四肽衍生物的晶体的制作方法

专利名称：四肽衍生物的晶体的制作方法
技术领域：
本发明涉及作为药物组合物中的活性成分有用的四肽衍生物的新型晶体及其制造方法。
背景技术：
下述式(I)表示的N2-(N，N-二甲基-L-缬氨酰基)-N-[(1S，2R)-2-甲氧基-4-[(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-[(2-苯基乙基)氨基]丙基]-1-吡咯烷基]-1-[(S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(以下称为“TZT-1027”)是具有强效抗肿瘤作用的四肽衍生物，是期待用作抗癌剂等的物质。
TZT-1027本身公开在例如PCT国际公开WO93/03054号小册子中，其中记载了使用薄层色谱法和柱色谱法对TZT-1027的粗产物进行精制，得到无定形(非晶形)粉末状TZT-1027的内容。另外，Chem.Pharm.Bull.，43(10)，1706-1718(1995)中，也记载了用快速色谱法和薄层色谱法处理粗产物，再用柱色谱法进行精制，得到非晶形粉末状TZT-1027的内容。而且，在特开平7-2894号公报中，也公开了TZT-1027，在该文献中也记载了用柱色谱法和薄层色谱法精制TZT-1027的粗产物，得到松软的固状TZT-1027的主旨。
如上所述，以前虽然对非晶形(非晶态)的TZT-1027进行了报告，但是没有找到记载了晶体形态的TZT-1027的文献。
一般而言，化合物为非晶形态的场合与晶体形态的场合相比，其精制操作烦杂，从稳定性方面来看，多数情况下不充分，特别是作为药物组合物的活性成分使用时，往往其纯度不充分也会成为问题。而且，制成制剂时，化合物为非晶形态的场合，存在非晶形粉末易于飞扬等问题，与化合物为晶体形态的场合相比，要求慎重操作。由于这些原因，将具有强效抗肿瘤作用的TZT-1027作为药物组合物的活性成分使用时，与公知的非晶形态相比，希望是晶体形态。
本发明人为了使TZT-1027结晶化，进行了各种尝试，但由于TZT-1027是肽性化合物，因而结晶化非常困难，例如，通过使用醇类、卤代烃类、腈类、酮类、有机酸类、水等溶剂进行结晶化，不能得到TZT-1027的晶体。而且，使用异丙醚、四氢呋喃等醚类或正戊烷、正己烷、环己烷等烃类尝试进行了结晶化，但是也不能得到TZT-1027的晶体。
发明公开本发明人此次意外地发现通过用乙醚或乙酸乙酯的单一溶剂，或者酯类与烃类和/或醚类的组合构成的混和溶剂处理未精制的TZT-1027或其盐，能够简单地得到TZT-1027或其盐的晶体，在世界上首次成功地将TZT-1027或其盐作为晶体提供。
因而，本发明提供TZT-1027或其盐的晶体。
根据本发明，通过对TZT-1027或其盐进行结晶化或重结晶这种简单的精制操作，能够以99％以上这一作为药物充分的纯度得到，而且，得到的晶体形态的TZT-1027或其盐与非晶形态的相比，品质上的偏差少，并且稳定性优良。


图1是TZT-1027晶体的IR图谱。
图2是TZT-1027晶体的粉末X射线衍射图。
TZT-1027具有强效的抗肿瘤作用，对正常细胞也有非常强的毒性，因此其精制操作和制剂化操作中要求密切注意，例如操作人员即使稍微暴露于TZT-1027中，也会存在侵害健康的危险性，因此在操作中必须十分注意。在以前采用色谱法进行的精制操作以及使用非晶形态的原体进行的制剂化操作中，操作人员暴露于TZT-1027的粉尘中的危险性非常高，而本发明提供的晶体形态的TZT-1027与非晶形态相比，精制操作简单，粉尘的飞散少，制剂化操作容易，TZT-1027的操作性得以显著改善。
根据使用X射线进行晶体结构解析的结果，可以判断本发明的TZT-1027的晶体系是斜方晶系，具有a＝18.180、b＝24.419、c＝10.632表示的晶格常数。另外，在粉末X射线衍射图中，本发明的TZT-1027的晶体在晶格面间隔(d)14.72、12.27、9.84、9.28、8.68、7.39、6.11、5.32、5.10、4.90、4.61、4.47和4.36埃处具有特征峰。其中，“特征峰”这一用语是指粉末X射线衍射图中“比较强的峰”，在本说明书中，将下述表1中I/I0的值为90以上的峰作为特征峰例举。
TZT-1027能够以游离碱的形态结晶化，或者也可以根据需要，与无机酸或有机酸形成制药学上允许的盐后，进行结晶化。作为用于形成盐的无机酸，可以例举盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸等，另外，作为有机酸，可以例举醋酸、丙酸、马来酸、富马酸、丙二酸、琥珀酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、枸橼酸、苯甲酸、甲磺酸等。
如上所述，本发明人使用乙醚或乙酸乙酯的单一溶剂、或者酯类与烃类和/或醚类的混合溶剂作为用于结晶化的溶剂，首次成功地获得了TZT-1027的晶体，TZT-1027的晶体不仅可以通过从上述溶液结晶化的方法获得，也可以通过从熔融体结晶化等方法获得。
另外，在本说明书中，“结晶化”是指将晶体形态以外的化合物转变成晶体形态的化合物的操作，另外，“重结晶”是指对结晶形态的化合物进一步进行精制得到晶体形态的化合物的操作。
作为从溶液结晶化的方法，可以例举浓缩法、缓慢冷却法、反应法(扩散法、电解法)、水热生长法、熔剂法等。作为这些结晶化方法中能够使用的溶剂，单一溶剂的场合，可以例举乙醚或乙酸乙酯，混合溶剂的场合，可以例举酯类与烃类和/或醚类的组合构成的混合溶剂。其中，作为酯类，可以例举乙酸乙酯、乙酸甲酯等，作为烃类，可以例举正己烷、正庚烷、环己烷、甲苯、二甲苯等，作为醚类，可以例举乙醚、异丙醚、四氢呋喃、二氧六环等。其中，作为混合溶剂，特别优选乙酸乙酯/正戊烷、乙酸乙酯/正己烷以及乙酸乙酯/乙醚的组合。将溶剂组合使用时，各种溶剂的使用比例没有特别的限定，酯类/烃类或醚类的使用比例一般在1/1～1/100的范围内较合适。
上述从溶液结晶化的方法中，通过将非晶体形态的TZT-1027在40℃附近加热溶解于如上所述的溶剂，例如乙醚中，接着将该溶液冷却或浓缩后冷却，可以进行结晶化。溶液中的TZT-1027的浓度优选15～30重量％的程度，优选冷却至约0～约25℃的程度。另外，使用混合溶剂的场合，通过将非晶体状态的TZT-1027在约40～77℃的温度下溶解于例如乙酸乙酯等酯类溶剂中，然后相对于酯类溶剂在该溶液中加入0.5～5倍量的烃类溶剂，例如正戊烷、正己烷等，可以进行结晶化。其中，将TZT-1027溶解于酯类溶剂得到的溶液的浓度优选为10～40重量％，添加烃类溶剂时，优选将液体温度冷却至0～30℃的程度。从而能够在工业上有利地进行TZT-1027的结晶化。
另外，作为从熔融体结晶化的方法，可以例举正常凝固法(拉晶法、温度梯度法、布里奇曼制单晶法)、区域熔融法(区域平均法、浮动区域法)、特殊生长法(VLS法、液相定向附晶生长法)等。
这样得到的晶体在其纯度不够时，可以进行重结晶。重结晶可以通过重复以上所述的结晶化方法，或者将上述结晶化方法适当组合实施。
这样得到的TZT-1027的晶体，特别是从溶液结晶化的场合，有时晶体中会含有结晶化或重结晶时使用的溶剂分子，因此这种情况下，使用本发明的晶体作为药物组合物的活性成分时，有必要除去晶体中的溶剂分子。溶剂的除去可以通过例如将该晶体粉碎后减压干燥进行。因此，本发明的TZT-1027的晶体，除所谓的单晶以外，还包含能够作为药物组合物的活性成分有效使用的结晶性粉末的形态。
本发明的TZT-1027或其盐的晶体作为药物组合物的活性成分使用时，可以与制药学上允许的制药用添加剂一起，配制成固体形态(例如片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、散剂、细粒剂、丸剂、糖片等)、半固体形态(例如栓剂、软膏等)或液体形态(例如注射剂、乳剂、悬浊液、酏剂、洗剂、喷雾剂等)的制剂形态后使用。作为制造上述制剂时可以使用的添加剂，例如淀粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、甘露糖醇、山梨糖醇、环糊精、硅酸衍生物、甲基纤维素、羧甲基纤维素或其盐、海藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、碳酸钙、碳酸氢钠、碳酸镁、滑石、硬脂酸镁、阿拉伯胶、聚乙二醇、对羟基苯甲酸烷基酯、鲸蜡醇、糖浆、乙醇、丙二醇、凡士林、碳蜡、甘油、氯化钠、亚硫酸钠、磷酸钠、枸橼酸、乳酸、聚乳酸、聚乳酸-乙醇酸等。
上述制剂中的TZT-1027或其盐的含量可以根据其剂型等改变，一般固体和半固体形态的场合，优选以0.1～50重量％的范围内的浓度含有TZT-1027或其盐，而液体形态的场合，优选以0.05～10重量％的范围内的浓度含有TZT-1027或其盐。
在本发明中，TZT-1027或其盐的晶体作为抗肿瘤剂的活性成分使用时，特别优选配制成注射用制剂或口服给药用制剂的形态使用。
实施例以下，结合实施例更具体地说明本发明。
在以下的实施例中，熔点使用ヤマト熔点测定装置(MP-21型)进行测定。红外吸收光谱使用Perkin-Elmer FT-IR spectrometer(1600 Series)，采用日本药典一般试验法浆糊法进行测定。紫外吸收光谱使用Hitachi U-3210 spectrophotometer，采用日本药典一般试验法吸光度测定法对TZT-1027的0.01mol/L盐酸-乙醇(95)溶液进行测定。核磁共振光谱使用JEOL JNM-LA500 FT-NMRspectrometer，以四甲基硅烷(TMS)作为内标物，在重氢化氯仿中进行测定。粉末X射线衍射使用MAC Science Powder X-ray Diffractionsystem(MXP3)进行测定。旋光度使用JASCO DIP-140 digitalpolarimeter，利用层长100mm、钠D射线对TZT-1027的乙醇(95)溶液进行测定。晶体的X射线衍射数据使用Cu-Kα射线，采用四轴衍射计(RIGAKU AFC7R)测定，通过直接法确定初期位相，通过SHELXL-93使结构精密化。
实施例1N2-(N，N-二甲基-L-缬氨酰基)-N-[(1S，2R)-2-甲氧基-4-[(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-[(2-苯基乙基)氨基]丙基]-1-吡咯烷基]-1-[(S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(TZT-1027)晶体的制造按照Chem.Pharm.Bull.，43(10)，1706-1718(1995)的1718页左栏20～26行记载的方法，在叔丁醇/水(9∶1)中，在5％钯-碳催化剂的存在下，在氢气环境下，使Dov-Val-Dil-Dap-OBzl脱苯甲基化，接着，在二甲基甲酰胺中，在氰基磷酸二乙酯和三乙胺的存在下，使之与β-苯乙胺反应。将得到的TZT-1027的未精制物5.0g溶解于干燥乙醚20ml中，在室温下搅拌约3小时。过滤收集析出的粗晶体，在其中加入乙酸乙酯25ml，在约40～60℃的温度下使粗晶体完全溶解后，在约110℃的油浴上加热浓缩至乙酸乙酯的馏出量达到约15ml的程度。将浓缩后的溶液在水浴中搅拌的同时缓慢冷却至约30℃，接着，再继续缓慢冷却至浴温达到10℃的同时，将正戊烷20ml分3次滴加。滴加后，在浴温10℃下再搅拌30分钟后，在室温下放置30分钟。过滤收集析出的晶体，用正戊烷/乙酸乙酯混合溶液(2∶1)9ml洗涤2次后，减压干燥，得到TZT-1027的晶体4.8g(HPLC纯度99.3％)。
熔点85-95℃1H-NMR、500MHz(CDCl3，δ)0.81(3H，t，J＝7.5Hz)，0.90-1.09(3Hx5，m)，1.21(3H，d，J＝7.0Hz)，1.67-1.78(2H，m)，1.89-1.95(2H，m)，1.99(1H，sextet，J＝6.6Hz)，2.
07(1H，sextet，J＝6.7Hz)，2.24(3Hx2，s)，2.35-2.40(2H，m)，2.43(1H，d，J＝6.4Hz)，2.
83(2H，t，J＝7.0Hz)，3.01(3H，s)，3.30(3H，s)，3.35(3H，s)，3.41-3.57(2H，m)，3.84(1H，dd，J＝8.1Hz，J＝2.3Hz)，4.05-4.08(1H，m)，4.12(1H，broad ddd)，4.77(1H，dd，J＝9.
2Hz，J＝6.7Hz)，6.48(1H，broad t)，6.87(1H，d，J＝9.2Hz)，7.16-7.31(5H，m)IR(ν，nujol)3330，3250，1640，1621，1090cm-1IR的光谱如图1所示。
UVmax(HCl-C2H5OH)252.8nm，258.5nm，267.7nm处吸收极大[α]D20-38.4°[c＝0.5，乙醇(95)]粉末X射线衍射的数据如表1所示。
表1

粉末X射线衍射图如图2所示。
实施例2按照PCT国际公开WO93/03054号小册子的实施例28中记载的方法，在二甲基甲酰胺中，在氰基磷酸二乙酯和三乙胺的存在下，使在二氯甲烷中用三氟乙酸将(3R，4S，5S)-4-[N-[(N，N-二甲基-L-缬氨酰基)-L-缬氨酰基]-N-甲基氨基]-3-甲氧基-5-甲基庚酸叔丁酯(Dov-Val-Dil-OBut)脱保护基得到的化合物，以及用氯化氢/乙酸乙酯将(2S)-2-[(1’R，2’R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-[(2-苯基乙基)氨基]丙基]-1-(叔丁氧基羰基吡咯烷)(Boc-Dap-NHCH2CH2-Ph)脱保护基得到的化合物缩合。将得到的未精制物11.1g溶解于干燥乙醚48ml中，在室温下搅拌约3小时。过滤收集析出的粗晶体，在其中加入乙酸乙酯20ml，在约50℃的温度下使粗晶体完全溶解。将溶液在水浴中搅拌的同时缓慢冷却至约30℃，接着再继续缓慢冷却至浴温达到10℃的同时，将乙醚60ml分3次滴加。滴加后，在浴温10℃下再搅拌30分钟后，在室温下放置30分钟。过滤收集析出的晶体，用乙醚-乙酸乙酯混合溶液(3∶1)20ml洗涤2次后，减压干燥，得到TZT-1027的晶体8.42g(HPLC纯度99.2％)。
实施例3单晶结构解析用晶体的制造将实施例1得到的TZT-1027的结晶性粉末2.0mg溶解于0.5mL的乙酸乙酯后，加入正戊烷0.5mL。将装有该溶液的试样管放入装有正戊烷5mL的容器中并密闭。在保持于约0℃的冰箱中放置5天，得到适于单晶结构解析的晶体。
单晶结构解析的晶体数据如下述表2所示。
表2组成式 C39H67N5O6分子量 701.98晶体颜色 无色晶体外形 棱柱状晶系 斜方晶系空间群 P212121晶格常数 a＝18.180b＝24.419c＝10.632单位晶格的体积 V＝47193单位晶格中的分子数 Z＝4晶体的密度(计算值) Dcalc＝1.089g/cm3R因子 R(F)＝0.050(I＞2σ(I))
权利要求
1.下述式(I)表示的N2-(N，N-二甲基-L-缬氨酰基)-N-[(1S，2R)-2-甲氧基-4-[(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-[(2-苯基乙基)氨基]丙基]-1-吡咯烷基]-1-[(S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基]-N-甲基-L-缬氨酰胺或其盐的晶体。
2.如权利要求1所述的晶体，在晶体的粉末X射线衍射图中，晶格面间隔(d)14.72、12.27、9.84、9.28、8.68、7.39、6.11、5.32、5.10、4.90、4.61、4.47和4.36埃处具有特征峰。
3.如权利要求1所述的晶体，晶体为结晶性粉末的形态。
4.权利要求1所述的晶体的制造方法，其特征在于，用乙醚或乙酸乙酯的单一溶剂、或者酯类与烃类和/或醚类的组合构成的混合溶剂，将非晶形态的N2-(N，N-二甲基-L-缬氨酰基)-N-[(1S，2R)-2-甲氧基-4-[(2S)-2-[(1R，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-[(2-苯基乙基)氨基]丙基]-1-吡咯烷基]-1-[(S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基]-N-甲基-L-缬氨酰胺或其盐结晶化，接着根据需要进行重结晶。
5.如权利要求4所述的方法，酯类为乙酸乙酯，烃类为正戊烷或正己烷，醚类为乙醚。
6.药物组合物，含有权利要求1～3中任意一项所述的晶体以及制药学上允许的制药用添加剂。
7.如权利要求6所述的药物组合物，是注射剂的形态。
8.如权利要求6所述的药物组合物，是口服给药用制剂的形态。
9.权利要求1～3中任意一项所述的晶体在肿瘤处理中的用途。
全文摘要
本发明提供具有强效抗肿瘤作用的四肽衍生物N
文档编号C07K5/103GK1556701SQ0281852
公开日2004年12月22日 申请日期2002年9月19日 优先权日2001年9月20日
发明者宫崎宏一, 庆野胜幸, 金田有弘, 南信义, 幸, 弘 申请人:帝国脏器制药株式会社