专利名称：水稻抗白叶枯病基因Xa4的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种DNA片段的分离。所述的DNA片段能够赋予植物抵抗由白叶枯病菌引起的病害。将该片段与其内源调节序列直接转入植物体，或者将该片段和合适的调节序列连接后转入植物体，转基因植物可以产生Xa4介导的对多种病原菌的防卫反应。
背景技术：
植物在生长的过程中，受到多种病原物的侵害。植物病原物的种类繁多，包括病毒、细菌、霉菌和线虫等。病原物侵入植物导致两种结果(1)病原体成功的在寄主植物内繁殖，引起相关的病症；(2)寄主植物产生防卫反应，杀死病原物或阻止其生长。
虽然植物缺乏像动物一样的循环系统和抗体，也缺乏特化的防卫细胞，但它有一套区别于脊椎动物免疫系统的抗病防卫体系。在这一体系中，植物的每一个细胞都有对病原物的侵染产生组成型抗性(constitutive resistance)和诱导型抗性(induced resistance)的能力。组成型抗性又称为被动抗病性，主要靠形态和组织结构产生的机械障碍(主要指能够抗穿刺和阻止病原物的移动物质，如角质层、木栓质、蜡质、木质素、硅和二价阳离子等)以及抗病原物的化学因子(如酚类化合物、生物碱等，但不包括病原物侵染后发生防卫反应产生的活性因子)来降低病原物对宿主的损害(王金生，1999，分子植物病理学，中国农业出版社)。组成型抗性相对较弱。诱导抗性又称为主动抗性，是在植物和病原微生物长期相互作用中产生的，指寄主植物被病原物侵染后，产生或激活的抗病特性。植物对病原物的这种主动抗病形式由植物的抗病基因介导，其可见的标志是过敏反应，抗性很强。许多植物抗病基因已经被遗传定位。
植物和病原菌的互作分为亲和性互作和非亲和性互作两种。前者是指病原物侵染寄主植物并引起发病；后者是指病原物遇上抗病寄主和非寄主植物时病害一般不会发生。植物的主动抗病反应主要是针对非亲和性病原菌产生。这种反应一般具有病原小种特异性。Flor(1956，Adv.Genet.829-54)根据对亚麻(Linum usitatissmum)锈病(Melampsoralini)的研究提出基因对基因学说解释植物主动抗病反应。该学说认为，当植物携带的抗病基因的产物能够识别病原菌无毒基因(avirulent gene)产物时，植物表现出抗病。针对寄主的每一个抗病基因，在病原菌方面或迟或早都会发现一个毒性基因(virulentgene)。毒性基因只能克服其对应的抗病基因，而产生致病效应。这一遗传假说为深刻理解植物宿主一病原物的相互作用提供了理论基础，并进一步引导了研究者们对病原物无毒基因和植物抗病基因的克隆。研究者们对抗病基因的深入研究进一步证明了基因对基因学说的合理性，并从分子水平上对这一学说作出了解释植物对病原物的防卫反应起始于对病原物特殊信号分子-激发子(elicitor)的识别(激发子是病原物无毒基因直接或间接产物)；抗病基因编码这些信号分子的受体，受体和激发子的结合启动宿主对病原物产生抗性，抑制病原物的生长(Staskawicz等，1995，Science 268661-667)。
植物中已有多个抗病基因被克隆。在已被克隆的植物抗病基因中，大多数基因都编码信号分子识别蛋白。这类抗病基因介导的抗病反应可以用基因对基因学说解释(Baker等，1997，Science 276726-733)。根据基因产物的结构，一般可将采用基因对基因学说原理介导抗病反应的抗病基因分为5类(Jones，2000，InDickinson M and Beynon J.Molecular Plant Pathology，Annual Plant Reviews，Vol 4.108-143；Dangl和Jones，2001，Nature 411826-833)(表1)。
表1部分已克隆的采用基因对基因学说原理介导抗病反应的植物抗病基因类基因 宿主 病原菌蛋白质结构参考文献a群1Rps2拟南芥 Pseudomonas CC-NBS-LRR Bent等，1994syringaeRps4拟南芥 P.Syringae CC-NBS-LRR Gassmann等，1999RPS5拟南芥 P.syringae CC-NBS-LRR Warren等，1998Rpp8拟南芥 P.ParasiticaCC-NBS-LRR McDowell等，1998Rpp13 拟南芥 P.parasiticaCC-NBS-LRR Bittner-Eddy，2000Rpm1拟南芥 P.maculicolaCC-NBS-LRR Grant等，1996HRT 拟南芥 TCV CC-NBS-LRR Cooley等，2000Prf 番茄P.syringae CC-NBS-LRR Salmeron等，1996Mi 番茄Meloidogyne， CC-NBS-LRR Milligan等，1998MacrosiphumI2番茄Fusarium. CC-NBS-LRR Simons等，1998OxysporumXal 水稻Xanthomonas CC-NBS-LRR Yoshimura等，1998oryzaePita水稻Magnaporthe CC-NBS-LRR Bryan等，2000griseaPi-b水稻M.griseaCC-NBS-LRR Wang等，1998，
Dm3 莴苣Bremia lactucae CC-NBS-LRR Myers等，1998Mlal 大麦Bluseria graminisCC-NBS-LRR Zhou等，2001Mla6 大麦B.graminis CC-NBS-LRR Halterman等，2001Rp1-D 玉米Puccinia.Sorghi CC-NBS-LRCollins等，1999Rpp5 拟南芥 P.parasitica TIR-NBS-LRR Parker等，1997Rpp1 拟南芥 P.parasitica TIR-NBS-LRR Botella等，1998N 烟草TMV TIR-NBS-LRR Whitham等，1994L6亚麻Melampsoralini TIR-NBS-LRR Lawrence等，1995M 亚麻M.lini TIR-NBS-LRR Eliss等，1995N 亚麻M.lini TIR-NBS-LRR Dodd等，20012 Cf9 番茄Cladosporium LRR-TM Jones等，1994FulvumCf2 番茄C.fulvum LRR-TM Dixon等，1996Cf4 番茄C.fulvum LRR-TM Thomas等，1997cf5 番茄C.fulvum LRR-TM Dixon等，1998HS1pro-1甜菜Heterodera LRR-TM Cai等，1997Shachtii3 Pto 番茄P.syringae 蛋白激酶 Martin等，1993PBSl 拟南芥 P.syringae 蛋白激酶 Swiderski和Innes，20014 Xa21 水稻X.oryzae LRR-TM-蛋白 Song等，1995激酶Xa26(t) 水稻X.oryzae LRR-TM-蛋白 中国专利申请号激酶 02139212.95 RPW8 拟南芥 E.Cichoracearum CC-NBS Xiao等，2001a参考文献目录Bent A F et al.Science，1994，2651856-1860Bitter Eddy P D et al.Plant J，2000，21177-188Botella M A et al.Plant Cell.1998，101847-1860Bryan G T et al.Plant Cell，2000，122033-2045Cai D et al.Science，1997，275832-834Collins N et al.Plant Cell，1999，111365-1376Cooly M B et al.Plant Cell，2000，663-676Dixon M S et al.Cell，1996，84451-459Dixon M S et al.Plant Cell，1998，101915-1925.
Dodds P N et al.Plant J，2001，27439-452Ellis J G et al.Proc NatAcadSci USA.1995.924185-4188Gassmann Wet al.Plant J，1999，20265-277Grant M Ret al.Science，1995，269843-846Halterman D et al.Plant J，2001，25335-348Jones D A et al.Science，1994，266789-793Lawrence G J et al.Plant Cell，1995，71195-1206Martin G B et al.Science，1993，2621432-1436Meyers B C et al.Plant Cell，1998a，101817-1832Milligan S B et al.Plant Cell，1998，101307-1319Parker J E et al.Plant Cell，1997，9879-894Salmeron J M et al.Cell，1996，86123-133Simons Get al.Plant Cell，1998，101055-1068Song W Y et al.Science，1995，2701772-1804Swiderski M R and Innes R W.Plant J，2001，26101-112Thomas C M et al.Plant Cell，1997，92209-2224Wang Z X et al.Plant J，1999，1955-64Warren R F et al.Plant Cell，1998，101439-1452Whitham S et al.Cell，1994，781101-1115Xiao S et al.Science，2001，291118-120Yoshimura S et al.Proc NatlAcadSci，1998，951663-1668Zhou F et al.Plant Cell，2001，13337-350第一类抗病基因编码具有NBS-LRR(nucleotide binding site-leucine rich repeat)结构域的蛋白质，它是已被克隆的抗病基因中最大的一群(表1)。这类抗病基因可被进一步分为两个亚群(Richter和Ronald，2000，Plant Mol.Bio.42195-204)。一个亚群其抗病基因编码的蛋白氨基端是CC(Coiled-coil)结构域，拟南芥中的RPS2和RPMl以及番茄中的Mi基因属于这一亚群。另一亚群含有TIR结构域(homology to the cytoplasmicdomains of the Toll receptor of Drosophila melanogaster and the IL-1 receptor of birds andmammals)，如烟草中的N基因、拟南芥中的Rpp5和亚麻中的L基因。该类基因编码的蛋白一般存在于细胞质内，抗病基因编码蛋白和激发子的相互作用也发生在细胞内；其NBS结构域比较保守，LRR结构域不很规则，相互之间同源性较差(Baker等，1997，Science 276726-733；Kobe和Deisenhofer，1994，Trend Biochem.Sci.19415-421)。
第二类抗病基因编码胞外LRR结构域(表1)。这类抗病基因编码的LRR结构域比第一类抗病基因编码的LRR规则。LRR存在于细胞外，通过跨膜结构域(TM)将其锚定于细胞膜上。在这类抗病基因介导的抗病反应中很可能激发子和胞外的LRR结合，由TM将信号传递入胞内。该类蛋白质的胞内结构域很小，较保守，可能涉及到和细胞内的信号传递体的相互作用(Jones等，1994，Science 266789-793；Dixon等，1998，PlantCell 101915-1925；Thomas等，1997，Plant Cell 92209-2224)。
第三类抗病基因编码蛋白激酶(表1)。如番茄的Pro基因(Martin等，1993，Science2621432-2436；美国专利第5,648,599)编码一种丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶。这个蛋白质是一种典型的信号传递蛋白质。从结构分析该蛋白似乎缺乏受体的功能。但目前已证明该蛋白能直接和由病原菌avrPto编码的蛋白结合，亦能和植物体内其它的蛋白-很可能是与信号传递相关的蛋白相互作用。Pto蛋白发挥作用时需要Prf基因编码的LZ(leucine zipper)-NBS-LRR类蛋白质的协助(Scofield等，1996，Science 2742063-2065；Tang等，1996，Science 2742060-2063)。另一个抗病基因-PBS1也属于这一类群。PBS1也编码一种蛋白激酶，但和Pto不属于一类。它发挥作用同样需要一类NBS-LRR蛋白质-RPS5的协助。
第四类抗病基因编码受体激酶(表1)。从水稻中分离克隆的抗白叶枯病基因Xa21(Song等，1995，Science 2701772-1804)和Xa26(t)(中国专利申请号02139212.9)基因属于此类。Xa21和Xa26(t)蛋白由LRR、TM和蛋白激酶三部分结构域组成。一般认为LRR位于胞外，激酶部分在胞内。到目前为止，仅发现Xa21和Xa26(t)蛋白是具有抗病活性的受体激酶。从结构上分析，这类蛋白具有典型的信号识别和传递功能。
第五类抗病基因编码产物仅包含截短的CC-NBS结构(表1)。拟南芥的RPW8基因属于此类(Xiao等，2001，Science 291118-120)。目前，研究者们还不知道该基因编码的蛋白质如何完成对病原菌的识别。
水稻白叶枯病是一种非常严重的病害，由稻黄单孢杆菌中的致病变种Xanthomonasoryzae pv.oryzae侵染引起。这种病害在亚洲、欧洲、非洲、南美、美国和澳大利亚都有发生；而以日本、印度和中国发生比较严重。我国主要发生在华东、华中、华南稻区，在西北、西南、华北和东北部分稻区也有分布。白叶枯病在潮湿和低洼地区发病比较频繁，一般籼稻重于粳稻，双季晚稻重于双季早稻，单季中稻重于单季晚稻(过崇俭，1995，中国农作物病虫害，中国农业出版社，14-24)。受侵染的水稻一般减产20-30％，严重时能够达到50％(Ou，1985，Rice disease，2nd edition.)。白叶枯病造成米质松脆，发芽率降低。如果在分蘖期出现凋萎型白叶枯，则造成稻株的大量枯死，损失会更大。
根据对我国各个病区搜集的835个菌株在5个基本鉴定品种上的反应，将我国白叶枯病原菌分为7个生理小种，小种C2和C4是全国的优势小种，其次是小种C1和C3，小种C5、C6、C7是稀有小种。以不同稻区分析，北方稻区多为C2，C1和C3次之，小种C4和C6稀有；南方稻区以及长江流域主要是C4和C2，福建和广东有少量的C5小种(过崇俭，1995，中国农作物病虫害，中国农业出版社)。
水稻抗白叶枯病基因Xa4是一个在中国和其它亚洲国家的育种中广泛应用的基因(Min，1992，Agricultural Publisher of Science and Technology of China，Beijing，pp58-67)。该基因是一个全生育期显性抗性基因，主要抗白叶枯病菌菲律宾生理小种1、5、7和8(Ogawa等，1986，Rice Genet.Newsl.383-84；Yoshimura等，1995，Mol.Breed.1375-387；Zhang等，1998，Rice Genet.Newselt.1998，15138-142；Chaudhary，2000，RiceBreeding and Genetics，Published by science publisher，Inc，USA.pp.169-217)。Xa4基因对我国白叶枯病菌的7个生理小种(除在广东和福建少量出现的生理小种C5外)都有很强的抗性(过崇俭，1995；Chaudhary，2000)。该基因属于一种持久性抗病基因(Reddy和Bentur，2000，Rice Breeding and Genetics，Published by science publisher，Inc，USA.pp.143-167)。为进一步提高品种的抗性，将该基因和其它的抗病基因聚合在一起，使品种的抗性提高，抗谱变宽(Huang等，1997，Theor.Appl.Genet.95313-320)。通过对Xa4基因的克隆，研究其抗病机理，可以揭示该基因具有持久和全生育期抗性的原因。
Xa4基因首先在IR20，IR22和其它的几个水稻品种中被鉴定出来(Libroio等，1976，SABRAO J.8105-110；Olufowate等，1977，Phytopathology 67772-775；Petpisit等，1977，Crop Sci.17551-554)，并被定位于水稻第11染色体的末端(Yoshimura等，1995，Mol.Breed.1375-387)。Li等(1999，Mol.Gen.Genet.26158-63)鉴定出水稻品种特青也携带Xa4基因，并将其定位在第11染色体的两个分子标记RZ536和G2132b之间。Sun等(Theor.Appl.Genet.DOI 10.1007/s00122-002-1117-8)进一步将Xa4基因精细定位于第11染色体的一条47kb的DNA片段上。
在水稻第11染色体的Xa4基因区段还有抗白叶枯病基因Xa3(Yoshimura等，1995，Mol.Breed.1375-387)、Xa22(t)(Lin等，1996，Phytopathology 861156-1159)和Xa26(t)(中国专利申请号02139212.9)。Xa22(t)基因是一个广谱高抗基因(成株期抗性)，其染色体位点与Xa4紧密连锁或等位。Xa3基因抗白叶枯病菌菲律宾生理小种1-5，是成株期抗性(Ogawa等，1986，Rice Genet.Newsl.383-84；Yoshimura等，1995，Mol.Breed.1375-387)。Librojo等(1976，SABRAO J.8105-110)在Semora Mangga中鉴定了一个显性基因，成株期抗性，等位性分析表明这个基因和Xa4基因等位，Librojo等(1976，SABRAO J.8105-110)将其命名为Xa4b。Ogawa等(1986，Rice Genet.Newsl.383-84；)进一步分析认为Xa4b就是Xa3。由于用于等位性分析的群体较小，不能确定Xa3和Xa4是紧密连锁还是呈等位关系。采用分子标记分别对Xa3和Xa4基因进行了定位，二者的位置很接近，但不能排除它们是等位基因的可能(Yoshimura等，1995，Mol.Breed.1375-387)。遗传分析和基因序列分析证明Xa26(t)基因是Xa4的等位基因，但是两个基因的抗谱有差别(中国专利申请号02139212.9)。
控制白叶枯病害流行的最好的方法是改良水稻品种的抗性。转基因技术为品种改良提供了高效技术途径。但利用这一途径的前体是必须具有优良基因克隆。目前已被鉴定的抗白叶枯病基因有20多个，但国际国内已报道被分离克隆的抗白叶枯病基因只有两个Xa21(Song等，1995，Science 2701804-1806，美国专利号5,859,339)和Xa1(Yoshimura等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 951663-1668)。Xa21基因抗谱广，但它只具有成株期抗性。Xa1基因虽然具有全生育期抗性，但它的抗谱窄。另外，Xa21基因的知识产权不属于我国，使利用这个基因克隆改良水稻品种的抗性受到限制。Xa4基因在我国的水稻品种改良中具有很好的应用前景，获得Xa4基因克隆将有利于最有效地利用这一优良基因资源。
另外，获得抗病基因克隆也是研究水稻抗病机理的前提。揭示水稻抗白叶枯病的机理可以更好的控制和降低白叶枯病菌对水稻的危害。同时，对克隆的抗病基因的修饰和改造，可以人为控制和增加植物的抗病性，拓宽植物的抗谱。这些方面是采用常规植物育种和改良技术所不能达到的。
发明内容
本发明的目的是从水稻抗白叶枯病近等基因系IRBB4和籼稻品种特青中分离克隆抗白叶枯病基因Xa4和包含调控Ya4基因的启动子的DNA片段，利用这个基因改良其它水稻品种或其它植物抵御病害的能力。
本发明涉及分离一种包含Xa4基因的DNA片段，该片段赋予植物对由白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)所引起的病害产生特异性的抗病反应。这一发明适用于所有对该病原菌敏感的植物。这些植物包括单子叶植物和双子叶植物。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO1所示，或者基本上相当于SEQ ID NO1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO1所示序列的亚片段。该DNA序列编码一种受体蛋白激酶，它包含细胞外的LRR结构域和细胞内的蛋白质激酶结构域，其氨基酸序列如(附
图1)所示。
所分离克隆的Xa4抗病基因编码受体蛋白激酶。这种蛋白质包含两个主要结构域由26个LRR组成的胞外结构域和胞内的蛋白激酶结构域。已被克隆的水稻抗白叶枯病基因Xa21(Song等，1995，Science 2701772-1804)和Xa26(t)(中国发明专利申请号02139212.9)也编码受体蛋白激酶。Xa21蛋白的胞外结构域由23个LRR组成。另外，Xa4基因和Xa21基因编码的蛋白激酶结构域也存在序列上的差异。Xa26(t)蛋白的胞外结构域虽然也由26个LRR组成，但它与Xa4蛋白的LRR结构域存在序列差异。Xa4基因和Xa26(t)基因编码的蛋白激酶结构域也存在序列上的差异。Xa4基因中编码LRR或蛋白激酶结构域的核酸片段可能具有独立的功能。将Xa4基因中编码胞内或胞外结构域的片段与其它核酸片段重组，可构成嵌合基因或蛋白质，使之具有新的功能。对Xa4基因进行修饰或改造，可改变或增加基因的某种功能。例如，将该基因的胞外结构域替换为Xa21基因或Xa26(t)基因的胞外结构域，可能会增加或改变基因的抗谱；对该基因的胞外结构域进行定点突变，可能会改变基因的抗性和抗谱等。
本发明同样包括将Xa4抗病基因的主要结构部分有效连接上合适的调节序列所形成的嵌合基因，以及在基因组中包含这种基因的植物和这种植物的种子。如这种基因可以是天然的或是嵌合的。例如，将包含该基因的片段和一个组成型表达的启动子连接，该启动子可以在任何环境条件下和细胞发育的任何时期表达。这种组成型表达的启动子包括花椰菜花叶病毒35S的启动子等。另一方面，也可以将该基因和一个组织特异性表达的启动子或发育时期特异性表达的启动子或精确环境诱导的启动子连接，这些启动子称之为诱导型启动子。这样，环境的改变，发育时期的不同都可以改变该基因的表达，同样，也可以将该基因的表达限定在某一个组织内，使由该基因诱导的抗病反应得到人为的控制。其中环境条件包含病原菌的攻击、厌氧条件、和光等，组织和发育时期包括叶、果实、种子和花等。
本发明中，Xa4基因的内源启动子也可以控制该基因的表达。该启动子同样也可以控制嵌合基因或其它基因的表达。因此将该基因的启动子和任何其它基因连接、特别是与抗病基因连接，同样会改变植物的抗性，包括抗真菌和细菌的抗性的等。
在cDNA和基因组文库中，可以采用已经克隆的Xa4基因为探针，筛选到本发明的基因或同源基因。同样，可以在基因组中、mRNA和cDNA中，采用PCR技术，扩增到本发明中的DNA序列中任何感兴趣的一段或与其同源的一段。例如，所扩增的序列用于蛋白质的表达、用作探针筛选文库、测序或其它目的等。采用以上技术，可以分离到包含Xa4基因的序列，将这一序列与合适的载体连接，可以转入植物细胞，产生转基因植物。
将克隆的抗病基因转入感病的植物，有助于产生新的抗病植物。特别是可以用转化技术在植株中累加多个抗病基因，而不会产生传统育种技术中伴随出现的连锁基因组序列。抗病基因的克隆是克服传统育种不能在植物种间转移抗病基因的问题的前提。
在本文的实施例部分，我们阐述了Xa4基因的分离过程和该基因的特点。其流程如图2所示。
序列表、附图及其说明序列表SEQ ID No1.包括Xa4基因和Xa4基因启动子的基因组序列。
图1.Xa4基因编码的受体激酶类膜蛋白质的结构，其中包括两个主要的结构域富亮氨酸重复(LRR)和蛋白激酶(kinase)。在激酶结构域序列中用下划线标注的氨基酸残基与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的保守区很相似，与受体激酶的保守亚结构域相同。信号肽序列和LRR区之间有一段未知功能的序列，这段序列中包含一个CX6C结构(线条框中所示序列)。
图2.本发明分离克隆水稻抗白叶枯病基因Xa4的流程图。
图3.本发明的水稻抗白叶枯病基因Xa4在第11染色体分子标记遗传连锁图上的位置。
图4.用DNA杂交技术分析Xa4基因区段的BAC克隆之间的重叠关系。将提取的BAC质粒(33P4、65H1、3H8、5B14、31B6、65A17、39F18、26G20、57B2和38G13)用Hind III完全酶切，电泳后转移至尼龙膜。然后用经Hind III酶切消化、放射性同位素p32标记的BAC克隆3H8、39F18和57B2分别与尼龙膜杂交，根据杂交带型的重叠情况确定BAC克隆之间的重叠关系。
图5.覆盖Xa4基因区段的物理图谱。短横线代表不同BAC克隆。竖虚线表示某一BAC克隆包含的分子标记经过DNA杂交验证。分子标记之间的阿拉伯数字表示在F2群体中某一分子标记与Xa4基因之间存在重组的单株数目。Xa4位点被定位在BAC克隆3H8上。
图6.对水稻品种明恢63的BAC克隆3H8进行测序分析后，获得两条长DNA序列。一条长36.4kb，另一条长30.4kb。长36.4kb的序列中包含3个编码LRR-蛋白激酶类蛋白质的基因，分别被命名为RKa、RKb和RKc；这条序列中还包括一个编码蛋白激酶(kinase)类蛋白的基因。垂直虚线示来源于3H8的分子标记X4-88、Sub11、2/15B-29和M196-1在3H8或在RKa和RKb基因上的相对位置。分子标记之间的阿拉伯数字表示在F2群体中某一分子标记与Xa4基因之间存在重组的单株数目。根据这些结果和RT-PCR分析结果，可以确定明恢63中的RKa是Xa4的等位基因。
图7.从抗白叶枯病近等基因系IRBB4中分离克隆包含RKa基因同源序列片段的技术路线。
图8.水稻抗白叶枯病近等基因系IRBB4(IRBB4/Xa4)、特青(TQ/RKa)和93-11(9311/RKa)中的Xa4基因与明恢63中的RKa基因(MH63/RKa)编码的氨基酸序列比较。特青的TQ/RKb基因、93-11的9311/RKb基因和明恢63的RKb基因(MH63/RKb)编码的氨基酸序列的比较。“-”表示该处无氨基酸残基；“·”该处的氨基酸残基与IRBB4/Xa4相同。
图9.基因结构预测分析显示，来自于特青和IRBB4的12kb DNA序列中包含两个基因RKd2和Xa4的候选基因(与明恢63中的RKa同源的基因)。这两条序列在Xa4的候选基因的编码区没有发现核苷酸的差异；在Xa4的候选基因之前的非编码区和位于Xa4的候选基因前面的一个预测基因(RKd2)的外显子上各存在一个核苷酸的差异(箭头所示处)。这一结果说明在水稻品种“特青”中的抗病候选基因和IRBB4中的抗病候选基因的序列完全相同。
图10.特青BAC克隆26N11中的抗病基因家族的结构。对26N11进行测序形成三个大的重叠群。重叠群TQ/contig A包含六个抗病基因家族成员(RKd1、RKd2、TQ/RKa、/Rke1、Rke2和TQ/RKb)；重叠群TQ/contig B包含一个抗病基因家族成员(RKf)；重叠群TQ/contig C包含三个抗病基因家族成员(Rkg、TQ/RKc和RKh)。矩形代表基因的外显子，矩形之间用折线连接的区段代表内含子。两个相邻基因之间的DNA区段用直线表示。
图11.水稻品种“特青”BAC克隆26N11所包含的抗病基因家族成员编码的氨基酸序列比较。
图12.水稻品种“特青”BAC克隆26N11的序列与水稻品种“93-11”中的同源序列的重叠关系。其中TQ/contig A、TQ/contig B和TQ/contig C所示的长线条代表“特青”的序列，其它短线条代表“93-11”中与“特青”的序列同源的序列。
图13.PCR分析Xa4基因的突变F2株1-22的后代(F3单株)。用根据水稻品种“明恢63”中的RKa、RKb和RKc基因序列和特青中的RKd1基因序列设计的引物，通过PCR扩增并与它们的抗病亲本(IRBB4)和感病亲本(IR24)进行对照，分析各单株中RKa、RKb、RKc和RKd1的同源基因。其中RKa11L-RKa1R、RKa2L-RKa2R和RKa2L-RKa22R是根据“明恢63”中的RKa基因设计的引物。
图14.利用RKa-2L和RKa22R引物，通过PCR扩增IRBB4的总DNA和IRBB4接种白叶枯病菌1天(1d)、3天(3d)、5天(5d)以及对照(0d)的RNA反转录产物，检测Xa4基因是否含有内含子。
图15.Xa4基因内含子的剪切位点。
具体实施例方式
以下实施例中进一步定义本发明。根据以上的讨论和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
实施例一Xa4基因的遗传定位水稻抗白叶枯基因Xa4对许多白叶枯病菌生理小种具有抗性，为对该基因进行遗传定位，我们将带IR24和其近等基因系一携带有Xa4基因的IRBB4杂交，建立了约3000株的F2群体。对IRBB4和IR24以及整个F2群体接种白叶枯病菌生理小种PX061。接种后21天，调查病斑长度。IRBB4和IR24的平均病斑长度分别为4.9cm和22.4cm。从F2大群体中，随机地选出包含255个单株的小群体，测量每个单株的病斑长度，小群体内病斑长度和单株数的关系表现出明显的双峰分布。两峰的峰谷处于13-15cm的位置，一峰对应于抗性单株，另一峰对应与感病单株。计算两峰的单株数，抗性单株数和感病单株数之比符合3∶1的单基因遗传分离规律(x2＝0.32，P＞0.5)，说明IRBB4对白叶枯病菌生理小种PXO61的抗性由一个主效显性基因(即Xa4基因)控制。
在此之前，Yoshimura等(1995，Mol.Breed.1375-387)已将Xa4抗病基因初步定位于11染色体的末端。本发明首先选取抗病基因附近的分子标记进行分析。发现有6个RFLP(restriction fragment length polymorphism)标记(G181，R1506，S12886，L190，C10295和S10559)和1个SSR(simple sequence repeat)标记(RM224)在这个群体的两个亲本之间表现出多态性。用这些分子标记对255个单株的群体进行分析，建立了Xa4局部区段的精细遗传连锁图(图3)。Xa4基因被定位于两个R1506和S12886之间，并距离这两个标记各0.5cM。
实施例二建立覆盖Xa4基因区段的物理图谱Xa4基因区段的物理图谱的构建采用本实验室构建的明恢63 BAC文库。该文库由26,000个克隆组成，平均插入片段150kb，覆盖水稻基因组9倍(Peng等，1998，ActaBotanica Sinica 401108-1114)。我们首先采用和Xa4基因紧密连锁的分子标记筛选BAC文库。分子标记R1506属于单拷贝探针，用该探针从文库中筛选到3个重叠的BAC克隆，分别是33P4，65H1和3H8。分子标记S12886位于基因的另一侧，用该标记筛选到另外3个重叠BAC克隆，分别为26G20、57B2和39F18。另外，用与S12886共分离的分子标记Y6855RA(Harushima等，1998，Genetics 148479-494)鉴定出3个BAC克隆，分别是31B6、65A17和7M24。从保存的文库中将筛选到的BAC克隆取出，扩大培养，采用标准碱裂解法(Sambrook和Russell，2001，Molecular Cloning，Cold SpringHarbor Laboratory Press)分离提取BAC质粒。将所得BAC质粒用Hind III完全酶切、电泳、转移至尼龙膜；然后用Hind III完全酶切的BAC克隆作探针与载有BAC质粒的尼龙膜杂交，根据电泳位置相同的杂交带的有无和多少确立不同BAC克隆之间的重叠关系。两个BAC克隆分享相同的杂交带越多，则重叠区段越长，图4显示了跨越基因区段的10个BAC克隆之间的重叠情况。最后，从中确立了6个冗余最少的BAC克隆，建立了覆盖Xa4基因区段的重叠群(图5)。
为确定BAC克隆插入片段的大小，采用限制性内切酶Not I对BAC克隆进行酶切消化，1％琼脂糖脉冲场电泳分离酶切片段，并和已知大小的DNA片段的迁移率做比较，计算出插入片段的大小。电泳条件如下电泳缓冲液为0.5x TBE，转换时间(switch time)1-12秒，角度为120度，电压6V/cm，温度14C，电泳时间16小时。通过脉冲电泳分析，确定了由6个BAC克隆组成的覆盖Xa4基因区段的重叠群长约500kb。
实施例三、精细定位Xa4基因为精确确定Xa4基因的位置，我们采用和Xa4紧密连锁的标记筛选由642个纯合感病F2单株组成的群体寻找重组单株，该群体的所有单株的平均病斑长度都大于15cm。首先，我们采用两个SSR标记-RM224和RM144筛选，RM144距RFLP标记RZ5362.4cM，靠近基因的一侧(Temnykh等，Thero Appl Genet，2000，100697-712)。用位于Xa4基因一侧的分子标记RM224从F2感病群体中筛选到3个重组单株(108，21 and 5-13)，用位于基因另一侧的分子标记RM144从F2感病群体中也筛选到3个重组单株(10-11，16-5 and 4-17)。进一步以靠近基因的RFLP标记筛选这些单株，在RM224一端，用标记R1506检测到2个重组单株。在RM144一端，用标记L190检测到2个重组单株，而标记S12886没有检测到重组事件(表2)。在255株的随机F2群体中，我们发现一个抗性重组单株(39)，该单株在RM224一侧表现为杂合带型，在RM144一侧表现出纯和的感病亲本带型，说明在抗病基因和RM144之间有一个重组事件发生。分子标记S12886在该单株中也检测到这一重组事件。这意味着该重组发生在S12886和抗病基因之间。
表2.Xa4基因附近的分子标记在7个F2重组单株中的基因型F2单株a分子标记108215-133910-1116-54-17RM224 H H H H SS SR1506 S H H H SS SX4-88 S S H H SSSub11 S S S H SS S2/15B-29S S S H SS SM196-1 S S S S SSS12886 S S S S SS SL190S S S S HH SRM144 S S S S HH HaS，代表IR24的纯合基因型；H，代表两个亲本的杂合基因型；39是抗病单株，其它是感病单株。
为更精确的确定基因的位置，我们用RFLP标记Y6855RA和来自BAC克隆3H8的一个亚克隆M196-1作探针，在39号抗性单株中也检测到重组事件(表2)。这样，就将Xa4基因定位在BAC克隆3H8上(图5)。采用其它的几个来自BAC克隆3H8的亚克隆(X4-88，Sub11和2/15B-29)寻找分子标记和抗病基因间的重组事件。在RM224一侧，X4-88和抗病基因间只剩下一个重组单株，而Sub11和2/15B-29与抗病基因Xa4共分离。基于上述分析结果，我们将Xa4基因定位在M196-1和X4-88之间(图5)。
为确保抗病基因定位的准确性，我们对表2中所列的6个感病的重组单株和1个抗病的重组单株进一步进行了F3家系的接种鉴定。如果这些感病的重组单株F3家系内发生抗性的分离或抗病的重组单株没有发生抗性分离，说明这些单株属于假的重组单株，从而基因定位的位置也会随之发生变化。反之，说明基因的定位是正确的。结果表明对应于6个感病的重组单株的F3家系内各个单株都表现为感病，没有发生抗性的分离(表3)，而重组的分子标记位点发生了分离(RM224或RM144)。39号抗性重组单株的F3家系内表现出抗性分离(表3)，RM224位点发生了分离而RM144位点没有发生分离。这些结果证明Xa4的遗传定位是正确的。
表3. 7个F2重组单株的F3植株接种白叶枯病菌PXO61后的病斑长度aF2重组单株F3植株21 5-13108 39 10-1116-54-17123.528.830.58.128.8 24.423.9224.624.323.816.9 21.9 24.918.7324.725.027.211.2 24.4 24.121.5422.822.827.07.126.1 24.120.9523.824.625.17.022.0 18.023.8622.524.426.111.4 22.3 23.625.1726.826.926.824.1 19.2 25.621.2822.526.120.410.7 28.1 22.523.7923.422.727.28.822.7 24.510 27.623.731.210.0 22.3 22.311 25.823.728.15.323.8 22.712 27.725.924.69.213 26.323.924.819.314 25.825.57.715 22.316.516 9.0
17 9.818 18.019 12.520 10.4aF2群体的亲本IRBB4和IR24的病斑长度分别是5.1cm和27cm。
实施例四测序分析覆盖Xa4基因位点的BAC克隆和确定Xa4的等位基因1.BAC克隆3H8的Shotgun文库的构建采用超声波法(Sambrook和Russell，2001，Molecular Cloning，Cold Spring HarborLaboratory Press)构建Shotgun文库。用超声波处理明恢63 BAC克隆3H8的环形质粒，通过1％琼脂糖凝胶电泳分离出1.5-2.5kb的DNA片段，纯化后用T4-DNA聚合酶补平末端，与Sma I酶切的去磷酸化的pUC18载体平端连接，电转化大肠杆菌DH10B，进行蓝白斑筛选。提取阳性克隆质粒，并与空pUC18质粒进行电泳比较，剔除假阳性克隆及小片段克隆，或用BamHI和EcoRI双酶切，检测插入片段大小。
2.随机亚克隆片段的测序采用M13-R和M13-F引物、美国Perkin Elmer公司的测序试剂盒(Big Dye Kit)、以双脱氧核苷酸末端终止法分别从每个亚克隆的两端测序。测序仪为Perkin Elmer公司的ABI377 Sequencer。
3.原始序列的拼接使用Sequencher 4.1软件(美国Gene Codes Corporation)拼接序列。用Sequencher 4.1软件自动去除末端测序较差的序列和pUC18载体序列；用Sequencher 4.1软件没有去除干净的序列则用手工删除。BAC载体pBeloBAC11的碎片序列和污染的细菌DNA序列则通过和BAC序列进行比较或BLAST分析的方法(Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.253389-3402)加以去除。用Sequencher 4.1软件对两条序列进行拼接的参数是重叠序列长度(Mini Overlap)大于20bp(base pair)，重叠序列的一致性(Mini Match)大于85％。每一个碱基的确定都要参照重叠在该位点的多个Shotgun片段序列。对于由一个Shotgun片段序列所覆盖的区域要再次测序验证，以确保碱基的准确性。而由一个亚克隆覆盖的断口处，则对该克隆进行长序列胶测序或用primer walking的方法，填补缺口。
4.BAC克隆的序列分析首先用Blastn和Blastx方法(Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.253389-3402)分析所得序列。然后采用GenScan(htto//genes.mit.edu/GENSCAN.html)和Fgenesh(http//www.softberry.com/)软件分析预测基因结构，分析结果进一步用Blastp方法(Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.253389-3402)进行确证。两条或多条核苷酸或氨基酸序列的比较分析使用BLAST 2 sequence方法(Tatiana等，1999，FEMS MicrobiolLett.174247-250)和ClustalW方法(http//www.ebi.ac.uk)。
5.Xa4等位基因的确定在确定BAC克隆3H8包含Xa4基因位点后，测定整个3H8的序列，对序列拼接形成两个大的序列片段，一个片段长36.4kb，另一个片段长30.4kb，二者之间有一个小于1kb的间隙(图6)。3H8的亚克隆M196-1和X4-88分别处在这两个片段上。序列分析发现在36.4kb的片段上有3个区段编码LRR-蛋白激酶类蛋白，它们被分别称之为RKa、RKb和RKc(图6)。用GenScan、Fgenesh和Blastx分析表明，RKa、RKb和RKc是3个完整的基因。RKa和RKb的转录方向相同，而RKc的转录方向相反。其中RKa的编码产物与抗白叶枯病基因Xa26(t)和Xa21编码的产物同源性较高。采用RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)方法分析(具体操作方法见实施例七)，在IRBB4中检测到与明恢63 RKa和RKb同源的基因的表达，没有检测到与RKc同源的基因的表达。在RKa基因的前面，还有一个和蛋白激酶同源的序列(Kinase)(图6)，序列分析表明它不是一个完整的基因；用RT-PCR分析也没有检测到这段序列在IRBB4中表达。这一结果意味着Xa4基因很可能也编码一个LRR-蛋白激酶类蛋白质。根据GenScan、Fgenesh和Blastx分析结果，在长30.4 kb的序列中存在一个仅编码LRR结构域的基因和一个与细胞壁结合的受体激酶同源程度很高的基因(WAK)(图6)。用RT-PCR方法分析，没有检测到这两个基因在IRBB4中表达。
用BAC克隆3H8的亚克隆进一步分析表2所列、在Xa4基因区段发生重组的F2单株。亚克隆2/15B-29是RKa基因的一部分，它和IRBB4中的抗病基因共分离；亚克隆M196-1是RKb基因的一部分，它检测到一个重组交换单株(表2和图6)。以上结果表明，明恢63的RKa基因标记和Xa4基因共分离，由此推测水稻品种明恢63中的RKa基因可能是Xa4的等位基因。
实施例五Xa4基因的分离克隆1.从水稻抗白叶枯病近等基因系IRBB4中分离克隆Xa4的候选基因抗谱分析表明水稻品种明恢63不携带Xa4基因(Chen等，2002，Phytopathology92750-754)。而上述结果表明水稻品种明恢63中的RKa基因可能是Xa4的等位基因。在没有建立IRBB4基因组文库的情况下，如何通过已知的明恢63的序列尽快在IRBB4中获得RKa的等位基因是本发明的关键。若通过明恢63的序列设计引物直接扩增，由扩增带来的突变无法检测和排除，且长片段的扩增也比较困难。因此，此法不是最佳方案。对已知的明恢63序列进行酶切分析，发现限制性内切酶Spe I能够切下一个19.4kb、带有完整Rka基因的片段。用此酶对IRBB4的总DNA进行酶切分析，有一个大约12kb的片段能够和RKa基因探针杂交。pCLD04541载体多克隆位点上存在Spe I位点，且该载体比较容易装入大的片段。因此，本发明采用图7所示方案从IRBB4中分离与Rka基因同源的DNA片段。
采用RKa1L和RKa1R引物对(表4)，将每5个含有IRBB4 DNA片段的细菌克隆混合在一起，直接用细菌混合物进行PCR扩增筛选。大约能够在2000-3000个细菌克隆中筛选到1个阳性克隆。将所筛选到的阳性克隆进行酶切检测，以及用RKaL和RKaR引物对、RKa2L-RKa2R引物对(表4)扩增检测。用限制性内切酶将阳性克隆上的插入片段从pCLD04541载体上切下，连接到Xba I酶切的pUC18载体上，然后进行测序分析(测序方法同实施例四)。用GenScan、Fgenesh和Blastx分析显示，从IRBB4中获得的DNA片段含有一个完整的、与明恢63中的Rka基因同源的基因(图8)，即Xa4的候选基因。
表4.用于PCR、RT-PCR和RACE分析的引物引物名称 引物序列(5’-3’)RKd-F(Kinase) CGCATGTGTCAGACTTTGGTRKd-R(Kinase) GCAGGAAATGCCTGAAGAACLRR f-1 GCAAAGCACCCTCGAAIAAGLRR-r TTCTCCATTGATGCCAACAAWAK-kinase1F TAGGAGCACAACCCCAAAACWAK-kinase1R ATAGGGTGCTGCATGGAAACRKaL CTGGCTCTGTCCCATCAAATRKaR GCTGAAAGCAAAAGCTCCAARKa1L GGTTAGTCACAAGTGGGAAAGGRKa1R AAGATGAAATATGCTCGGTGGTRKa2L CTGCATGGTCAGAIACCAAAAGRKa22RTACGGGATCATGCTACTCGARKa11LTTGGCTTGAACGGCTTAACTRKa11RGTTAAGCCGTTCAAGCCAAGRKa111R GTGGAGAAGCAGCACTCACARKbL GGCTTGCAAACTTTGGACATRKbR GCTTCCCTTGTTCTGAGTGCRKb2R CAGTCCACCACATGGACAAGRKb/3’race-2 TGGTCAAATACCGGAAGGAGRKbL/3’race-1CCATCCCAAACTACTTGGCTAadaptor CTGATCTAGAGGTACCGGATCCOligo-dT17-adaptorCTGATCTAGAGGTACCGGATCC(T)17RKcL TGTTTCGAGTGGCATACAGC
RKcR ATGAGCCGAGCAATGATACCRace ATCAACCGGCARKb/5’-race-A1 GCGTGTCCATACCTCCAAGTRKb/5'-race-A2CCAATCTTGATGCCATCTCCRKb/5'-race-S1CGTAGAACTGGGAGGCTGAARKb/5’-race-S2 CCGCCCCAGTTAAGTTATTG2.从水稻品种特青中分离克隆Xa4的候选基因Li等(1999，Mol.Gen.Genet.26158-63)认为水稻品种特青携带Xa4基因。本发明中的接种鉴定也进一步显示特青对所接种的几个白叶枯病菌生理小种的抗谱与IRBB4表现相同。用明恢63的RKa基因片段作探针，从用特青构建的BAC文库(Zhang等，1996，Mol.Breed.211-24)中筛选到两个BAC克隆，分别为25P4和26N11。用限制性内切酶Spe I对这两个BAC克隆进行消化、电泳、转移至尼龙膜，用RKa基因片段作探针与尼龙膜杂交，检测到一条约12kb的杂交带。克隆这个12kb的DNA片段，然后测序。将特青中的12kb DNA序列与IRBB4的12kb序列比较分析，在Xa4的候选基因的编码区没有发现核苷酸的差异；在Xa4的候选基因之前的非编码区和位于Xa4的候选基因前面的一个预测基因(RKd2)的外显子上各存在一个核苷酸的差异(图9)。这一结果说明特青中的抗病候选基因和IRBB4中的抗病候选基因的序列完全相同。
3.序列分析特青BAC克隆26N11中的抗病基因家族的结构特青BAC克隆26N11包含与明恢63中的RKa基因同源的序列。对整个BAC克隆26N11进行测序和序列拼接(操作方法同实施例四)，形成几个大的重叠群(contig)。BLAST分析显示，其中3个紧邻的重叠群包含抗病基因同源序列。这3个重叠群分别为TQ/contig A(33.1kb)、TQ/Contig B(25.5kb)和TQ/Contig C(31.3kb)(图10)。TQ/Contig B和TQ/contig C之间存在一个小于2kb的序列间隙，TQ/contig A和TQ/Contig B之间的序列间隙包含两个约2-3kb大小的重迭群。本发明主要对这3个大的重叠群的序列进行了分析。
用GenScan、Fgenesh和Blastx分析显示，TQ/contig A包含两个完整的编码LRR-蛋白激酶类蛋白的基因(图10)，其序列分别对应于明恢63中的RKa和RKb基因；这两个基因分别被命名为TQ/RKa和TQ/RKb。本实施例的第1和第2节中已说明TQ/RKa基因是Xa4的候选基因。在TQ/RKa基因的两侧各有两个不完整的编码LRR-蛋白激酶类蛋白的基因，分别被命名为RKd1、RKd2、RKe1和RKe2(图10)。RKd1和RKe1编码的氨基酸序列与LRR结构域有同源性；RKd2和RKe2编码的蛋白和受体激酶的激酶区同源性很高。根据目前的分析结果，不能排除RKd1和RKd2是一个基因的可能性，但即使确定它们是一个基因，这一基因仍然不完整；RKe1和RKe2可能是同一个基因，但尚需进一步分析。
序列分析显示TQ/contig B上有两个基因(图10)，其中RKf编码LRR-蛋白激酶类蛋白，但基因结构不完整。另有一个基因(Pol)与copia类反转录转座子的Pol基因(GenBank注册号AC091665)同源性很高(Score＝139，E value＝1e-55)。
BLAST分析显示TQ/contig C上的TQ/RKc基因对应于明恢63中的RKc基因(图10)。这个重叠群上的另外一个基因RKg和LRR-蛋白激酶类基因相似，但是基因结构不完整。TQ/contig C上的第三个基因是RKh，它仅编码LRR-蛋白激酶类蛋白的激酶结构域部分，其结构不完整。
综合上述分析，可以将特青BAC克隆26N11上包括的LRR-蛋白激酶类基因根据其编码产物的完整性分为两类第一类包括三个基因，即TQ/RKa、TQ/RKb和TQ/RKc，它们是结构完整的基因；第二类基因包括RKd1、RKd2、RKe1、RKe2、RKf、RKg和RKh，它们的结构都不完整，基因内有缺失，是假基因。以上各基因可能编码的氨基酸序列的比较见图11。序列比较分析显示特青中的TQ/RKa、TQ/RKb和TQ/RKc基因分别是明恢63中的RKa、RKb和RKc基因的同源基因。对Xa4基因的遗传分析提示明恢63中的RKb和RKc都不是Xa4的等位基因，而RKa是Xa4的等位基因(图5和图6)。因此，对特青BAC克隆26N11进行测序分析更进一步确认特青中的TQ/RKa和IRBB4中与TQ/RKa序列完全相同的基因就是Xa4基因。
4.包含Xa4基因家族的染色体区段的序列与水稻品种93-11序列的比较分别用明恢63 BAC克隆3H8和特青BAC克隆26N11的DNA序列检索已公布的水稻品种93-11基因组框架图序列(http//btn.genomics.org.cn/rice)，然后用Sequencer软件、ClustalW和Blast 2 sequence分析方法分别比较3H8序列和与3H8同源的93-11序列，以及26N11序列和与26N11同源的93-11序列。分析结果显示93-11的序列与特青26N11的序列同源性很高，而与明恢63 3H8的序列差异很大。图12显示检索到的与特青26N11同源的93-11的序列和特青序列的重叠关系。93-11的序列和特青中对应的序列同源性很高，在大部分区段只表现为个别碱基的差异。但是在特青的TQ/RKa基因和RKe1基因之间，93-11的同源序列中存在512bp的缺失。将特青中的TQ/RKa、TQ/RKb和TQ/RKc基因的序列与93-11中分别与它们同源的序列9311/RKa、9311/RKb和9311/RKc比较，发现QT/RKa与9322/RKa完全相同，TQ/RKc与9311/RKc之间有小的差异，而TQ/RKb与9311/RKb差异很大。9311/RKb内存在较多的终止密码子。
比较分析IRBB4和93-11对不同白叶枯病菌生理小种的抗性，发现它们的抗谱完全相同(表5)。综合以上分析，说明IRBB4中的Xa4基因的候选基因(即明恢63中的RKa基因的等位基因)、特青中的TQ/RKa基因和93-11中的9311/RKa基因序列完全相同，它们是同一个基因，即Xa4基因。
表5.水稻品种IRBB4和93-11对不同白叶枯病菌生理小种抗性(病斑长度，cm)的比较(2002年)
实施例六Xa4基因突变体的分析对Xa4基因进行遗传定位分析过程中，在F2群体内发现一个奇怪单株(1-22)。这个单株在抗病基因两侧的标记如RM224、R1506、L190和RM144位点处都是杂合带型，而该植株表现型却是感病，似乎在抗病基因的两侧都发生了交换(表6)。但这种情况发生的几率很低，为了排除田间调查出错的可能性，进一步对F3家系进行了分析，结果见表7。表7所示F3家系的各个单株，不论RM224标记所示的基因型是什么，皆表现为感病。这些结果排除了田间调查出错的可能性。
表6.突变感病单株1-22在Xa4基因区段的基因型分子标记基因型RM224 杂合R1506 杂合X4-88 感病亲本(IR24)的带型RKd1缺失RKa 缺失RKb 两个亲本的带型(无差异)M196-1 含亲本不存在的异常带型RKc 含亲本不存在的异常带型S12886 含亲本不存在的异常带型L190杂合RM144 杂合表7.突变单株1-22后代(F3)单株的表型和基因型RM224a病斑长度(cm)
1R 24.02R 27.03H 22.34R 24.2突 5H 22.8变 6H 26.0株 7H 25.7后 8R 26.5代 9R 24.4单 10 R 23.1株 11 H 24.812 R 28.3IR24 S 27.1IRBB4R 5.1aS，感病亲本(IR24)带型；R，抗病亲本(IRBB4)的带型；H，杂合带型.
进一步对这个感病突变单株的位于抗病基因两侧的分子标记进行分析，发现RFLP标记S12886和BAC克隆3H8的亚克隆M196-1位点处呈现异常带型(既非感病亲本也非抗病亲本的带型)，3H8的另一个亚克隆X4-88位点处为感病亲本的带型(表6)。用根据明恢63中的RKa、RKb和RKc基因序列设计的引物对这个突变株的F3代单株的DNA进行PCR扩增，用RKb基因的引物能够扩增出与这个突变株的两个亲本大小相同的产物；用RKc基因的引物扩增，突变单株多出了一条扩增产物；用3对RKa基因的引物(RKa11L和RKa1R、RKa2L和RKa2R、RKa2L和RKa22R)扩增，除了在RM224位点表现为杂合带型的F3家系第6号单株(表7)有扩增产物外，其它F3单株都无扩增产物(图13)，说明RKa基因区段发生了缺失。同时缺失的还有RKd1(LRR)基因部分。这些结果表明，由抗病亲本提供的配子发生了突变。这一结果从另一方面证明IRBB4中与明恢63 RKa等位的基因就是Xa4基因。
实施例七Xa4基因结构分析
1.总RNA的抽提总RNA的抽提采用TRIzol Reagent(美国Invitrogen公司)。操作方法按公司提供的试剂盒说明书进行。
2.RT-PCR分析将接种白叶枯病菌生理小种PXO61的明恢63叶片和未接种白叶枯病菌的明恢63叶片用于RT-PCR分析。RT-PCR以两步法进行(Zhou等，2002，Science in China45449-467)。首先，将用于反转录的总RNA用无RNA酶活性的DNA酶I处理，去除总RNA中可能污染的DNA；将总RNA在65℃处理10分钟，灭活DNA酶I；然后加入Oligo-dT15，将RNA在72℃变性5分钟，再加入dNTP、反转录酶等，在42℃反转录90分钟。第二步，取1微升反转录产物作PCR反应。
PCR反应引物对于WAK基因WAK-kinase1F和WAK-kinase1R(表4)对于LRR基因LRR f-1和LRR-r(表4)对于Kinase(Rkd)基因RKdL和RkdR(表4)对于IRBB4和特青中的Xa4基因RKaL和RkaR，RKa2L和RKa22R(表4)对于特青中的TQ/RKb基因RKbL和RKbR，RKb2R和RKb/3’race-2(表4)对于特青中的TQ/RKc基因RKcL和RKcR(表4)3.基因末端序列分析采用大连TaKaRa公司的5’Full RACE Core Set试剂盒和3’RACE Core Set试剂盒，通过5’-RACE(rapid amplification of cDNA end)和3’-RACE分析方法，确定Xa4基因的5’和3’末端序列。
进行3’-RACE的反转录和做RT-PCR的反转录条件一样，只是用Oligo-dT17-adaptor代替Oligo-dT15。反转录完成后，进行两轮扩增。第一轮扩增引物是RKbL/3'race-1和adaptor；第二轮扩增引物是RKb/3’race-2和adaptor。然后通过电泳回收目标大小的片段，用pGEM-T Vector System I试剂盒(美国Promega Corporation)对回收片段进行克隆。最后对克隆进行测序分析。
采用SuperscriptTMII反转录酶(美国Life Technologies公司)进行5’-RACE的反转录反应；用于反转录的特异性引物Race(表4)的磷酸化采用T4 polynucleotide kinase(美国MBI Fermentas公司)，反应按试剂说明书进行。磷酸化后的引物用10mol/LNH4AC-乙醇沉淀，纯化。以后的操作按TaKaRa公司提供的试剂盒说明书进行。进行5’-RACE第一轮扩增的引物是RKaL和RKa11R；第二轮扩增引物是RKaL和RKa111R。
4.基因内含子的确定采用GenScan(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)软件对包含Xa4基因区段的基因组DNA的分析发现在编码激酶结构域的区段存在一个内含子，采用跨越该区段的引物RKa2L和RKa22R扩增基因组DNA和RNA反转录产物，RT-PCR产物比从基因组中扩增出的产物小，这说明该区段确实存在一个内含子(图14)。将RT-PCR产物克隆、测序、与基因组DNA比较，确定内含子长96bp以及该内含子的剪切位点(图15)。采用Xa4基因区段的其它引物进行RT-PCR、5’RACE和3’RACE分析，没有再发现其它内含子的存在。
5.基因结构Xa4基因的5’端位于基因起始密码子上游24bp(序列表SEQ ID NO1所示序列的2389bp)处，3’端有两个不同的末端，分别位于终止密码子下游77bp(序列表SEQID NO1所示序列的5882bp)和216bp(序列表SEQ ID NO1所示序列的6021bp)处。该基因由两个外显子和一个内含子组成(图9)。外显子1长2911bp(序列表SEQ IDNO1所示序列的2413-5323bp)；外显子2长386bp(序列表SEQ ID NO1所示序列的5420-5805bp)；内含子靠近基因的3’端，长96bp(序列表SEQ ID NO1所示序列的5324-5419bp)，位于编码蛋白激酶的结构域内。Xa4基因的编码区长3297bp，编码1099个氨基酸。
实施例八Xa4基因的产物和特征根据Xa4基因的结构特征和对该基因表达序列的分析，以及结合BLAST分析，可以确定这个基因编码一种受体激酶类膜蛋白质(图1)。这个膜蛋白质的胞外的结构域由26个LRR组成，其保守结构特征为L/I/VXXL/MXXLXXL/I/VXL/VXXNXL/FXGXI/L/VPXX(其中X代表任意氨基酸残基)。该保守结构特征与已知的LRR-蛋白激酶类蛋白质的LRR结构基本相同(Torii和Clark，2000，InKeris M，Walker J C and Callow J A.Plant Protein Kinases，Advances in BotanicalResearch.Academics Press)。与上述LRR的保守结构特征相比，在Xa4基因编码的26个LRR中，第1个LRR不完整，第6和11个LRR中间多一个氨基酸残基，第8和第15个LRR分别在末端多出一个和两个氨基酸残基。
LRR区和信号肽中间的一段序列存在一个保守的CX6C(X代表任意氨基酸残基)结构(图1)。CX6C结构可能是受体激酶类蛋白组成二聚体的时候形成二硫键的位点(Torii and Clark，2000)。在LRR区之后，有一段33个氨基酸的序列，它和LRR的保守结构同源性较差。
Xa4基因编码的受体激酶另一个主要结构是蛋白激酶结构域(图1)。其中的DLKPSN和GTVGYMAPE序列分别与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶VIb区和VII区的保守性标志序列-DLKPEN和G(T/S)XX(Y/F)IAPE(X代表任意氨基酸)很相似，与已知受体激酶的保守的亚结构域序列相同(VIb-DφKXSN和VIII-GTXGYφAPE，其中φ代表脂肪侧链氨基酸，X代表任意氨基酸)。
术语定义本说明书、权利要求书和其它有关该专利申请文字材料中使用的术语的定义如下术语“植物”包括整个植株、植物的组织(如叶、茎、根等)、植物种子、细胞和其后代。本文中的植物主要是指可以用于转化的高等植物，包括单子叶植物和双子叶植物。
“抗病基因”是指编码能够在植物细胞或植物组织中激发防卫反应的多肽的基因。抗病的植物表现出较短或很短的菌斑，感病的植物菌斑很长。
“防卫反应”是由寄主(如植物)产生的特异性、抵抗侵染因子或病原体存在的防卫反应。
“分离的核酸片段”是单链或双链的RNA或DNA聚合物，包括含有合成的、非天然的或改变的核苷酸。DNA聚合物形式的分离核酸片段可以包含一个或多个cDNA、基因组DNA或合成DNA区段。
“功能等同的亚片段”是指分离的核酸片段的一部分或亚序列，其中无论这些片段或亚序列是否编码活性酶，都保留改变基因表达或产生一定表型的能力。如所述片段可用于嵌合基因的设计或反义抑制等。
“基因”是指表达特定蛋白的核酸片段，包括所述编码序列之前(5’非编码序列)和之后(3’非编码序列)的调节序列。“天然基因”是指同自然界中发现的一样具有其自身调节序列的基因。“嵌合基因”是指非天然基因的任何基因，包括在自然界中未发现在一起的调节序列和编码序列组成的基因。因此，嵌合基因可以包括得自不同来源的调节序列和编码序列，或得自同一来源、但排列方式不同于天然形式的调节序列和编码序列。“内源基因”是指在生物体的基因组中于天然位置的天然基因。“外源基因”是指不是在所述寄主生物体中发现的、而是通过基因转移被引入所述寄主生物体中的基因。外源基因可以包括插入非天然生物体中的天然基因或嵌合基因。“转基因”是已经通过转化程序被引入基因组中的基因。
“编码序列”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“调节序列”是指位于编码序列上游(5’非编码序列)、之中或下游(3’非编码序列)影响所连接的编码序列转录、RNA加工、稳定性或翻译的核苷酸序列。这种序列可以是天然的或是非天然的。调节序列可以包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和聚腺苷酸化识别序列。
“病原体”是指其侵染到活植物组织的细胞周围或细胞中激发病害反应的生物或侵染性因子。
“启动子”是指能够控制编码序列或功能RNA表达的DNA序列。启动子序列包括邻近的上游元件和更远的上游元件，后者通常被称作“增强子”。因为增强子是刺激启动子活性的DNA序列，可以是所述启动子的固有元件，或是插入的以提高启动子水平或组织特异性的异源元件。启动子可以全部衍生自天然基因，或可以由衍生自自然界中发现的不同启动子的不同元件组成，或甚至包括合成的DNA区段。本领域技术人员会理解，不同的启动子可能指导基因在不同组织或不同细胞类型中表达，或指导基因在不同发育阶段表达，或对不同环境条件应答而指导基因表达。引起基因在大多数时间、大多数细胞类型中表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。另外，由于在大多数情况下尚未完全确定调节序列的实际边界，因此某些变异的DNA片段可以具有相同的启动子活性。
“内含子”是基因中不编码蛋白质序列的间插序列。虽然这种序列被转录成RNA，但随后被剪切去掉。该术语也用于被切下的RNA序列。“外显子”是基因中被转录且存在于成熟的信使RNA中的序列，但不必是编码最终基因产物的序列的一部分。
“3’非编码序列”是指位于编码序列下游的DNA序列，包括聚腺苷酸化识别序列和编码能够影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其它序列。通常，聚腺苷酸化信号的特征在于影响聚腺苷酸序列段添加至mRNA前体3’端。Ingelbrech等，1989，Plant Cell1671-680例举了不同3’非编码序列的应用。
本文中的“表达”是指功能性终产物的产生。基因的表达或过量表达涉及该基因的转录和所述mRNA翻译成前体蛋白或成熟蛋白。
“转化”是指将核酸片段转移到寄主生物体的基因组中，并形成稳定的遗传。带有所述转化核酸片段的寄主生物体被称为“转基因”生物。水稻、玉米和其它单子叶植物的优选细胞转化方法是应用加速粒子或“基因枪”转化技术(Klein等，1987，Nature32770-73；美国专利第4,945,050号)，或采用合适的含所述转基因的Ti质粒的农杆菌介导的方法(Ishida等，1996，Nature Biotech.14745-750)。
“表达构件”是指所分离的核酸片段单独使用，或与载体和其它的亚片段结合使用所形成的新的核酸片段。如果使用载体，载体的选择决定于将来转化寄主植物的方法。“表达构件”和“重组表达构件”在本文中通用。
“PCR”’或“聚合酶链式反应”是用于合成大量特定DNA区段的技术，由一系列重复的循环组成(Perkin Elmer Cetus Instruments，Norwalk，CT)。通常由连续的三个步骤构成一个循环将双链DNA于高温(如95℃)下变性，将两种与靶区段的3’边界互补的引物于低温(如55℃)下退火然后在中温(如72℃)下延伸。
水稻抗白叶枯病基因Xa4Organization Applicant----------------------Street狮子山街City武汉State湖北省Country中国PostalCode430070PhoneNumber027-87282038FaxNumber027-87397735EmailAddresszhanghb@mail.hzau.edu.cn<110>OrganizationName华中农业大学Application Project-------------------<120>Title水稻抗白叶枯病基因Xa4<130>AppFileReference<140>CurrentAppNumber<141>CurrentFilingDate2002-11-11Sequence--------<213>OrganismName水稻(Oryza sativa)<400>PreSequenceString1gcgggctggc gcccggctag cggtccaaac ggcgacagga gggaggggag atgacgccgg 60cgggaggaaa agggagaaaa ggagggagag aaaggggttt gcccctttgc cgatttggga 120aaaaggagga ggggagcggg gcggtttgac agagggagtg gagggctcgg cctccgcctc 180ttggcagctt gcgcgcagag tggcggggtc gggcggtgac gacggcgagt ggattggagc 240ggagcggcga caccggtgac aggcgagcgc agaggctgac ggcggcgttg atcgggcggt 300cggccactcg gctcgcgcgc ggctggcaac gggcggcgtc cgcgcgggcg cgcacacgct 360ggcccgcggg gccgactggt tgcgcggcag caggcgacgc ggctcgggcg ggaaaccact 420cgggcgcggc ggctcacgcg cacgcgcgcg tggcgcgcgg gccgggcgga gaaggagcgg 480agatggagga gggggtgctc gttgcgcggc tctcgcgcgc gcgaggcggt cagggctgag 540cggggggggg gaagaaggcg ctcggggcgg cgcgcgagcg gcgcgcgggc gaggctgtgc 600gggggggggg ggaaagagac gccgtgggag agagagaggg agagagagag agagagcact 660cgggagaggg agagagggag atgggaaaaa gagagatggg ccgagcgaga ttcggcccat 720cgacctcggg gaggcaaaat agacttttgc ggaggaattg atttggaagg atttggattc 780ggaattgaac tcgacgatag atcggggatt gagatcatga gatggcacgg acactagaca 840acaatcaaag aaacaaattt cgcaattagg gtttttcgga gataaatttt cccgctaggc 900gccacgacgg aacgggcgct acacaatgga atacctgcac catgagcact gcgaagtggt 960tctgcactgt gatttgaagc ctagcaacgt gctatttgat gatgacatga cggcgcatgt1020gtcagacttt ggtattgcaa ggctgctgtt aggtgatgat agctccatga tttctgctag1080catgccagga acagtcaggt acatggcacc aggtaagcta gtatcatctg ttttgctgaa1140tccttgctga tcttttatag agtaattatc aagtggtgca actaatgttt ggtgatcatt1200ttttcttgag cagagtatgg cgcccttggt aaagcatcac ggaagagcga tgtattcagc1260tatgggatca tgttgcttga agtgttcact gcgaagagac caacagatgc tatgtttgtg1320ggagaactaa acatcaggca gtgggttctt caggcatttc ctgcaaacct tgtccatgtc1380atagatggcc aacttgtaca ggacagctct tcttctacca gtagcattga cggctttctt1440atgccagtgt ttgaattggg cttgctctgc tcgtctgact cgccagagca aagaatggtg1500atgagtgatg ttgttgtgac gttgaagaag attaggaagg agtacgtcaa gtcgatagca1560
水稻抗白叶枯病基因Xa4actatgggaa gagatgagaa ccgaacagca gtgttccatt gaccctgcct gactgcatat1620acgaaagaac gaatcatcct ctgcacccat atttgcttct gcattaagaa taacagaata1680atagcatcag caacttgtcc aatgatcaat tactctttac ttctttatgt gtatggatga1740atatgaataa atctcttatg tttcttagct agttacacaa tatttaaatt gtgtacatgt1800atgattgatc tgctgcttca tggatttgca ccatgatatg gttgtaaatg atctgctatt1860aaaatatgct ttatgtccag gccaacataa gaaagaatat tctaacctag aaaggaatga1920agtttgggtg taaacattca agataagaca tggacttcac tggttgcctg acaggccagc1980tctgcttata ggccgcagga taattttcct catttctttt ttttttttta caatttgcaa2040aatctttgat ttataaaatt gtagtcatta tttagaacag gtcaatgata ccgaaattaa2100cgagtatgca acagtcaggg agataatctt ttctaagaat actgatagct atttgtcctg2160tatctatcaa ggtcttggtt agtcacaagt gggaaaggga aaaagttgca tgtgctcata2220tgcttttaga ctagggaagg aaaaatcatc atgcatgctt ggacagttgg acttgttcat2280gtcaggttga ccaatagtca acatcttaga tttagaaaga accagatgcc tgcatgcaca2340atggaatgga gagctaaata aattaacctc aagctgatta ttcctgccgt gccaatgcat2400aagagctcag acatggcgct tggattgcta gtatggatat acattgtgct gttgattgct2460ctgtccactg tgagtgctgc ttctccacca ggtccgagca agagcaacgg cagcgaaacc2520gaccttgctg cactgctggc tttcaaagcg cagctgagtg atcctctcag catccttggc2580agcaattgga cagtcggcac gccattctgc cgatgggtgg gtgtttcttg cagccaccac2640cagcagtgcg tcactgccct agatttgcgg gacactcctt tgctaggaga gctcagccct2700caactcggta acctctcttt cctctctatc ctcaacctca ccaacaccgg cctcacgggg2760tcactcccgg atgatatagg aaggcttcat cgcctcgaga tacttgagct tggctataac2820actctgtcag gtagaatccc agctaccata gggaacctca cgaggcttca agttcttgat2880ctccagttta acagtctatc tggtccaatc ccagcagatc tgcagaacct gcagaacctt2940agtagtatta atctccgtag gaactacctc attggcttga taccaaacaa tctattcaac3000aatacacatt tgctaactta tctcaacatt ggtaacaaca gcctgtccgg accaatacct3060ggttgcattg gctccttgcc aatactacag actctcgtcc tgcaagtcaa taatctcaca3120ggcccagttc caccagccat ctttaacatg tctacgctgc gtgctttagc tcttggcttg3180aacggcttaa ctggtcctct ccctggcaac gcaagtttca acctcccagc tctgcaatgg3240ttctccatca ctagaaatga tttcactggt ccaattccag tagggcttgc agcatgccag3300tacctccaag ttcttggcct gcctaataat ttattccaag gtgctttccc accatggctg3360ggcaaactga cgaatctcaa tatcgtctcc ttgggaggga atcaacttga tgctggtccg3420atccctgctg cacttggcaa cctcaccatg ctgagtgtcc tagatctcgc atcatgcaac3480ctaacaggac ccataccggc ggacattcga cacctaggcc aactttcaga gttgcatctt3540tcaatgaatc aactaacagg acccattcct gcttctattg gcaacctttc tgcattatca3600tacctgctat tgatgggaaa catgttggat ggattagtac cagcaacagt tggtaacatg3660aactcgctaa ggggattaaa tattgcggaa aaccacctac agggggatct tgaattcctt3720tctactgttt ccaactgtag aaagctctct ttccttcgag ttgactctaa ttatttcact3780ggaaacctcc cagactacgt aggtaacctg tcaagcacac tgcagtcatt tgttgtagct3840ggaaacaagt taggtggtga aattccgtct accatttcga atttaactgg cctcatggtg3900ctagcacttt cggataatca attccatagt acaataccag aatcaatcat ggaaatggtg3960aatctccggt ggcttgatct cagtggaaat agcctggctg gctctgtccc atcaaatgcc4020ggaatgctaa agaatgctga aaagctattc cttcaaagca acaaattatc tggctccata4080ccaaaggaca tgggcaacct caccaagtta gagcacctag tactatcaaa taaccaatta4140tcatcaactg taccaccgag catatttcat ctttctagcc ttatccagtt agacctatct4200cataactttt tcagtgatgt gttgccggtt gatataggca atatgaagca aattaacaac4260atagatctct ctaccaatcg ctttactggt agcatcccaa attcgattgg gcaacttcaa4320atgatatcct acttgaacct atctgttaat tcattcgatg attcaattcc agattctttt4380ggtgagctaa ctagcttgca gactttggat ctatcccata ataatatttc tggtaccatc4440cccaagtatc tagccaattt taccatactt attagcttga acttgtcttt caacaatctc4500
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权利要求
1.赋予植物Xa4基因介导的对白叶枯病菌抗性的DNA片段，其中所述的片段如序列表SEQID NO1所示，或者基本上相当于SEQ ID NO1所示序列，或者与SEQ ID NO1所示序列的一部分功能等同的亚片段。
2.权利要求1的DNA片段，其核苷酸序列包含全长的Xa4基因，该基因编码的蛋白质包含富含亮氨酸重复序列结构域(LRR)和蛋白激酶结构域，其氨基酸序列如附图1所示。
3.包含与合适调节序列连接的权利要求1的基因编码区DNA片段。
4.权利要求1中的DNA片段，其中的基因编码区与其它的基因形成嵌合基因，或者其中的基因经过修饰改造。
全文摘要
本发明涉及植物基因工程技术领域。具体地涉及一种DNA片段的分离、克隆。所述的DNA片段能够赋予植物抵抗由白叶枯病菌引起的病害。将该片段与其内源调节序列直接转入植物体，或者将该片段和合适的调节序列连接后转入植物体，转基因植物可以产生Xa4介导的对多种病原菌的防卫反应。
文档编号C07H21/04GK1498893SQ0213925
公开日2004年5月26日 申请日期2002年11月11日 优先权日2002年11月11日
发明者王石平, 孙新立, 曹应龙, 张启发 申请人:华中农业大学