉花、水果、浆果、蔬菜或树木。41.如权利要求34的转基因植物的任何一代的后代，其中，所述后代包括第一种特定的序列区。42.如权利要求34的任一代植物的种子，其中，所述种子包括所述第一种序列区。43.如权利要求39的任一代后代的种子，其中，所述种子包括所述第一种序列区。44.如权利要求42或43的任一代种子的植物，其中，所述植物包括所述第一种序列区。45.一种控制鳞翅目昆虫的方法，包括让所述昆虫与权利要求1-5中任一项的多肽接触。46.如权利要求45的方法，其中，所述多肽是以粉末、粉尘、小团、颗粒、喷雾剂、乳液、胶体或溶液形式提供的。47.如权利要求45的方法，其中，所述多肽是由转化过的宿主细胞提供的。48.如权利要求47的方法，其中，所述转化过的宿主细胞是细菌或植物细胞。49.如权利要求45的方法，其中，所述多肽是由转基因植物提供的。50.如权利要求49的方法，其中，所述植物是玉米、棉花或大豆植物。51.一种制备抗虫植物的方法，包括(a)让受体植物细胞与一种多核苷酸组合物接触，该组合物至少含有编码权利要求1-5中任一项的多肽的第一种核酸序列；(b)筛选含有所述第一种核酸序列的受体植物细胞；和(c)由所选择的细胞再生植物；其中，所述植物相对相应的未转化的植物而言具有增强了的抗虫性。全文摘要披露了含有新型结晶蛋白的苏云金芽孢杆菌菌株,这种蛋白具有针对鳞翅目昆虫的杀虫活性。还披露了新型苏云金芽孢杆菌基因及其所编码的结晶蛋白,以及制备和使用含有本发明的新型核酸序列的转基因细胞的方法。文档编号C07K14/325GK1390259SQ00815677公开日2003年1月8日申请日期2000年9月13日优先权日1999年9月15日发明者J·A·鲍姆,C·R·楚,W·P·多诺范,A·J·吉尔默,M·J·鲁帕申请人:孟山都技术有限公司