专利名称：恶性疟原虫msra-1基因、其蛋白产物及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种恶性疟原虫新基因，其被命名为msra-1，其编码一种来自恶性疟原虫的疟疾病人血清识别抗原(malaria infectedpatient serum recognizing antigen-1 of P.f)。本发明还涉及所述基因编码的蛋白质产物，以及所述基因和蛋白质在抗恶性疟原虫方面的免疫学用途。
背景技术：
疟疾是当今世界上最致命的流行病之一。目前，全世界有近40亿人口生活在疟疾流行区，每年大约有3-5亿新的感染者出现，并且每年约2-4百万人死于该病。在疟疾最严重的南撒哈拉地区，每年因疟疾而消耗1％-4％，约合120亿美元的国民生产总值。疟疾成为该地区经济发展的最大障碍。疟疾的致病原是疟原虫。疟原虫的生活史如下在人体内进行无性增殖、开始有性增殖和在蚊体内进行有性增殖与孢子增殖。红外期(exoerythrocytic stage)始于受染的雌性按蚊(Anopheles sp.)吮吸人血，疟原虫子孢子随蚊唾液进入人体血循环，半小时后全部侵入肝细胞，速发型子孢子立即进行裂体增殖，迟发型子孢子则进入休眠状态。在肝细胞内裂体增殖的疟原虫，经过5～40天发育成熟，胀破肝细胞逸出成千上万的裂殖子(merozoite)进入血流，进入血流的裂殖子部分被吞噬细胞吞噬杀灭，部分侵入红细胞并在其内发育增殖，进入红细胞内期。红细胞内期(erythrocyticstage)初，虫体呈环状，为环状体即小滋养体。环状体发育长大为滋养体或大滋养体。滋养体继续发育，其核与原浆进行分裂，形成裂殖体(schizont)。成熟的裂殖体破裂，裂殖子逸出，一部分再侵入正常红细胞，一部分被吞噬细胞吞噬。经过细胞内3～5次裂体增殖后，部分进入红细胞的裂殖子在红细胞内不再进行无性分裂，而逐渐发育成为雌或雄配子体。配子体在人体内可生存2～3个月，此期间如被雌性按蚊吸入胃内，则在蚊体内进行有性增殖。雌雄配子结合成为圆形的合子(zygote)。它穿过胃壁，发育成熟破裂，子孢子逸出，并进入唾液腺，待此按蚊叮人时子孢子即随唾液进入人体。由于恶性疟原虫生活周期的复杂性，以及恶性疟原虫抗原的高度多态性的特点，造成了目前仍未有很好的保护性抗原。
几乎所有的疟疾症状都是由红内期生长的疟原虫导致的，红内期疫苗直接针对疟原虫的致病阶段，因而研制红内期疫苗被认为是最有效的一条途径。50、60年代对疟疾病人的一系列异源感染(诸如恶性疟原虫之后感染间日疟)的研究以及70年代用放射线照射了的环孢子进行的交叉种属实验研究表明用单一疫苗很难获得对几种种属的疟原虫的保护；研究试验也表明，用单一抗原很难获得对疟原虫生活的几个期都具有免疫保护作用；而且目前所发现的红内期抗原的单一使用仍未获得完全的保护。因此，目前仍需要寻找候选疟疾疫苗抗原，以为恶性疟原虫的免疫治疗提供新的线索。
发明内容
本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含编码一种疟疾病人血清识别抗原(称为MSRA-1蛋白)的多核苷酸及其有生物学活性的和有助于诊断或治疗的片段。本发明的核酸分子被命名为msra-1基因，其来自恶性疟原虫。本发明的核酸分子含有编码如SEQ ID NO2所示的358个氨基酸残基的全长多肽或其生物学活性片段的核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明的核酸分子具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列或其互补序列。在另一个实施方案中，本发明的核酸分子具有SEQ ID NO1的第67-606位核苷酸的序列，并编码具有如SEQ ID NO2所示的第23-202位氨基酸残基序列的多肽。本发明还涉及具有与SEQ ID NO1所述核苷酸序列具有至少90％、优选地至少95％、96％、97％、98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸，或者在严格条件下与SEQ ID NO1所述核苷酸序列杂交的多核苷酸。所述的严格条件是本领域技术人员熟知的，例如参见Sambrook等人所著《分子克隆实验手册》。
本发明还涉及包含本发明的分离的核酸分子的重组载体，包含该重组载体的宿主细胞，以及制造这样的载体和宿主细胞和使用它们经重组技术产生MSRA-1蛋白的方法。本领域技术人员熟知各种合适的表达载体及宿主细胞，表达载体的非限制性例子例如本发明实施例中使用的真核表达载体pCDNA3.1，原核表达载体pGEX-4T-1(即谷胱甘肽(Gst)载体)等。宿主细胞可以是常规使用的原核宿主细胞、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞等，非限制性例子例如本发明实施例中使用的大肠杆菌菌株DH5a，和大肠杆菌菌株BL21(DE3)等。
本发明进一步提供了一种恶性疟原虫MSRA-1蛋白，其包含如下的氨基酸序列(a)全长MSRA-1蛋白的氨基酸序列，其具有SEQID NO2所示的完整氨基酸序列；和(b)一种包含SEQ ID NO2所示第23-202位氨基酸残基的氨基酸序列。本发明的蛋白质也包括与以上(a)或(b)所述的氨基酸序列具有至少90％相同性、优选至少地95％、96％、97％、98％或99％相同性的氨基酸序列。
如在实施例中所证明的，本发明的全长MSRA-1蛋白及其N端第23-202位的180个氨基酸组成的蛋白能有效识别疟疾病人血清。而且抗本发明蛋白及其片段的多克隆抗血清也能够有效识别天然MSRA-1蛋白并可体外抑制恶性疟原虫的生长。因此本发明还涉及本发明的msra-1基因或其MSRA-1蛋白在制备用于预防和治疗疟疾的免疫制剂中的应用。
图1示出恶性疟原虫MSRA-1蛋白N端第23-202位的180个氨基酸(即msra-1基因ORF的67-606bp所表达的肽)与GST的重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)株中的表达。图中，泳道1，诱导的含MSRA-1 N端片段质粒的裂解物；2，未诱导的含MSRA-1 N端片段质粒的裂解物；3，低分子量蛋白标记(大小从下到上14.4，20.1，30，43，67，94kD)；4，诱导的含空白质粒对照的裂解物；5，未诱导的含空白质粒对照的裂解物；6，诱导的空菌BL21(DE3)对照的裂解物；7，未诱导的空菌BL21(DE3)对照的裂解物。箭头所指为重组蛋白带。
图2示出恶性疟原虫MSRA-1N端蛋白能有效地识别疟疾病人血清的酶联免疫吸附实验(ELISA)实验结果，其中系列1MSRA-1重组蛋白与病人血清识别的光吸收值；系列2MSRA-1重组蛋白与正常人血清识别的光吸收值。
图3示出抗恶性疟原虫MSRA-1蛋白的多克隆抗血清能有效识别天然MSRA-1蛋白的间接免疫荧光分析(IFA.IndirectImmunofluorescence Assay)实验结果。A488nm激发光下结果，B可见光光下结果图4示出抗恶性疟原虫MSRA-2多克隆IgG在体外恶性疟原虫3D7株生长的抑制。
具体实施例方式
实施例1恶性疟原虫蛋白msra-1基因的克隆及序列分析设计引物(上游引物CGGGATCCAAGATGGATGACATGTTTGCAAACCAA(加粗斜体为BamHI酶切位点，加横线部位是Kozak片段)；下游引物CCCTCGAGTTAAGTTAGTAATAAATTATGAA(加粗斜体为XhoI酶切位点，加横线部位是终止位点))从恶性疟原虫3D7株的基因组文库(从美国ATCC标准3D7株提取DNA而制备)中扩增出msra-1全长基因，扩增条件位模板1μl，上下游引物各4.5μl，三蒸水30.75μl，ExtaqE 0.25μl，缓冲液5μl，dNTP 4μl，总体系50μl。94预变性5分钟，10次循环(94℃变性1分钟，48℃退火1分钟，72℃延伸1分钟)，而后进行20次循环(94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟)，最后再于72℃延伸10分钟)。扩增出的基因与pGEM-T easy载体(购于Promega公司)连接，获得阳性克隆后，送于大连宝生公司进行序列测定。
预测的msra-1开放读框(ORF)全长1077bp(SEQ ID NO1)，AT含量为73.17％，具有典型的恶性疟原虫基因的性质，即富含A和T。编码的蛋白质含358个氨基酸(SEQ ID NO2)，其相对分子量为42.8KD。
实施例2MSRA-1 N重组蛋白与病人血清的识别实验1、MSRA-1N端180个氨基酸肽的亚克隆和表达利用WINSTAR软件分析，msra-1基因N端67bp到606bp序列具有很高的抗原性。根据此序列设计引物上游引物5′CGGGATCCGATACAAATAATACA3′，其包含BamHI位点(下划线)，下游引物5′CCGCTCGAGTTGAGGTTTATGA3′，其包含XhoI位点(下划线)，用此对引物经PCR从pcDNA3.1-msra-1重组克隆(通过将扩增的msra-1基因克隆入pcDNA3.1而获得)中扩增得到540bp片段。将此片段经BamHI和XhoI酶切后，亚克隆于大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1(即GST载体，得自Pharmacia公司)。正确的克隆转化大肠杆菌BL21(DE3)株，经37℃IPTG诱导2小时，得到MSRA-1N端第23-202位的180个氨基酸与GST的融合重组蛋白，该融合重组蛋白的分子量为51kD(图1)。
2、酶联免疫吸附实验(ELISA)检测MSRA-1重组蛋白与病人血清的识别实验用pH9.6的0.1M碳酸盐包被缓冲液将上述1中获得的重组蛋白稀释至所需的蛋白质浓度(500ng/100μl)，用加样器向一微滴板的每孔加入100μl所述溶液，然后将平板置湿盒中，4℃包被过夜，或37℃4小时，将平板小孔中液体倾尽，用PBST缓冲液洗板5次。接着每孔中加入200μl 1％BSA，37℃封闭1小时。再次用PBST洗板5次。之后，加入一抗即临床病人和正常人血清，所述待检血清用PBS溶液以1∶200稀释，每孔加入100μl稀释血清，4℃过夜。PBST洗板5次后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG-HRP，每孔中加入100μl经PBST稀释过的(1∶1000)所述酶标抗体，置湿盒中37℃温育2小时。PBST洗板5次后，每孔加入底物显色缓冲液100μl，放入湿盒中，摇动，37℃温育10分钟。利用Labsystems GenesisV3.03系统，读取450nm吸光度值。结果如图2所示。另外，利用生物统计学工具分析实验结果，确定病人和正常人血清对重组蛋白的识别程度，结果如下表1所示。
表1F-检验双样本方差分析
上述双样本方差分析结果可以看出P＜0.05，表明病人和正常人血清对重组蛋白的识别差异显著。
实施例3间接免疫荧光分析(IFA)检测抗恶性疟原虫MSRA-1蛋白的多克隆抗血清与天然蛋白的识别1、msra-1的开放读码框(ORF)的亚克隆根据msra-1序列设计引物上游5′CGGGATCCAAGATGGATGACATGTTTGCAAACCAA3′，BamHI位点(加粗变斜部分)和Kozak片段(下划线)，下游5′CCCTCGAGTTAAGTTAGTAATAAATTATGAA3′，包含XhoI位点(加粗变斜部分)和终止位点(下划线)，用此对引物经PCR从恶性疟原虫ATCC标准3D7株的基因组中扩增得到1077bp片段。将此片段经BamHI和XhoI酶切后，亚克隆于真核表达载体pcDNA3.1(Invitrogen公司)。
2.免疫鼠血清的制备用1中所得的重组载体粒免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗血清。100μg的重组质粒通过肌肉注射的方法免疫小鼠，每两周加强一次，共加强3次。取血并收集免疫后多克隆抗血清。
3.IFA检测抗恶性疟原虫MSRA-1蛋白的多克隆抗血清与天然蛋白的识别将恶性疟原虫3D7株红内期混合期细胞(感染率2％左右)均匀涂于载玻片上，室温风干。用100％丙酮固定10分钟后室温风干。加入i％BSA的PBS室温封闭30分钟，用PBS冲洗3次，每次10分钟，风干。加入不同稀释度(1∶40，1∶80，1∶160，1∶320)的一抗血清(兔抗MSRA-1多克隆抗血清)，室温，湿盒内30分钟，以兔抗重组的GST兔血清作为对照。用PBS洗3次，每次10分钟，风干。加入1∶100稀释的FITC标记的羊抗兔IgG，室温，湿盒内30分钟。用PBS洗3次，每次10分钟，风干。用60％的甘油将盖玻片封在载玻片上，立刻用荧光显微镜观察。其结果示于图3，该图示出抗恶性疟原虫MSRA-1蛋白的多克隆抗血清能有效识别天然MSRA-1蛋白。实施例4恶性疟原虫的体外抑制1.免疫兔血清的制备以MSRA-1N端重组蛋白(实施例2获得的蛋白)和pGEX-4T-1空载体在大肠杆菌BL21所表达的GST蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗血清。100μg的重组蛋白通过皮下注射的方法免疫兔子，每两周加强一次，共加强2次。取血并收集免疫后多克隆抗血清。过琼脂糖柱(Pierce公司，目录号20356ZZ，Protein A AffinityPakTMColumns)纯化得到IgG。
2.恶性疟原虫体外抑制实验以两次5％山梨醇处理的恶性疟原虫3D7虫株(美国ATCC标准3D7株)作为实验虫株，起始虫血率为2.4％(Giemsa染色-涂片-计数)。在96孔培养板上设计如下实验(1)抗谷胱甘肽IgG(上述1中制备)；(2)抗Gst-MSRA-1-N端融合蛋白IgG(上述1中获得)；(3)用Gst-MSRA-1-N端重组融合蛋白封闭过的抗Gst-MSRA-1-N端融合蛋白IgG(根据抗体、抗原的量，将抗原抗体以适当比例混合(摩尔比为5∶1)，以使抗体能完全被抗原所结合)。其中每孔中总体积为200μl，IgG浓度为原始IgG浓度的5％，10％，20％。5％CO2，5％O2，90％N2，37℃培养48小时后计数虫血率。结果显示，与对照相比，抗MSRA-1 IgG在一定浓度能有效抑制恶性疟原虫的生长，体外生长抑制率为59.07％(图4)。
由于本实验表明抗MSRA-1 IgG在体外可有效抑制恶性疟原虫的生长，据此MSRA-1可作为保护性候选抗原，应用于恶性疟原虫的免疫治疗。
<110>中国医学科学院基础医学研究所<120>恶性疟原虫msra-1基因、其蛋白产物及用途<170>PatentIn version 3.1<213>Plasmodium falciparum<220>
<221>CDS<222>(1)..(1077)<223>
<400>1atg ttt gca aac caa aaa aat aca ttt aat ttt cta aaa cat ata aat 48Met Phe Ala Asn Gln Lys Asn Thr Phe Asn Phe Leu Lys His Ile Asn1 5 10 15cat tat aaa aat gaa caa gat aca aat aat aca cac acg cca aat cat 96His Tyr Lys Asn Glu Gln Asp Thr Asn Asn Thr His Thr Pro Asn His20 25 30gat gaa tat tct cat aat ttg cca aaa aat cac gaa gag tca aat gca 144Asp Glu Tyr Ser His Asn Leu Pro Lys Asn His Glu Glu Ser Asn Ala35 40 45aat atg aac aat cat aat tct ttc aat gac aaa tct gtt aat aaa aaa 192Asn Met Asn Asn His Asn Ser Phe Asn Asp Lys Ser Val Asn Lys Lys50 55 60gaa gct ttc gat caa ttt tta caa acg tta tta aac aat tat gaa ata 240Glu Ala Phe Asp Glu Phe Leu Gln Thr Leu Leu Asn Asn Tyr Glu Ile65 70 75 80atg cat aaa gaa gat gaa agt aaa gaa tca aat caa cat aac tat aaa 288Met His Lys Glu Asp Glu Ser Lys Glu Ser Asn Glu His Asn Tyr Lys85 90 95gaa ggt ccc tca tat gaa gat aaa aaa aat atg tac aaa gaa ata ttg 336Glu Gly Pro Ser Tyr Glu Asp Lys Lys Asn Met Tyr Lys Glu Ile Leu100 105 110aaa gga tat tat aat gta ttt ttt gaa aat tat gca aac gac aca gaa 384Lys Gly Tyr Tyr Asn Val Phe Phe Glu Asn Tyr Ala Asn Asp Thr Glu115 120 125tca aat gta cat aat aaa cct gag gaa gtt cat aaa cat gag gaa att 432Ser Asn Val His Asn Lys Pro Glu Glu Val His Lys His Glu Glu Ile130 135 140cat aaa cat agg aaa ctt cat aaa cat gaa gaa gtt cat aaa cct gag 480His Lys His Arg Lys Leu His Lys His Glu Glu Val His Lys Pro Glu145 150 155 160
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1.一种核酸分子，其包含具有选自如下一组的一种核苷酸序列的多核苷酸，所述的组为(a)编码具有如SEQ ID NO2所示的358个氨基酸残基的全长多肽的核苷酸序列；(b)编码具有如SEQ ID NO2所示的23-202位氨基酸残基的N端多肽的核苷酸序列；(c)互补于以上(a)或(b)的核苷酸序列的核苷酸序列；(d)在严格条件下与(a)或(b)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
2.如权利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸包含SEQ IDNO1所示的核苷酸序列。
3.如权利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸包含SEQ IDNO1的第67-606位核苷酸的序列。
4.一种包含权利要求1-3任一项的核酸分子的表达载体。
5.由权利要求4的表达载体转化或转染的宿主细胞。
6.一种多肽，其选自如下一组(a)具有SEQ ID NO2所示的完整氨基酸序列的全长MSRA-1蛋白或其具有生物学活性的片段；和(b)具有SEQ ID NO2所示的全长MSRA-1蛋白的N端180个氨基酸的氨基酸序列的多肽。
7.如权利要求6的多肽，其是恶性疟原虫MSRA-1蛋白，具有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
8.如权利要求6的多肽，其具有SEQ ID NO2的第23-202位氨基酸残基的序列。
9.抗权利要求6-8任一项的多肽的抗体。
10.权利要求6-8任一项的多肽或权利要求9的抗体在制备抗恶性疟原虫感染的免疫制剂中的应用。
11.权利要求1-3任一项的核酸分子在制备抗恶性疟原虫感染的免疫制剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种恶性疟原虫新基因，其被命名为msra－1，其编码一种来自恶性疟原虫的疟疾病人血清识别抗原(malaria infected patient serum recognizing antigen－1 of P.f)。本发明还涉及所述基因编码的蛋白质产物，以及所述基因和蛋白质在抗恶性疟原虫方面的免疫学用途。
文档编号C07K16/20GK1508249SQ0215752
公开日2004年6月30日 申请日期2002年12月19日 优先权日2002年12月19日
发明者王恒, 李会良, 吴溢敏, 韩志富, 邓禄琴, 王 恒 申请人:中国医学科学院基础医学研究所