专利名称：生物体低分子衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物体低分子衍生物和由该衍生物合成高分子交联体，该低分子衍生物是用N-羟基琥珀酸亚胺、N-羟基硫代琥珀酸亚胺或其衍生物修饰具有2个以上羧基的生物体低分子的羧基获得的。
背景技术：
到目前为止，在生物体粘合剂和源于生物体的医疗用设备的处理(例如源于猪的心脏瓣)中使用具有人工化学合成的戊二醛等醛的交联剂和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺等缩合剂等(例如专利文献1～6、非专利文献1)。
特开平7-163650号公报[专利文献2]特开平9-249751号公报[专利文献3]特开平10-71199号公报[专利文献4]特表2000-502380号公报[专利文献5]特开平8-53548号公报[专利文献6]特开平8-502082号公报[非专利文献1]Biomaterials，17卷，765页(1996)发明内容目前在医疗用设备处理等中使用的交联剂和缩合剂主要是人工合成的非天然物质，已经指出其在生物体内不代谢而对生物体表现出毒性。因此，限制了在医疗现场使用时的用途和使用量。为了解决这类问题，要求开发一种源于生物体的交联剂。
本发明提供一种生物体低分子衍生物和通过使用该衍生物得到的高分子交联体，该低分子衍生物是用N-羟基琥珀酸亚胺、N-羟基硫代琥珀酸亚胺或其衍生物修饰具有2个以上的羧基的生物体低分子的羧基获得的。
即，本发明为由用N-羟基琥珀酸亚胺、N-羟基硫代琥珀酸亚胺或其衍生物修饰具有2个以上羧基的生物体低分子的羧基中至少一个以上的羧基获得的生物低分子衍生物。该生物低分子衍生物对人体无害，因为具有2个以上反应基(-COOH基)可以迅速反应。
而且，本发明为由用N-羟基琥珀酸亚胺、N-羟基硫代琥珀酸亚胺或其衍生物修饰具有2个以上羧基的生物体低分子的羧基中至少一个以上的羧基获得的生物低分子衍生物，使用该生物低分子衍生物通过交联高分子得到的高分子交联体。
该高分子交联体在生物体内使用后具有在生物体内代谢，并经一段期间后吸收、消失的特性，不会在体内以异物残留。
图1为柠檬酸衍生物的核磁共振谱图。
具体实施例方式
本发明使用的具有2个以上羧基的生物体低分子为在柠檬酸循环中存在的三羧酸或二羧酸低分子，例如苹果酸、草酸一酰乙酸、柠檬酸、顺乌头酸、2-氧代戊二酸或其衍生物。
本发明的生物体低分子衍生物为将具有2个以上羧基的生物体低分子的羧基在结合使用碳化二亚胺下与细胞毒性低的N-羟基琥珀酸亚胺、N-羟基硫代琥珀酸亚胺或其衍生物反应，从而引入活性酯基的生物体低分子衍生物。
该反应物为相对于0.001～10重量％的生物体低分子，使用0.001～10重量％的N-羟基琥珀酸亚胺、N-羟基硫代琥珀酸亚胺或其衍生物和0.001～20重量％的碳化二亚胺(EDC)，在0～100℃的反映温度下选择适宜的条件反应1～48小时得到。
另外，作为碳化二亚胺能使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺·盐酸盐(EDC)、1-环己基-3-(2-吗啉代乙基)碳化二亚胺·甲硫(meto)-p-甲苯磺酸盐、二环己基碳化二亚胺。另外，反应溶剂能使用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)。
图1为在EDC存在下通过柠檬酸和N-羟基琥珀酸亚胺反应得到的柠檬酸衍生物的核磁共振谱图。a的峰表示柠檬酸的亚甲基质子，b的峰为源自琥珀酸亚胺的亚甲基质子。残余的2个峰为溶剂(DMSO)。
制备交联体时使用的蛋白质含有胶原(不依存数10种类型)、端胶原(Atelocollagen)(不依存数10种类型)、碱可溶性胶原(不依存于数10种类型)、明胶、角蛋白、血清清蛋白、卵清蛋白、血红蛋白、核黄素和球蛋白、血纤维蛋白原等具有氨基的高分子。这些蛋白质不依存已知生物。
制备交联体时使用的葡萄糖胺聚糖含有硫酸软骨素、硫酸皮肤素(dermatan)、透明质酸、类肝素磺酸酯、肝素、硫酸角质素或其衍生物。这些葡萄糖胺聚糖不依存于分子量和已知的生物。
而且，作为其他高分子能含有壳聚糖(不依存脱乙酰化度和分子量)、聚氨基酸(不依存于氨基酸的种类和分子量)、多元醇(不依存于种类和分子量)。
生物体低分子衍生物和高分子的交联反应为将0.1～50重量％的高分子和0.01～50重量％的生物体低分子衍生物优选在30～50℃下反应。另外，在两者混合时，为了容易得到均一的交联体优选以适宜浓度的溶液将两者混合。另外，制备该溶液的溶剂除了蒸馏水还能使用生理盐水、碳酸氢钠、硼酸、磷酸等的缓冲液、有机溶剂(DMF、DMSO、乙醇)等没有毒性的溶剂。
(实施例)实施例1-1室温下在柠檬酸的DMF溶液(5重量％)中加入3.2当量分N-羟基琥珀酸亚胺和3.1当量分的EDC，搅拌24小时。接着仅减压蒸去反应溶液中的有机溶剂DMF。使用丙酮-正己烷的洗脱剂根据硅胶柱色层分离法精制得到的残留物，合成用N-羟基琥珀酸亚胺修饰柠檬酸的3个羧基获得的衍生物。
实施例1-2以下说明使用实施例1-1中合成的柠檬酸衍生物，通过下述反应得到的胶原胶的合成。
(化1)
将24μL的合成的柠檬酸衍生物溶解在976μL的二甲基亚砜溶液中，从该溶液中取出100μL，加入到400μL的1.25重量％的II型胶原磷酸缓冲液中，搅拌之。在室温下静置24小时，合成交联剂浓度为0.4～40mM的胶原胶。分别测定胶重量后，用冻干机干燥后，再次测定胶重量、核查胶的含水率。分别将胶的含水率列于表1中。
(表1)
实施例2-1室温下在2-氧代戊二酸的DMF溶液(5重量％)中加入2.2当量分N-羟基琥珀酸亚胺和2.1当量分的EDC，搅拌24小时。接着仅减压蒸去反应溶液中的有机溶剂DMF。使用丙酮-正己烷的洗脱剂根据硅胶柱色层分离法精制得到的残留物，合成用N-羟基琥珀酸亚胺修饰2-氧代戊二酸的2个羧基获得的衍生物。
实施例2-2以下说明使用实施例2-1中合成的2-氧代戊二酸衍生物，通过下述反应得到的胶原胶的合成。
(化2)
将14μL的合成的2-氧代戊二酸衍生物溶解在986μL的二甲基亚砜溶液中，从该溶液中取出100μL，加入到400μL的1.2 5重量％的II型胶原磷酸缓冲液中，搅拌之。在室温下静置24小时，合成交联剂浓度为0.6～10mM的胶原胶。分别测定胶重量后，用冻干机干燥后，再次测定胶重量，核查胶的含水率。分别将胶的含水率列于表2中。
(表2)
实施例3-1室温下在顺乌头酸的DMF溶液(5重量％)中加入3.2当量分N-羟基琥珀酸亚胺和3.1当量分的EDC，搅拌24小时。接着仅减压蒸去反应溶液中的有机溶剂DMF。使用丙酮-正己烷的洗脱剂根据硅胶柱色层分离法精制得到的残留物，合成用N-羟基琥珀酸亚胺修饰顺乌头酸的3个羧基获得的衍生物。
实施例3-2以下说明使用实施例3-1中合成的顺乌头酸衍生物，通过下述反应得到的胶原胶的合成。
(化3)
将46μL的合成的顺乌头酸衍生物溶解在954μL的二甲基亚砜溶液中，从该溶液中取出100μL，加入到400μL的1.25重量％的II型胶原磷酸缓冲液中，搅拌之。在室温下静置24小时，合成交联剂浓度为1～30mM的胶原胶。分别测定胶重量后，用冻干机干燥后，再次测定胶重量，核查胶的含水率。分别将胶的含水率列于表3中。
(表3)
实施例4-1室温下在苹果酸的DMF溶液(5重量％)中加入2.2当量分N-羟基琥珀酸亚胺和2.1当量分的EDC，搅拌24小时。接着仅减压蒸去反应溶液中的有机溶剂DMF。使用丙酮-正己烷的洗脱剂根据硅胶柱色层分离法精制得到的残留物，合成用N-羟基琥珀酸亚胺修饰苹果酸的2个羧基获得的衍生物。
以下说明使用实施例4-1中合成的苹果酸衍生物，通过下述反应得到的胶原胶的合成。
(化4)
将32μL的合成的苹果酸衍生物溶解在968μL的二甲基亚砜溶液中，从该溶液中取出100μL，加入到400μL的1.25重量％的II型胶原磷酸缓冲液中，搅拌之。在室温下静置24小时，合成交联剂浓度为3～50mM的胶原胶。分别测定胶重量后，用冻干机干燥后，再次测定胶重量，核查胶的含水率。分别将胶的含水率列于表4中。
(表4)
实施例5-1室温下在草酰乙酸的DMF溶液(5重量％)中加入2.2当量分N-羟基琥珀酸亚胺和2.1当量分的EDC，搅拌24小时。接着仅减压蒸去反应溶液中的有机溶剂DMF。使用丙酮-正己烷的洗脱剂根据硅胶柱色层分离法精制得到的残留物，合成用N-羟基琥珀酸亚胺修饰草酰乙酸的2个羧基获得的衍生物。
实施例5-2以下说明使用实施例5-1中合成的草酰乙酸衍生物，通过下述反应得到的胶原胶的合成。
(化5) 将16μL的合成的草酰乙酸衍生物溶解在984μL的二甲基亚砜溶液中，从该溶液中取出100μL，加入到400μL的1.25重量％的II型胶原磷酸缓冲液中，搅拌之。在室温下静置24小时，合成交联剂浓度为2～40mM的胶原胶。分别测定胶重量后，用冻干机干燥后，再次测定胶重量，核查胶的含水率。分别将胶的含水率列于表5中。
(表5)
工业实用性如上所述胶化的生物体高分子能直接在患处进行交联反应，适用于生物体粘合剂、止血剂、血管栓塞材料、动脉瘤密封剂中的任何一种。而且，通过在一次交联反应后使用，还可以适用于愈合抑制剂、用于组织再生的担架材料、药物载体。
权利要求
1.一种生物体低分子衍生物，其特征在于用N-羟基琥珀酸亚胺、N-羟基硫代琥珀酸亚胺或其衍生物修饰具有2个以上羧基的生物体低分子的羧基中至少一个以上羧基。
2.如权利要求1所述的生物体低分子衍生物，其特征在于具有2个以上的羧基的生物体低分子为在柠檬酸循环中存在的低分子及其衍生物。
3.如权利要求1所述的生物体低分子衍生物，其特征在于具有2个以上的羧基的生物体低分子为苹果酸、草酰乙酸、柠檬酸、顺乌头酸、2-氧代戊二酸或其衍生物。
4.一种使用权利要求1所述的生物体低分子衍生物通过交联高分子获得的高分子交联体。
5.一种如权利要求4所述的高分子交联体，其特征在于高分子为蛋白质、葡萄糖胺聚糖、壳聚糖、聚氨基酸、多元醇或其2种或2种以上的混合物。
6.一种如权利要求4所述的高分子交联体，其特征在于高分子为硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸、类肝素磺酸酯、肝素、硫酸角质素或其衍生物制得的葡萄糖胺聚糖。
7.一种如权利要求4所述的高分子交联体，其特征在于高分子为胶原、端胶原、碱可溶性胶原、明胶、角蛋白、血清清蛋白、卵清蛋白、血红蛋白、核黄素和球蛋白、血纤维蛋白原或其衍生物制得的蛋白质。
全文摘要
到目前为止，在生物体用粘合剂和心脏瓣等医疗用设备处理中使用的交联剂和缩合剂因其是人工合成的非天然物，在生物体内不代谢而对生物体表现出毒性。因此，限制了在医疗现场使用时的用途和用量。本发明提供一种使用用N－羟基琥珀酸亚胺、N－羟基硫代琥珀酸亚胺或其衍生物修饰生物体低分子羧基获得的生物低分子衍生物和由该衍生物交联各种高分子获得的高分子交联体。
文档编号C07D207/408GK1681780SQ03821540
公开日2005年10月12日 申请日期2003年9月11日 优先权日2002年9月11日
发明者田口哲志, 小林尚俊, 田中顺三, 齐藤浩史 申请人:独立行政法人物质·材料研究机构, 古内化学株式会社