作为标记的ns5a核苷酸序列变体的制作方法

专利名称：作为标记的ns5a核苷酸序列变体的制作方法
背景技术：
丙型肝炎病毒(HCV)感染是一个严重的世界性的临床难题。仅在美国，估计有400万人临床遭受丙型肝炎病毒的感染。HCV作为主要的非A非B型肝炎的病原体，主要通过使用被感染血液及血液制品输血进行传播(Cuthbert et al.，1994，Clin.Microbiol.Rev.7505-532)。在二十世纪九十年代中期引入抗HCV筛选之前，HCV占美国输血后感染肝炎病例的80-90％。在患有出血异常或慢性肾衰竭的个体以及那些经常接触血液与血液制品的人群中也观察到高比例的HCV感染。
HCV的急性感染可导致病毒持续复制，并有约90％的病例转变为慢性肝炎。对很多患者而言，慢性HCV感染会导致进行性肝损伤并发展为肝硬化。那些严重感染的患者在少至两年内即可发展为肝硬化——尽管时间跨度为10-20年更为典型。在30-50％的慢性HCV患者中，肝损伤可能会演变而导致肝细胞癌的发生。一般而言，肝细胞癌在晚期发病，需30年以上的时间形成(Bisceglie et al.，1995，Semin.Liver Dis.1564-69)。目前还不清楚病毒或宿主因子在决定疾病演变过程中的相对作用。
HCV是一种包膜病毒，包含大小约9.5kb的单股正链RNA基因组。基于其基因组的组织构成及病毒体性质，HCV已被归于黄病毒科中一个独立的属，该科还包括猪瘟病毒(pestiviruses)及黄病毒(Alter，1995，Semin.Liver Dis.155-14)。病毒的基因组由一个冗长的5′非翻译区(UTR)，一个编码约3011个氨基酸的多蛋白前体的长开放阅读框，以及一个短的3′UTR组成。多蛋白前体同时被宿主与病毒的蛋白酶剪切生成成熟的病毒结构蛋白与非结构蛋白。HCV编码两种蛋白酶，一种是由NS2-NS3区编码的锌依赖的金属蛋白酶，以及在NS3/NS4区编码的丝氨酸蛋白酶。这些蛋白酶对于将前体多蛋白的特定区域切割成成熟肽而言是必需的。非结构蛋白5的羧基部分，即NS5B，具有RNA依赖的RNA聚合酶活性。非结构蛋白5，NS5B的羧基部分包含RNA依赖的RNA聚会酶。剩余非结构蛋白，NS4B的功能，以及NS5A(非结构蛋白5的氨基部分)的功能目前还不清楚。
α-干扰素(干扰素)是食品与药物管理局批准的用于治疗慢性HCV感染的药物。干扰素的疗效借助于不同的细胞内可诱导蛋白，包括双链RNA激活的蛋白激酶(PKR)来实现(Gale et al.，1997，Virology230217-227)。只有8％到12％的携带HCV基因型1的患者对干扰素治疗可产生持续性临床病毒学应答(Carithers et al.，1997，Hepatology2683S-88S；Lindsay，1997，Heptatology 2671S-77S)。近来，使用干扰素与鸟苷类似物及三氮唑核苷的联合治疗，在产生持续性生化及病毒学应答方面的表现优于单独使用干扰素治疗(Poynard et al.，1998，lancet3521426-1432)。然而，尽管在持续应答的比例上有了显著改善，但高达60％的高滴度HCV基因型1感染患者对联合治疗没有应答。例如，在被HCV-1b感染的患者中，应答比例低于40％。在被原型，即美国基因型HCV-1a感染的患者中，相似的低应答比例也曾有过报道(Mahaney et al.1994，Hepatology 201405-1411)。相比较而言，被HCV基因型-2感染的患者的应答比例接近80％(Fried et al.，1995，Semin.Liver Dis.1582-91.)。已有研究表明，完整的HCV多蛋白的表达在人U2-OS骨肉瘤细胞中可抑制干扰素诱导的信号传递(Heim et al.，1999，J.Virol.738469-8475)。但没有报道究竟是哪一种HCV蛋白在该效应中发挥作用。
干扰素应答与HCV非结构5A(NS5A)序列之间的关系是有争议的。在HCV各亚型之间，对干扰素治疗的应答并不相同，HCV-1b亚型对干扰素治疗有显著抗性(Alter et al.，1998，MMWR Recomm.Rep.47(RR-19)1-39)。比较从感染HCV的患者体内获得的抗干扰素与对干扰素敏感的病毒的全长HCV核酸序列，发现错义置换对应于NS5A羧基端(Enomoto et al.，1995，J.Clin.Invest.96224-230)。将所对应的NS5A的40个氨基酸区域(位于HCV多蛋白的2209-2248位氨基酸)命名为干扰素敏感决定区，或ISDR(Enomoto et al.，1995)。ISDR位于NS5A蛋白与PKR结合并抑制PKR的功能的区域(Gale et al.，Mol.Cell Biol.，1998，185208-5218)。Enomoto等(1996，N.Eng.J.Med.33477-81)提出一个模型，其中对干扰素治疗产生应答的患者所感染的病毒在ISDR区存在多个置换(与对干扰素抗性的HCV 1b-J原型序列相比较)，而那些在干扰素治疗无效的患者所感染的病毒在ISDR仅有极少置换。
在25个发表来源于抗干扰素及对干扰素敏感的病毒的ISDR序列的研究中，有9个支持Enomoto模型，结论如下在5％的显著性水平上，数据提供了充分的证据，即对干扰素应答与ISDR中的置换是独立的(Enomotoet al.，1995，1996；Chayama et al.，1997，Hepatology，25745-749；Kurosaki etal.，1997，Hepatology 25750-753；Fukuda et al.，1998，J.Gastroenterol.Hepatol.13412-418；Saiz et al.，1998，J.Infect.Dis.177839-847；Murashimaet al.，1999，Scand.J.Infect.Dis.3127-32；Sarrazin et al.1999，J.Hepatol.301004-1013；Sakuma et al.，1999，J.Infect.Dis.1801001-1009)。其它16个研究不能对是否存在相关关系做出结论(Hofgartner et al.，1997，J.Med.Virol.53118-126；Khorsi et al.，1997，J.Hepatol.2772-77；Squadrito et al.，1997，Gastroenterology 113567-572；Zeuzem et al.，1997，Hepatology25740-744；Duverlie 15 et al.，1998，J.Gen.Virol.791373-1381；Franguel etal.，1998，Hepatology 281674-1679；Odeberg et al.，1998，J.Med.Virol.5633-38；Pawlotsky et al.，1998，J.Virol.722795-2805；Polyak et al.，1998，J.Virol.724288-4296；Rispeter et al.，1998，J.Hepatol.29352-361；Chunget al.，1999，J.Med.Virol.58353-358；Sarrazin et al.1999，J.Hepatol.301004-1013；Squadrito et al.，1999，J.Hepatol.301023-1027；Ibarrola et al.，1999，Am.J.Gastroenterol.942487-2495；Mihm et al.，1999，J.Med.Virol.58227-234；Arase et al.，1999，Intern.Med.38461-466)。有趣的是，在支持相关关系的9个研究中，有7个是基于从日本分离的HCV，而在没有支持相关关系的16个研究中，有15个是基于从欧洲及北美分离到的样品。尽管在北美及欧洲的研究中通常没有发现干扰素应答与ISDR序列之间存在具有统计学上显著性的联系，但有证据表明这种联系确实存在。当将那些单个研究中ISDR序列的中间体或者突变体类型综合起来时，对干扰素的应答率要高于那些来源于具有野生型ISDR序列的患者(Herion andHoofnagle，1997，Hepatology 25769-771)。

发明内容
本发明基于以下发现在被HCV-1a亚型感染的人类受试者中，HCVNS5A基因937位的核苷酸序列替换与被感染个体对干扰素治疗的应答之间存在显著性联系。特别地，感染了在NS5A基因937位包括一个导致NS5A蛋白的313位为缬氨酸的“G”的病毒个体，会有更多的可能性对干扰素治疗产生持续性病毒学应答。相反，感染了在NS5A基因937位包括一个导致NS5A蛋白的313位为异亮氨酸的“A”的病毒的个体，会有更多的可能性对干扰素治疗产生无病毒学应答(virologic non-response)。就我们所知，这是首次明确指出一个特定的核苷酸与氨基酸突变与对干扰素治疗的应答之间存在联系。进一步的，该特殊突变的位置并不在ISDR或NS5A蛋白的PKR结合区。
因此，本发明提供了预测感染HCV-1a的人类受试者对干扰素治疗应答的方法。在一个实施方案中，该方法包括提供一段来源于人类受试者的HCV-1a多核苷酸，该多核苷酸含有包括NS5A基因937位核苷酸位点在内的部分，以及确定937位的核苷酸是否为“G”，在937位存在“G”表明人类受试者有增加的可能对干扰素治疗产生持续性病毒学应答。在另一个实施方案中，该方法包括提供一段来源于人类受试者的HCV-1a多肽，该多肽含有包括NS5A蛋白313位氨基酸位点在内的部分，以及确定313位的氨基酸是否为缬氨酸，在313位存在缬氨酸表明人类受试者有增加的可能对干扰素治疗产生持续性病毒学应答。
本发明还提供治疗感染HCV的人类受试者的方法。在一个实施方案中，该方法包括提供一段来源于人类受试者的HCV-1a多核苷酸，该多核苷酸含有包括NS5A基因937位核苷酸位点在内的部分，以及确定937位的核苷酸是否为“G”，如果在937位存在“G”，则对人类受试者使用干扰素进行治疗。在另一个实施方案中，该方法包括提供一段来源于人类受试者的HCV-1a多肽，这段多肽含有包括NS5A蛋白313位氨基酸位点在内的部分，以及确定313位的氨基酸是否为缬氨酸，如果在313位的氨基酸为缬氨酸，则对人类受试者使用干扰素进行治疗。
本发明还提供一种干扰素制备药物以治疗新型患者群体的用途。在一个实施方案中，该用途包括干扰素制备药物以治疗感染HCV的人类受试者的用途，其中在所述的感染HCV的人类受试者中，在HCV-1a多核苷酸NS5A基因的937位核苷酸是“G”。在另一个实施方案中，该用途包括干扰素制备药物以治疗感染HCV的人类受试者的用途，其中在所述的感染HCV的人类受试者中，在HCV-1a蛋白的NS5A蛋白的313位氨基酸是缬氨酸。
在上述用途的优选实施方案中，干扰素选自由Roferon-A、Pegasys、IntronA及Peg-Intron。
本发明还提供了可用于检测HCV-1a的NS5A基因中937位核苷酸置换的寡核苷酸。在一个优选实施方案中，寡核苷酸的长度介于14-35个核苷酸之间，与包括937位点在内的NS5A基因区的某一条链基本互补。本发明更进一步提供了用来预测感染HCV-1a的人类受试者对干扰素应答的试剂盒。具体地，该试剂盒包括一种寡核苷酸和聚合酶，其可用于检测HCV-1a的NS5A基因中937位核苷酸置换，其中，寡核苷酸的长度介于14-35个核苷酸之间，并与包括937位点在内的NS5A基因区的某一条链基本互补。
关于本发明的前述及其他优点与特征及其实现方式，可通过参考后面的发明详细描述以及结合举例说明示例性实施方案的实施例将容易变得明显。
短语“NS5A基因937位的核苷酸”是指位于具有在SEQ ID NO1中所示序列的HCV-1a NS5A cDNA或RNA的937位核苷酸的基因座，SEQ IDNO1作为对比的参考序列，其中SEQ ID NO1代表GenBank中登记号为M67463的HCV-1a基因组核苷酸序列中6264位核苷酸与7601位核苷酸位点之间的NS5A编码区。
短语“NS5A蛋白313位的氨基酸”是指具有SEQ ID NO2中所示的序列的HCV-1a NS5A蛋白313位的氨基酸，SEQ ID NO2作为对比的参考序列，其中SEQ ID NO2代表GenBank中登记号为P26662的HCV-1a基因组多蛋白中1975位氨基酸与2420位氨基酸位点之间的NS5A蛋白的多肽序列。
术语“核苷酸置换”及“核苷酸变异”在本文中可替换使用，指的是在特定基因的参考核苷酸序列中位点的核苷酸改变。
术语“氨基酸突变”及“氨基酸置换”在本文中可替换使用，指由于编码参考蛋白的参考核苷酸序列中核苷酸置换或变异而导致的参考蛋白序列位点上氨基酸改变。
术语“基因分型”是指确定特定基因座位上的核苷酸。
术语对干扰素治疗的“应答”是指对给药试剂所期望的应答。术语对干扰素治疗的“持续性病毒学应答”及“完全应答”在本文中可替换使用，指在治疗结束及治疗结束后24周使用RT-PCR方法不会在感染的受试者的样品中检测到HCV RNA。术语对干扰素治疗的“病毒无应答”及“无应答”在本文中可替换使用，指在治疗过程中及治疗结束使用RT-PCR方法始终可在感染的受试者的样品中检测到HCV RNA。
术语“样品”或“生物学样品”是指从个体分离的组织或流体样品，包括，但不局限于，例如，组织切片、血浆、血清、全血、脊髓液、淋巴液、皮肤的外部切片、呼吸道、肠道及泌尿道、眼泪、唾液、奶汁、血细胞、肿瘤、器官。也包括体外细胞培养组分(包括，但不局限于，产生自培养基中生长的细胞的条件培养基、推测被病毒感染的细胞、重组细胞及细胞组分)。
术语“干扰素”及“α-干扰素”在本文中可替换使用，指那些抑制病毒复制和细胞增殖并调节免疫应答的具有高度种特异性的蛋白家族。典型适用的干扰素包括，但不局限于，重组α-2b干扰素，如获自ScheringCorporation，Kenilworth，N.J.的IntronA干扰素，重组α-2a干扰素，如获自Hoffmann-La Roche，Nutley，N.J.生产的Roferon-A干扰素，重组α-2C干扰素，如获自Boehringer Ingelheim Pharmaceutical，Inc.，Ridgefield，Conn.的Beroforα2干扰素，α-n1干扰素，一种纯化的天然α-干扰素的混合物，如获自Sumitomo，Japan的Sumiferon或者获自Glaxo Wellcome Ltd.，London，Great Britain的Wellferonα-n1干扰素(INS)，或者共有序列α-干扰素，如美国专利4,897,471与4,695,623中所述的(尤其是其中的实施例7、8或9)及获自Amgen，Inc.，Newbury Park，Calif.的具体产品，或者是α-n3干扰素，一种由Interferon Sciences制备的天然α-干扰素的混合物，获自PurdueFrederick Co.，Norwalk，Conn.，商品名为Alferon。优选使用α-2a或α-2b干扰素。
术语“聚乙二醇化的α-干扰素”在本文中是指经聚乙二醇修饰的α-干扰素，优选α-2a和α-2b干扰素的缀合物。典型适用的聚乙二醇化的α-干扰素包括，但不局限于，Pegasys和Peg-Intron。
在本文中所用的术语“核酸”、“核苷酸”、“多核苷酸”及“寡核苷酸”是指引物、探针、待检测的寡聚物片段，寡聚物对照及未标记的封闭寡聚物，并且对多聚脱氧核糖核苷酸(含2-脱氧-D-核糖)、对多聚核糖核苷酸(含D-核糖)以及对任何其他类型多核苷酸而言是通用的，所述其他类型多核苷酸是N-糖苷化的嘌呤或嘧啶碱基、或修饰的嘌呤或嘧啶碱基。
核酸、核苷酸、多核苷酸或者寡核苷酸可以包括磷酸二酯键或修饰过的连接，如磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基酯、乙酰胺化物(acetamidate)、氨基甲酸酯、硫醚、桥联氨基磷酸酯、桥联亚甲基磷酸酯、硫代磷酸酯、磷酸甲酯、硫代磷酸酯、膦酸甲酯、二硫代磷酸酯、桥联硫代磷酸酯或砜键合，以及这类键合的组合。
核酸、核苷酸、多核苷酸或者寡核苷酸可以包括五种生物学上存在的碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及尿嘧啶)和/或除了五种生物学上存在的碱基的碱基。例如，本发明的多核苷酸可以包含至少一个修饰碱基部分，其选自，包括，但不局限于5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖queosine、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖queosine、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲基酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2，6-二氨基嘌呤及5-丙炔基嘧啶。
进一步地，核酸、核苷酸、多核苷酸或者寡核苷酸可以包括一个或多个修饰的糖基部分，如阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖及己糖。
本发明不希望被核酸、核苷酸、多核苷酸或者寡核苷酸的来源所限制。核酸、核苷酸、多核苷酸或者寡核苷酸可以来源于人或非人类哺乳动物、或者任何其它有机体、或者来源于任何重组来源、体外合成或化学合成。核酸、核苷酸、多核苷酸或者寡核苷酸可以是DNA、RNA、cDNA、DNA-RNA、锁定核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、以及其杂合体或任何混合物；可以以双链、单链或者部分双链的形式存在。本发明的核酸包括纯化或未纯化的核酸及其片段，包括基因、染色体、质粒，及生物材料如微生物——例如细菌、酵母、病毒、类病毒、霉菌、真菌、植物、动物、人，诸如此类——的基因组。
术语核酸、核苷酸、多核苷酸及寡核苷酸间没有刻意区分其长度上的差异，这些术语可替换使用。这些术语包括双链和单链DNA及双链和单链RNA。
“相应的”指与指定序列一致或者互补。
由于单核苷酸可以通过一个单核苷酸戊糖环上的5′磷酸与其相邻单核苷酸上的3′氧通过磷酸二酯键的方式反应生成寡核苷酸，因此如果其5′磷酸没有与单核苷酸戊糖环上的3′氧相连，则该寡核苷酸的末端被称为“5′端”，而如果其3′氧没有与后面的单核苷酸戊糖环上的5′磷酸相连则为“3′端”。本文中所使用的核酸序列，即使是在一段较大的寡核苷酸内部，也可以称其具有5′及3′端。
当两个不同的、非重叠的寡核苷酸与同一条线性互补核酸序列的不同区域退火，而且一条寡核苷酸的3′端指向另一条的5′端时，则前者可称为“上游”寡核苷酸，后者称为“下游”寡核苷酸。
术语“引物”可以指一条以上的引物或引物的混合物，也可以指寡核苷酸——无论该寡核苷酸是天然存在的，如以纯化的限制性消化物的形式，或是合成产生的，当处于与核酸链互补的引物延伸产物可以被催化合成的条件下时，引物可作为沿互补链的多核苷酸合成的起始点。这些条件典型包括，在合适的温度，合适的缓冲液中(“缓冲液”包括是辅助因子，或者影响pH值、离子强度等的置换物)，四种不同的脱氧核苷三磷酸，诱导聚合反应的试剂，如DNA聚合酶或者逆转录酶。优选的引物是在扩增反应中具有最大效率的单链引物。
本文中所用的核酸序列的互补链是指处于“反向平行关系(antiparallelassociation)”的寡核苷酸，即当与核酸序列比对时，一个序列的5′端与另一个序列的3′端配对。本发明的核酸可以包括那些在天然核酸中不常见的某些碱基，这些碱基包括，例如，肌苷、7-脱氮鸟嘌呤以及上述讨论的碱基。互补不需要完全匹配，稳定的双螺旋可以含有错配碱基对或不匹配的碱基。在核酸技术领域的熟练人员可凭以往经验来考虑多个变量，包括例如，寡核苷酸的长度、碱基组成及寡核苷酸序列、离子强度与错配碱基对的发生概率，从而判断双螺旋的稳定性。
在本文中所用的术语“探针”是指能够被检测到的、由于探针中至少一段序列与区域中的一段序列互补而与核酸的区域形成双螺旋结构的寡核苷酸。优选地，探针不含有与引物序列在5′核酸酶反应中互补的序列。在下文将讨论，探针可以是标记的或未标记的。探针的3′末端可以是“封闭的”以阻止探针结合到引物延伸产物。“封闭”可以通过使用非互补碱基，或者通过在最后一位核苷酸的3′羟基上添加化学部分，如生物素或磷酸基团来实现，依赖于所选择的部分，其通过还作为后续检测的标记或者俘获附加在标记上的核酸而实现双重目的。封闭还可以通过除去3′-OH或者通过使用缺少3′-OH的核苷酸如双脱氧核苷酸来实现。
本文中所用的术语“标记”指能够附加在核酸或蛋白上的、并能用来提供可检测(任选可定量的)信号的任何原子或分子。通过荧光、放射性、比色法、重量分析法、X-射线衍射或吸收、磁性、酶活等诸如此类，标记可以提供可检测信号。本发明的便利的标记包括那些利于寡核苷酸片段大小检测的标记物。
在本发明的某些实施方案中，标记物是荧光染料。荧光标记物可以包括带负电荷染料，如荧光家族染料，或中性电荷染料，如罗丹明家族染料，或者带正电荷的染料，如花菁家族染料。荧光家族类染料包括，例如，FAM、HEX、TET、JOE、NAN和ZOE。罗丹明家族染料包括Texas Red、ROX、R110、R6G和TAMRA。FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOE、ROX、R110、R6G和TAMRA由Perkin-Elmer(Foster City，Calif.)销售，Texas Red由Molecular Probes，Inc.(Eugene，OR)销售。花菁家族染料包括Cy2、Cy3、Cy5和Cy7，由Amersham(Amersham Place，Little Chalfont，Buckinghamshire，England)销售。
本文中所用的术语“淬灭剂”是指吸收荧光染料所发射的能量的化学部分，例如，当淬灭剂与荧光染料连接到同一个多核苷酸时。该淬灭剂可以以其信号特征重新发射从荧光染料所吸收的能量，这样淬灭剂也能够作为“标记物”。这种现象通常称为荧光共振能量转移或FRET。备选地，淬灭剂可以将从荧光染料所吸收的能量以热能形式消耗。在FRET中常用的分子包括，例如，荧光素、FAM、JOE、罗丹明、R6G、TAMRA、ROX、DABCYL及EDANS。无论是作为标记物的荧光染料还是淬灭剂是由其激发和发射光谱决定的，荧光染料与其是配对的。例如，FAM在波长为488nm的光照下被最有效地激发，发射光谱范围在500至650nm，在525nm处发射光达到最大值。FAM与例如作为淬灭剂的TAMRA共同使用，TAMRA在514nm处有激发最大值，FAM是合适的供体标记物。示例性的将从荧光染料所吸收的能量消耗的非荧光淬灭剂包括Biosearch Technologies，Inc.(Novato，Calif.)销售的Black Hole QuenchersTM。
本文中定义的“5′到3′核酸酶活性”是指模板特异性的核酸聚合酶活性，其包括传统上与某些DNA聚合酶相关的5′-3′核酸外切酶活性——其中按顺序方式将核苷酸从寡核苷酸的5′末端删除(例如，E.coli DNA聚合酶I具有此活性而Klenow片段没有)，或5′到3′核酸内切酶活性，其中剪切在5′末端或两个末端不止一个磷酸二酯键(核苷)处发生切割。尽管不希望被任何操作的特定理论所限制，在探针-模板杂交上5′到3′内切酶活性依赖的剪切中优选的底物为置换的单链核酸、叉样结构，在连接置换区域与链的碱基配对部分的磷酸二酯键上发生水解，如Holland等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 887276-80讨论的，其全文结合于此作为参考。
本文中所用的术语“相邻的”是指相对于位于模板核酸互补链上探针的引物的位置。引物与探针可以相距超过20个核苷酸，或1至约20个核苷酸，更优选地，约1到10个核苷酸，或可以直接相互毗邻，这在聚合作用非依赖型过程的检测中是理想的。备选地，为了在聚合作用依赖过程中应用，例如当本发明的方法在PCR扩增及本文教导的检测方法中应用时，“邻接”可以是待扩增序列内的任意部分，引物下游的任意部分，这样引物延伸可决定聚合酶的位置，从而使探针被剪切。
本文中所用的术语“热稳定的核酸聚合酶”是指当与，例如，E.coli的核苷酸聚合酶相比较，对热相对稳定、而且催化核苷三磷酸聚合的酶。一般情况下，该酶从与靶序列退火的引物的3′末端起始合成反应，并向模板的5′末端方向持续新链的合成，如果该酶具有5′到3′核酸酶活性，水解干涉，退火的探针以释放标记及未标记探针片段，直至合成结束或者探针片段从靶序列上脱离。美国专利4,889,818描述了具有代表性的从水生栖热菌(Thermus aquaticus)(Taq)中分离的热稳定酶，该酶在常规PCR中的使用方法在Saiki et al.，1988，Science 239487-91中有详细说明。
Taq DNA聚合酶具有DNA合成依赖的、链置换的5′-3′核酸外切酶活性。参见Gelfand，在PCR Technology Principles and Applications for DNAAmplification，Erlich，Ed.，Stockton Press，N.Y.(1989)中第二章“Taq DNA聚合酶”部分。在溶液中，即使有的话，也仅有极少的探针发生降解。
术语核酸、引物和探针的“5′核酸酶反应”是指当引物用具有5′到3′核酸酶活性的核酸聚合酶延伸时，与核酸杂交的探针发生降解，详细描述如下。此类反应基于美国专利6,214,979、5,804,375、5,487,972和5,210,015中描述的反应，其全文结合于此作为参考。
术语“靶核酸”是指能够与引物和探针在5′核酸酶反应中杂交并含有一个或多个核苷酸变异位点的核酸。
本文中所用的术语“严谨”或“严谨条件”是指在低离子强度及高温下的杂交条件，这在本技术领域中是众所周知的。参见，例如，Sambrooket al.，2001，Molecular CloningA Laboratory Manual，Third Edition，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York；CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel et al.，ed.，J.Wiley & Sons Inc.，New York，1988)；Tijssen，1993“Overview of principles of hybridizationand the strategy of nucleic acid assays”(Elsevier)，其每一个结合于此作为参考。一般而言，在特定的离子强度及pH值的条件下，选择低于指定序列热融解点(Tm)约5-30℃的条件作为严谨条件。备选地，可选择低于在特定的离子强度及pH值的条件下指定序列Tm约5-15℃的条件作为严谨条件。Tm是指50％的探针能与靶互补，与靶序列的杂交达到平衡状态(由于靶序列在此处是过量的，达到Tm时，50％的探针被结合而处于平衡态)时的温度(在特定的离子强度、pH值及核酸浓度下)。例如，严谨杂交条件是指盐浓度低于约1.0M钠(或其他盐)离子；典型的，在约pH7.0至约pH8.3、对于短探针(例如，10到50个核苷酸)温度至少为约25℃，对于长探针(例如，超过50个核苷酸)温度至少约55℃的条件，(严谨条件)为约0.01至约1M钠离子浓度。在添加了例如甲酰胺的杂交去稳定剂后，严谨条件也会发生变化。对于长探针(例如，超过50个核苷酸)，示例性的非严谨或低严谨条件包括含20mM Tris，pH8.5、50mM KCl及2mM MgCl2的缓冲液以及25℃的反应温度。
本发明的实施，除非另有说明，将使用传统的分子生物学技术、微生物学及重组DNA技术，其均在本技术领域熟练人员的掌握中。这些技术已经在文献中进行充分阐述，参见例如Sambrook et al.，2001，MolecularCloningA Laboratory Manual，Third Edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，ed.，1984)、Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins，eds.，1984)、A Practical Guide to Molecular Cloning(B.Perbal，1984)Methodsin Enzymology系列丛书(Academic Press，Inc.)。
HCV-1a全基因组核苷酸序列获自GenBank，登记号M67463，位于核苷酸6264位与7601位之间的NS5A编码区以SEQ ID NO1提供。最近发现的单核苷酸替换发生在937位点。G937A替换对应编码氨基酸中缬氨酸到异亮氨酸的改变。
本技术领域中已知有大量用于检测核苷酸或氨基酸变异的技术，均可用于实现本发明的方法。用于鉴定序列变异的具体方法并不是本发明的关键方面。尽管在性能、花费及便利方面的考虑，将使得具体方法会比其他方法更合适，但清楚的是，任何能够鉴定SEQ ID NO1中937位核苷酸或SEQ ID NO2中313位氨基酸的方法都能为实践本发明提供需要的信息。这些技术可以是基于多核苷酸的或基于蛋白的。无论在哪种情况下，这些使用的技术都必须足够灵敏，以便精确检测出单核苷酸或氨基酸变异。
在基于多核苷酸的检测方法中，通过鉴定置换位点，即SEQ ID NO1中核苷酸937位的核苷酸的存在而实现基因分型。任何类型的含HCV-1a多核苷酸的被HCV-1a感染个体的生物样品均可用来确定基因型。可通过本技术领域中众所周知的标准RNA提取方法通过分离HCV RNA来进行基因分型。RNA的扩增可通过例如病毒的逆转录酶，对靶RNA进行第一次反转录，然后扩增获得的cDNA，或使用联合的高温反转录聚合酶链反应(RT-PCR)，如美国专利5,310,652、5,322,770、5,561,058、5,641,864与5,693,517中所述而进行，每个结合于此作为参考(也可参见Myers andSigua，1995，PCR Strategies，见上，第五章)。已知本技术领域中有多种方法用于鉴定单一核苷酸位点上的核苷酸。
937位的核苷酸可以通过DNA测序方法鉴定，例如本技术领域中众所周知的的链终止法(Sanger et al.，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.745463-5467，其结合于此作为参考)。在一个实施方案中，对含有置换位点的该基因的亚序列(subsequence)进行扩增，克隆到稳定的质粒然后进行测序，或者直接进行测序。基于PCR的测序在美国专利5,075,216；Brow，PCRProtocols，1990(Innis et al.，eds.，Academic Press，San Diego)第24章；以及Gyllensten，PCR技术Technology，1989(Erlich，ed.，Stockton Press，NewYork)第5章中均有描述，每个结合于此作为参考。典型地，测序使用已经商业化的，例如获自PE Biosystems(FosterCity，Calif.)、Pharmacia(Piscataway，N.J.)、Genomyx Corp.(Foster City，Calif.)、LI-COR Biotech(Lincloln，Nebr.)、GeneSys technologies(Sauk City，Wis.)以及VisableGenetics，Inc.(Toronto，Canada)的自动DNA测序仪来完成。
可通过使用基于扩增的基因分型方法对937位核苷酸进行鉴定。现已阐述了多种核酸扩增的方法，它们可用于能检测出靶核酸中单个碱基的改变的检测中。优选的方法是本技术领域中目前众所周知的聚合酶链反应(PCR)，如美国专利4,683,195、4,683,202和4,965,188中所描述；每个结合于此作为参考。大量发表描述PCR方法与应用的文章的例子可以在PCRApplications，1999，(Innis et al.，eds.，Academic Press，San Diego)、PCRStrategies，1995，(Innis et al.，eds.，Academic Press，San Diego)，PCRProtocols，1990，(Innis et al.，eds.，Academic Press，San Diego)；和PCRTechnology，1989，(Erlich，ed.，Stockton Press，New York)中找到；每个结合于此作为参考。商家，例如PE Biosystems(Foster City，Calif.)销售PCR试剂并发布PCR方案。
其他合适的扩增方法包括连接酶链反应(Wu和Wallace 1988，Genomics 4560-569)；链置换分析(Walker et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89392-396，Walker et al.1992，NucleicAcids Res.201691-1696，及美国专利5,455,166)；及几种基于转录的扩增体系，包括美国专利5,437,990、5,409,818与5,399,491所描述的方法；转录扩增体系(TAS)(Kwoh et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861173-1177)；及自身维持的序列复制(3SR)(Guatelli et al.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871874-1878及WO92/08800)；每个结合于此作为参考。备选地，也可使用将探针扩增到可检测水平的方法，例如Qβ-复制酶扩增(Kramer和Lizardi，1989，Nature 339401-402与Lomeli et al.，1989，Clin.Chem.351826-1831，均结合于此作为参考)。在Abramson和Myers，1993，Current Opinion inBiotechology，441-47中提供了关于已知扩增方法的综述，结合于此作为参考。
937位的核苷酸可以通过序列特异性扩增或者引物延伸方法来鉴定，这些方法都是基于末端引物错配对DNA聚合酶在延伸引物能力上的抑制效应。为了使用序列特异性扩增或者基于延伸的方法来检测一段序列，选择与NS5A基因互补的引物，从而使3′末端核苷酸在置换位点进行杂交。在存在待鉴定的特定变异时，引物在3′末端处与靶序列匹配，引物进行延伸。在不存在特定变异时，引物与靶序列存在3′错配，引物延伸被终止，或者显著减少。等位基因特异的扩增或者基于延伸的方法在例如，美国专利5,137,806、5,595,890、5,639,611和美国专利4,851,331中有所描述，每个结合于此作为参考。通过基于序列特异扩增的基因分型，鉴定置换仅需要检测是否存在已扩增的靶序列。在本技术领域中检测已扩增的靶序列的方法是众所周知的。例如，凝胶电泳(参见Sambrook et al.，1989，见上)和上述广泛用于检测核酸存在的探针杂交分析。
备选的不使用探针的方法，此处指动态PCR(kinetic-PCR)方法，即通过监测反应混合物中双链DNA总量的增加来检测所扩增核酸的产生，在Higuchi et al.，1992，Bio/Technology，10413-417；Higuchi et al.，1993，Bio/Technology，111026-1030；Higuchi和Watson，PCR Applications，见上，第16章；美国专利5,994,056和欧洲专利申请487,218与512,334中有所描述，每个结合于此作为参考。双链靶DNA的检测依赖于溴化乙啶(EtBr)及其他DNA结合染料结合到双链DNA上而发出的增强的荧光。由于靶序列的合成导致的双链DNA的增加使结合到双链DNA上的染料的量也增加，所伴随的是可检测到的荧光也增加。对使用动态PCR方法进行基因分型而言，使用一对特异于等位基因中一种的引物进行扩增反应，这样每个扩增可表明存在一个特定的等位基因。通过进行两次扩增，一次使用特异于937位为G的引物，一次使用特异于937位为A的引物，可以确定样品的基因型。
937位核苷酸可使用基于探针的方法来鉴定，这依赖于探针与核苷酸变异体所形成的杂交双链体所导致的稳定性的差异，其在互补程度的差异。在充分严谨的杂交条件下，只有在探针与完全匹配的靶序列之间才会形成稳定的双链体。可通过大量熟知方法中的任何一种来检测稳定的杂交双链体的存在。一般而言，为了便于检测，优选杂交前扩增核酸。然而，如果不扩增也能获得足够的核酸时，则不必如此。
在一些实施方案中，位于937位点的核苷酸通过在序列特异性的杂交条件下，与含937位点在内的NS5A基因区完全互补的寡核苷酸探针杂交来鉴定。选择杂交序列的探针及序列特异性的杂交条件，以使置换位点的单个错配就能够充分破坏杂交双链体的稳定性，导致其无法有效形成。这样，在序列特异性的杂交条件下，只有在探针与完全互补序列之间才能形成稳定双链体。因此，长度为14至60个核苷酸，优选地，长度为14至35个核苷酸，并与含937位点在内的NS5A基因区完全互补的寡核苷酸均包括在本发明的范围内。
在其他实施方案中，位于937位点的核苷酸可通过在充分严谨的杂交条件下，与含937位点在内的NS5A基因区基本互补的寡核苷酸进行杂交来鉴定。在该实施方案中，当保持足够的严谨度可以排除与非靶序列之间形成稳定的双链体时，杂交条件可以充分宽松，以便与靶序列形成稳定的双链体。因此，长度为14至60个核苷酸，优选地，长度为14至35个核苷酸，并与含937位点在内的NS5A基因区基本互补的寡核苷酸均包括在本发明的范围内。
在杂交条件的优化受限的检测方案中，使用基本互补的，而非完全互补的寡核苷酸是理想的。例如，在典型的多靶固定探针的检测方案中，将每个靶的探针固定在单一的固体支持物上。通过将含有靶DNA的溶液与固体支持物接触而同时进行杂交。由于所有的杂交都是在同样的条件下进行，因此无法对每个探针的杂交条件进行个别优化。当检测方案不允许调整杂交条件时，整合在探针中的错配可以用于调节双链体的稳定性。特定引入的错配对双链体稳定性的影响是众所周知的，双链体的稳定性通常可以凭估计和经验来常规判断，如上所述。
适合在本发明基于探针的方法中使用的寡核苷酸，其包括一段与SEQID NO1的靶区或SEQ ID NO1的互补区基本互补或完全互补的杂交区，其中靶区包括937位点，可以根据本文提供的及本技术领域中众所周知的指导来进行选择。同样地，基于探针精确长度及序列的合适的杂交条件，可以根据本文提供的及本技术领域中众所周知的指导凭经验来进行选择。应用寡核苷酸探针检测序列中的单碱基对差异，在例如，Conner et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sd.USA 80278-282，及美国专利5,468,613与5,604,099中有所描述，每个结合于此作为参考。
完全匹配与单碱基错配的杂交双链体之间的稳定性的比例变化依赖于杂交的寡核苷酸的长度。由较短探针序列形成的双链体在存在一个错配时会成比例地不稳定。在实践中，长度为14至35个核苷酸的寡核苷酸在序列特异性检测中是优选的。另外，由于杂交的寡核苷酸末端由于热能而处于不断的随机解离与再退火的过程中，因此无论哪个末端的错配对杂交双链体稳定性的影响都小于位于序列中间的错配。优选地，为了分辩靶序列中的单碱基对变化，选择那些与靶序列杂交时核苷酸置换位点存在于探针的中间区域的探针序列。
上述关于选择与SEQ ID NO1杂交的探针序列的标准将应用于探针的杂交区，即，探针中与靶序列杂交相关的部分。探针还可以结合另外的核酸序列，例如用于固定探针的poly-T尾，而不显著改变探针的杂交特性。对于在本发明中的应用，本技术领域中的熟练人员应认识到结合另外核酸序列的探针基本上等同于不结合的探针，所述另外的核酸序列与靶序列不互补，因此不参与杂交。在用来测定NS5A基因型的基于探针的方法的优选实施方案中，扩增含有置换位点的NS5A基因的核酸序列，然后在充分严谨的杂交条件下与探针杂交。通过探针与扩增靶序列的结合模式可以推导出核苷酸序列。在该实施方案中，进行扩增的目的是为了提供足够量的可用于探针杂交分析的核酸。因此，设计的引物可扩增含置换位点的NS5A基因区域，而不管样品中存在何种核苷酸。与不依赖于序列的扩增可以通过使用与NS5A基因保守区杂交的引物来完成。
用于检测探针与样品中靶核酸序列所形成杂合体的合适的分析方案在本技术领域中是已知的，包括固定靶的方案及固定探针的分析方案。这些分析方案在美国专利5,310,893、5,451,512、5,468,613及5,604,099中有所描述；每个结合于此作为参考。此外，微芯片或微阵列技术也可应用于本发明的基于探针的检测方法中。从本质上看，在微芯片中，大量的不同寡核苷酸探针被固定在阵列中的基质或载体上，例如，硅芯片或者玻片。被分析的靶核酸序列可与固定在微芯片上的寡核苷酸探针接触(Lipshutz etal.，1995，Biotechniques，19442-445)。备选地，将待研究的多个靶核酸序列固定在基质上，探针阵列与固定的靶序列接触(Drmanac et al.，1998，Nature Biotechnology，1654-58)。已经开发了大量的结合一种或多种上述用来检测单核苷酸突变技术的微芯片技术。微芯片技术，与计算机分析工具相结合，可进行大规模快速筛选。微芯片技术相对本发明的改进对于那些可通过现有公开资料做出评估的本技术领域中的熟练人员来说是显而易见的(Wilgenbus et al.，1999，J.Mol.Med.，77761-786)。
本发明中优选的检测核苷酸置换的基于探针的基因分型技术是“5′核酸酶反应”，其实施方案在美国专利5,210,015、5,487,972和5,804,375，以及Holland et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 887276-7280中有所描述，每个结合于此作为参考。用于进行5′核酸酶反应的试剂及设备，例如Roche Diagnostics的COBAS TAQMANTM系统，对本技术领域的熟练人员来说是熟悉的。
简言之，在5′核酸酶反应中，在引物及探针与核酸的一条链杂交的条件下，将该核酸与引物及探针相接触。这段核酸、引物及探针还与具有5′到3′核酸酶活性的核酸聚合酶相接触。具有5′到3′核酸酶活性的核酸聚合酶能够剪切与引物下游核酸杂交的探针。引物的3′末端提供核酸聚合酶的起始结合位点。一旦结合的聚合酶遇到探针的5′末端，聚合酶就可以从探针上切除片段。
引物及探针可以设计成其在核酸上退火位置很接近，这样结合到引物3′末端的核酸聚合酶自动与探针的5′末端接触。在该过程中，不需要聚合作用将核酸聚合酶引入到位点以实现剪切。术语“不依赖聚合作用的剪切”指的就是该过程。
备选地，如果引物与探针在核酸上更远的间隔区域退火，则核酸聚合酶在遇到探针5′末端前必须进行聚合作用。随着聚合作用的进行，聚合酶逐渐开始从探针5′末端剪切片段。剪切持续进行，直至探针剩余部分达到无法稳定结合的程度而从模板分子上解离。术语“依赖聚合作用的剪切”知道就是该过程。
不依赖聚合作用的剪切的一个优势在于不必进行核酸扩增。在缺乏引物延伸时，核酸链实质上是单链的。如果引物和探针相邻地结合核酸，则可以发生寡核苷酸退火及片段剪切的连续循环。这样，可以产生足够量的片段，从而在不需要聚合作用的情况下也可进行检测。
无论在哪个过程中，都需要提供的样品中含有核酸。包含在样品中的核酸可以先反转录成cDNA，必要时，然后再使用任何合适的变性方法，包括本技术领域中熟练人员已知的物理的、化学的或酶学的方法进行变性。优选的分离链的物理方法包括加热核酸直至其完全(＞99％)变性。典型的热变性包括温度范围从约80℃到约105℃，时间从约1至10分钟。作为变性的备选方法，核酸可以以单链形式存在于样品中，例如，单链RNA或DNA病毒。
然后变性的核酸链与引物及探针在杂交条件下温育，在该条件下，引物及探针能够结合到核酸链上。在一些实施方案中，可以使用两条引物来扩增核酸。如本技术领域中所知，选择两个引物使得它们沿着核酸的相对位置是这样的当延伸产物从其模板(互补链)上分离时，从一个引物合成的延伸产物作为另一个引物延伸的模板，从而产生确定长度的复制链。
由于典型地互补链比探针或者引物长，因此链具有更多的接触点，从而在任意给定的时间内有更大的机会互相寻找到对方。因此高摩尔的过量探针及引物，有助于使平衡倾向引物与探针的退火，而不是模板之间的重新退火。
引物必须要足够长，从而能在聚合反应试剂存在的情况下起始延伸产物的合成。引物的确切长度及组成依赖于多种因素，包括退火反应的温度、引物的来源与组成、探针退火位点与引物退火位点的临近程度以及引物探针的浓度比例。例如，由于序列的复杂性，通常寡核苷酸引物含有大约15-30个核苷酸，尽管也可能包含更多或更少的核苷酸。引物必须具有足够的互补性去选择性地与其各自的链退火并形成稳定的双链体。
选择的每条引物要与核酸的链“实质上”互补。引物不必反映模板的精确序列，但必须是足够的互补，以与其各自的链选择性地杂交。如果引物与其模板链能够保持足够的互补性并能与之形成稳定的双链体，则可以将非互补碱基或较长的序列引入到引物中或位于引物末端。引物的非互补核苷酸序列可以包括限制性酶切位点。
有多种技术可用于在引物延伸的聚合作用达到该双链体区之前，或者在不依赖聚合作用的过程中聚合酶附在上游寡核苷酸之前，增加探针与其互补核酸之间退火的可能性。短的引物分子一般需要更低的温度与核酸形成足够稳定的杂交复合物。因此，将探针设计的比引物长，这样可以在比引物退火温度更高的温度下，使探针优先与核酸退火。
也可以使用具有不同热稳定性的引物与探针。例如，选择具有更高G/C含量的核苷酸组成的探针，结果，获得比引物更高的热稳定性。或者例如，可以将非常规DNA碱基掺入到引物或探针中，从而导致与只含有常规DNA碱基的引物或探针相比较，具有更大或更小的热稳定性。也可以改变热循环的参数以利用探针和引物不同的热稳定性。例如，在热循环中变性步骤之后，可引入一个允许探针结合而不允许引物结合的中间温度，然后再将温度进一步降低以允许引物退火与延伸。
为了优先使探针先于引物进行结合，也可以使用相对于引物浓度而言过量的高摩尔的探针。这样的探针浓度典型地是在比每种引物浓度高约2至20倍的范围内，后者一般是0.5-5×10-7M。
可通过任何合适的方法来制备引物与探针。制备特定序列的寡核苷酸的方法在本技术领域中是已知的，包括，例如，合适序列的克隆和限制性酶切及直接化学合成。化学合成方法可包括，例如Narang et al.，1979，Method in Enzymology，6890中描述的磷酸三酯法、Brown et al.，1979，Method in Enzymology 68109中介绍的磷酸二酯法、Beaucage et al.，1981，Tetrahedron Letters 221859中介绍的二乙基氨基磷酸酯法，及美国专利4,458,066中公开的固相支持法。此外，可在寡核苷酸中引入修饰，从而影响酶对寡核苷酸的作用。例如，引入修饰的磷酸二酯键(例如，硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、氨基磷酸酯或boranophosphate)，或者在探针中引入非亚磷酸(phosphorous acid)衍生物键接，从而抑制在所选位点进行剪切；或者，例如，含有2′氨基修饰的糖可能使寡核苷酸的取代超过消化。
寡核苷酸引物的模板依赖的延伸反应在存在足够量的四种脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dGTP、dCTP与dTTP)或上述的类似物时，由聚合反应试剂催化，反应介质由适量的盐、金属阳离子及pH缓冲液体系组成。合适的聚合反应试剂是已知催化引物和模板依赖的DNA合成并具有5′到3′核酸酶活性的酶。已知的DNA聚合酶包括，例如，大肠杆菌DNA聚合酶I、Tth DNA聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)DNA聚合酶、Thermococcus littoralis DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶与Z05DNA聚合酶。使用这些DNA聚合酶催化DNA合成的反应条件在本技术领域中是众所周知的。为了应用于本发明中，聚合反应试剂必须能够有效剪切寡核苷酸并释放被标记的片段，从而可以直接或间接产生信号。
合成的产物是由模板链与引物延伸链组成的双链体分子。这种合成的副产物是由单、双及更大核苷酸片段混合物组成的探针片段。变性、探针和引物退火、引物延伸及探针剪切的重复循环导致由引物确定的区间的指数式增加，标记的片段也以指数形式产生。进行足够多的循环以获得可检测量的比背景信号通常高几个数量级的探针片段。
在优选的方法中，PCR反应作为一个使用热稳定酶的自动过程来进行。在该过程中，反应混合物循环地经过变性步骤、探针和引物退火步骤及合成步骤，从而使剪切与置换与引物依赖的模板延伸反应同时发生。可使用温度循环仪，例如Applied Biosystems已商业化的专门设计为使用热稳定酶的仪器来进行上述反应步骤。
在该自动化过程中，温度稳定的聚合酶是优选的，这是因为在PCR循环过程中，将双链延伸产物变性的优选方式要将这些它们暴露在高温中(大约95℃)。例如，美国专利4,889,818公开了一种从水生栖热菌中分离的具有代表性的热稳定酶。其他具有代表性的温度稳定聚合酶包括，例如，从耐热细菌黄栖热菌(Thermus flavus)、红栖热菌(Thermus rubber)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(与其它列出的相比，其具有更低的最适温度)、乳栖热菌(Thermus lacteus)、红色栖热菌(Thermus rubens、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、Tbermococcus littoraiis及炽热甲烷嗜热菌(Methanothermus fervidus)中提取的聚合酶。
5′核酸酶反应中的探针是任何能够用来鉴定靶核酸基因型的寡核苷酸。典型地，探针包括与靶核酸区域相对应的核苷酸序列。为了实现本发明中的方法，该区域应含有NS5A基因的937位点。
探针的核苷酸序列可以是任何足以在核酸酶反应中产生片段的长度。在某些的实施方案中，探针的核苷酸序列可以由至少6个核苷酸组成，通常小于140个核苷酸。在一个实施方案中，探针长度在14至60个核苷酸之间。在一个优选实施方案中，探针长度在14至35个核苷酸之间。选择的探针长度要能够提供足够的热力学稳定性，以确保探针与靶序列在PCR退火步骤的温度下能够杂交。例如，具有非常规DNA碱基的探针可比那些具有常规DNA碱基的探针更长或者更短。作为另一个实例，富含A/T序列的探针要比富含G/C序列的探针更长一些。核苷酸变异位点可以位于探针核苷酸序列的任意位置。在优选实施方案中，核苷酸变异位点不位于探针核酸序列的5′末端。
典型地，探针核酸序列与靶区域一致或者互补。但是，探针核酸序列可与靶核苷酸区域的同源性或互补性低于100％。在本发明的某些实施方案中，探针核苷酸序列与靶核苷酸区域的互补性或同源性为99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％。在本发明的某些实施方案中，探针核苷酸序列与靶核苷酸区域在严谨条件下杂交。在本发明的其他实施方案中，探针核苷酸序列与靶核苷酸区域在低严谨条件下杂交。
除了探针的核苷酸序列，探针还可以包含附加的核苷酸序列或者其它不干扰本发明方法的部分。在本发明的便利的实施方案中，探针可以包括附加的核苷酸序列或者其它促进本发明方法的部分。例如，可以对探针3′末端进行封闭，以防止不需要的扩增引发。同样，可以存在于探针中的部分用来使探针或者探针片段与靶核苷酸序列的杂交不稳定。
在本发明的某些实施方案中，探针可包含一个标记物。在便利的实施方案中，标记物可以是利于检测核酸酶反应中产生的靶探针片段大小的标记物。
将可通过分光光度、光化学、生物化学、免疫化学或者化学方法检测的部分整合到探针中而对其进行标记。当然，将标记物与寡核苷酸探针耦联或键合的方法依赖于所用标记物的类型及标记物在探针中的位置。
适于检测的各种标记物及将其整合到探针中的方法在本技术领域中是已知的；包括，但不局限于，酶(例如，碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶)与酶的底物、放射性原子、荧光染料、生色团、化学发光标记物、电化学发光标记物，例如OriginTM(Igen)，具有特异结合配偶体的配体、或者任何其他可通过相互作用而增强、改变或降低信号的标记物。当然，由于核酸酶反应通过热循环仪来实现，因此标记物应能够存在于该自动化过程所需的温度循环中存在。
在放射性原子中，32P是优选的。将32P引入核酸中的方法在本技术领域中是已知的，包括，例如，使用激酶进行5′标记，或者通过切口平移随机插入。典型地酶通过其活性进行检测。“特异结合配偶体”是指能够高特异性地与配体分子结合的蛋白，如抗原与单克隆抗体之间的特异性结合。其他特异结合配偶体包括生物素与亲和素或链亲和素、IgG与蛋白A，以及本技术领域中已知的多种受体-配体结合物。应理解以上描述并不表示将各种标记物划分到不同的种类中，因为同样的标记物可以在多种不同模式中使用。例如，125I可以作为放射性标记物或者作为电子密试剂。HRP可以作为酶或者单克隆抗体的抗原。另外，为了达到所需效果，可以将多种标记物组合使用。例如，可以用生物素标记探针，而使用标记125I的亲和素或者使用标记HRP的抗生物素单克隆抗体来检测其存在。其他的改变和可能性对本技术领域中的普通技术人员而言是显而易见的，而且作为等价物包含在本发明的范围中。
标记物可以通过各种技术直接或者间接附加在寡核苷酸上。根据使用的标记物的确切类型，可以使标记物位于探针的5′或3′末端、位于探针核苷酸序列的内部，或者具有各种长度及组成的间隔臂以利于信号的相互作用。使用商品化获得的亚磷酰胺试剂，通过适当保护的亚磷酰胺可以产生在其中一个末端含有功能基团(例如，硫醇或者伯胺)的寡聚物，并可通过，例如PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications，Innis et al.，等编辑Academic Press，Inc.，1990中描述的方法标记它们。
引入寡核苷酸功能试剂的方法以将一个或者多个巯基、氨基或羟基部分引入到寡核苷酸探针序列中，典型地是在5′末端，在美国专利4,914,210中所描述。通过使用多核苷酸激酶及提供报告基团的[γ-32P]ATP可引入5′磷酸基团，作为放射性同位素。生物素可以通过使在合成过程中引入的氨基胸苷残基或氨烷基接头与生物素的N-羟基琥珀酰亚胺酯反应而添加到5′末端。
3′末端的标记物可以通过多核苷酸末端转移酶添加上理想的部分，例如，蛹虫草菌素35S-dATP及生物素化的dUTP。
寡核苷酸衍生物也是可应用的标记物。例如，乙烯(etheno)-dA与乙烯-A是已知的荧光腺嘌呤核苷酸，可以整合到寡核苷酸探针上。同样地，乙烯-dC是另一种可以用在探针合成中的类似物。通过PCR中聚合酶的5′到3′核酸酶活性作为DNA聚合酶延伸引物，含有这类核苷酸衍生物的探针可被水解以释放出更多强荧光单核苷酸。
在实现本发明的一个优选实施方案中，标记物是利于寡核苷酸片段检测的荧光。这些标记物包括，但不限于，荧光素、多卤荧光素，优选的是六氯荧光素、香豆素、罗丹明、花菁、嗪、噻嗪与squaraines。在进一步的优选实施方案中，单个探针是使用荧光染料(即标记物)与淬灭剂双标记的。当探针完整时，标记物的荧光被淬灭剂淬灭。而在标记物与淬灭剂之间剪切探针将导致由标记物发射的荧光更少地被淬灭。可以实现本发明中该方面的示例性组合是荧光染料罗丹明590和淬灭剂结晶紫。
NS5A基因937位点的核苷酸同一性可在相同分析中通过利用单一的5′核酸酶反应在测定样品中HCV类型或亚型(即HCV基因分型分析)而确定。在该实施方案中，用来检测NS5A基因937位核苷酸置换的探针是与一种或多种在单个5′核酸酶反应中用于HCV基因分型检测(例如，与高序列多样性的HCV基因组的5′UTR区杂交的探针)的探针的混合物。在优选实施方案中，每个单独的探针均含有其自身独特的标记物(例如，独特的荧光染料)，从而将其信号与单个5′核酸酶反应中其他探针产生的信号进行区分。
937位的核苷酸可以通过由5′核酸酶反应衍生的名为后PCR(post-PCR)融解/退火分析进行鉴定。典型地，5′核酸酶反应中的双标记探针(即，探针包括荧光染料和淬灭剂)在实时或动态PCR过程中以生长曲线的形式产生荧光信号，由该曲线可以计算出Ct值，并用于获得定量或定性运算的结果。在该过程中，探针被具有5′核酸酶活性的酶剪切，产生各种DNA片段，其中一些仍然被荧光报告物所标记。这些片段一旦产生，便不再参与信号的产生。然而，在某些情况下，全长的完整双标记探针在PCR结束之后还有残留。如果残留的探针很充足，就可以用来通过融解步骤提供关于靶核酸的进一步信息，在该步骤中，探针从靶核酸上解离，所导致的荧光改变用于测定探针与特定的靶核酸之间的融解温度(Tm)，这种荧光的改变与序列的匹配及错配(即基因分型)相关。荧光的改变是由于荧光报告物与淬灭剂之间的距离的变化造成，所述距离的变化是由于在探针由不规则螺旋结构及与靶核酸碱基配对的退火结构之间的转变而造成的。通过进行不对称PCR，其中产生与探针结合的链的引物的浓度过量，从而降低在PCR过程中被剪切的探针的量，并确保留下足够的用于后PCR融解分析的探针。
937位核苷酸可以通过美国专利6,031,098中描述的受阻插入化合物(hindered intercalating compounds)或者试剂来测定，其全部内容结合于此作为参考。简言之，这些可具有可检测标记物或者能够催化光解作用的化合物具有足够的位阻，使得它们只能够插入到存在碱基错配的核苷酸碱基之间，因此可用于检测单核苷酸变异。
另一种用于检测937位核苷酸的有用技术是质谱分析(MS)。虽然与电喷射(Electrospray)/离子喷射(Ionspray)偶联的液相色谱技术(LC-ESI/MS)也是一种重要的工具，但在核酸基因分型领域中最常用的MS技术已是基质辅助激光解吸离子化法(MALDI-MS)。典型地，利用MS确定核酸序列是通过常规的DNA测序方法进行的，例如利用引物与确定的脱氧核糖核苷酸及双脱氧核糖核苷酸混合物、并通过MALDI检测获得的“梯状条带”的链终止法。在美国专利6,258,538(其全部内容结合于此作为参考)所描述的另一个方法中，靶核酸固定在固体支持物上。然后引物与靶核酸在待分析的核苷酸位点附近退火。在存在选择的脱氧核糖核苷酸及双脱氧核糖核苷酸混合物的情况下进行引物延伸。然后通过质谱分析所获得的延伸及未延伸引物的混合物，从而测定待测位点的核苷酸的同一性。
基于蛋白的检测技术也被证明是有用的，尤其是在本发明检测HCV-1a的NS5A蛋白313位氨基酸的同一性方面。为了检测氨基酸变异，可应用蛋白质测序技术。例如，NS5A蛋白或者其片段可以通过使用从被检验个体分离的NS5A多核苷酸片段的重组表达进行合成。优选地，使用不超过100至150个碱基对，含有937位核苷酸的NS5A cDNA片段。然后可以通过常规的蛋白质测序方法来测定肽的氨基酸序列。近年来开发的HPLC-显微术串联质谱技术(microscopy tandem mass spectrometry)也可用来测定氨基酸序列变异。在该技术中，对蛋白进行蛋白酶消化，获得的肽混合物通过反相色谱分离法进行分离。然后进行串联质谱法，并对收集的数据进行分析。参见Gatlin et al.，Anal.Chem.，72757-763(2000)。
其他有用的基于蛋白的检测技术包括基于个体基因型特异抗体的免疫亲和试验，即，依照本发明的特异于含有氨基酸置换的蛋白的抗体。抗体可用于从样品溶液中免疫沉淀特异的蛋白，或者对通过例如聚丙烯酰胺胶分离的蛋白进行免疫印迹。免疫细胞化学法可用于检测组织或细胞中特异的蛋白多态性。也可使用其他熟知的基于抗体的技术，包括，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、免疫放射分析(IRMA)及免疫酶测定法(IEMA)，包括用单克隆或者多克隆抗体进行的三明治测定法。参见，例如，美国专利4,376,110与4,486,530，其结合于此作为参考。
本发明还涉及含有有用组分以实现本方法的试剂盒，容器单元。可用的试剂盒可含有用于检测NS5A基因置换937位点中937位核苷酸置换的寡核苷酸。在某些情况下，检测探针可以固定在合适的支持膜上。试剂盒还包括用于扩增含有置换位点的NS5A基因座区域的扩增引物，因为这些引物在本发明的优选实施方案中是有用的。备选地，有用的试剂盒可以包括一系列引物，其包含特异扩增NS5A基因的序列特异性引物。试剂盒的其他任选组分包括此处所述的用于基因分型方法的附加试剂。例如，试剂盒还可包括催化引物延伸产物合成的试剂、底物核苷三磷酸、标记和/或检测核酸的工具(例如，如果标记物是生物素，则是亲和素-酶偶联物，及酶的底物和色原)、用于扩增或杂交反应的合适缓冲液，以及实施本方法的说明书。
以下所述的本发明的实施例仅用于举例说明目的，而不限制本发明的范围。对本领域熟练人员来说，阅读前述文字和以下实施例后，本发明的许多实施例均在实施例之后的权利要求的范围内。
具体实施例方式
实施例Roferon临床研究概述Roferon-A(IFN-α-2A)临床试验N-139203/NV14524B是一个随机的，多中心的III期临床研究，完成于1997年7月。其目标是比较Roferon-A(从6MIU到3MIU的生活制度)在治疗慢性HCV患者中24周和48周的效率和安全性(参见表1)。
HCV基因型在患者中的分布如表2所示。基于使用SAS中logistic回归程序而得到的几率应答，在预研究检测(病毒血症、HCV基因型、病毒应答、年龄、性别、种族、体表面积、疾病阶段、组织学活动指标和ALT)中没有差异。
收集生化(肝脏酶学检测或ALT)和病毒学(PCR检测的病毒负荷)检测用于数据分析的时间窗口是0周(活性临床治疗的第一天)、12周、20周、24周、48周和72周。所有分析，包括图表，列表和绘图均通过SASPROC GLM程序进行分析。在24周组的应答率是15％，在48周的应答率为19％，二者是统计学上相等的。
表1分组信息

表2基因型分布

序列分析概述对各个时间点的生物化学(ALT)和病毒学(PCR)应答进行绘图，并用于评估治疗结果(参见表3处理结果分类规则)。通过来源于Roferon临床试验(NV14524)的贮存的患者血清，从遗传学专业实验室(PGL，在Uppsala，Sweden)获得患者病毒亚基因组NS5A区域不应答(NR)或完全应答(CR)的预处理和处理的序列。在分析中包括总数110个HCV-1b患者中的28个样品(18NR，10CR)和总数182个HCV-1a患者中的24个样品(13NR，11CR)。通过Silicon Graphics的MineSet构建决策树(decisiontree)，并根据处理结果对个体进行分类。
表3IFN处理结果的种类


将NS5A区的氨基酸变化转换为二元形式。备选地，用“0”表示不存在该残基，用“1”表示存在该残基，从而对真正的氨基酸序列记分，构建蛋白的每个残基位置各种可能氨基酸的表格，以代表序列数据。软件对IFN处理产生的完全应答或不应答相关的突变进行鉴定。在该树中，以描述的每个分支到达“树叶”的步长来构建规则。例如，在8个73位是缬氨酸而195位不是丙氨酸的HCV-1b序列中，所有的均是不应答的。同样，其它规则均写在树的所有“树叶”上。决策树构建的一般分析策略是将数据分为两部分，一部分用于构建树，而另一部分用于检测树。由于获得NS5A序列数据的患者数目较少，因此所有的数据均用于构建树。当将规则反过来应用于数据时，错判率对HCV-1b而言为14％，对HCV-1a而言为4％。HCV-1a的详细结果参见表4。
表4对NS5A-1a预测的评估

因此92％的313I＝NR
根据这些结果，在5.5倍更可能是不应答患者(耐受干扰素治疗)的HCV-1a患者中，氨基酸残基313I(异亮氨酸)与NR的相关性是统计学上显著的(Fischer exact test，p＜0.001)。而HCV-1b患者的序列模式(残基73V & 195A)的观察不是统计学上显著的(卡方检验，具有2个自由度的x2＝1.49)。
序列特异性扩增/引物延伸通过改变一个引物3’端的碱基，可使一个核苷酸变异比另外一个得到优先扩增。为了优先扩增“A”变异体，最好选择是在有义链上的上游引物末端用A代替G，从而使更不稳定的A-C错配超过G-T错配。通过Northwestern University的Oligonucleotide Properties Calculator(http//www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html)软件设计引物长度，使每个引物的总Tm值约为65℃。在所有情况下都进行了盐浓度调整测定。上游引物的一个实例如下有义链5’-GATTCGCCCCAGCCCTGCCCA*-3’)(SEQ ID NO3)(星号表示937位的核苷酸)可通过Oligo Primer Analysis软件，版本为6.32(Molecular BiologyInsights，Inc.)设计匹配的下游引物，这种引物的实例如下反义链5’-GGCCAAGGCAGTAGGTAGGGT-3’(SEQ ID NO4)为了优先扩增“G”变体，一个选择是将靶DNA反义链上的下游引物设计为末端以C代替T，从而形成更不稳定的C-A错配。为了使错配的末端碱基更不稳定，可分别用叔-丁基-苄基-dA或叔-丁基-苄基-dC作为最后一个碱基，增加一个较大的基团可增加空间位阻，从而使完全匹配模板比错配模板更优先地被延伸。下游引物的一个实例如下反义链5’-GTAGTCCGGCCGCCGCGCCCAGAC*-3’(SEQ ID NO5)(星号表示937位的核苷酸)
通过Oligo 6.32设计的一个匹配上游引物的实例如下有义链5’-CATAGGTTTGCGCCCCCTTGC-3’(SEQ ID NO6)为了使某个变异比其他变异更优先的被扩增出来，扩增条件应尽可能严谨。这可通过仔细选择热循环条件来完成，特别是选择退火/延伸温度，以确保3’端完全匹配比3’端有一个碱基对错配更优先扩增。引物Tm设计在65℃附近，因此检测了58-65℃的退火温度，以确定利于目的核苷酸变异的最佳温度。
典型的热循环条件，如COBAS TaqMan 96仪器所用的条件为95℃20秒，58-65℃退火/延伸40秒，共扩增35个循环。扩增后，通过2.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。另外，在通过可检测染料信号增加的热循环仪，例如ABI PRISM 7700，进行实时PCR检测的扩增中，可加入0.2x浓度的内部嵌入染料Sybr Green。
典型的PCR master mix包括以下成分，以每100μl反应液的终浓度表示ZO5 DNA聚合酶20个单位Tricine，pH8.0 100mMKOAc，pH7.5 125mM甘油 9.0％dATP 200μMdUTP 200μMdGTP 200μMdCTP 200μM引物125pmol引物225pmolUNG 1个单位5’核酸酶反应通过5’核酸酶探针化学和仔细优化使完全匹配模板比错配模板更利于切割的退火/延伸温度可区分单碱基对错配。将含有报告染料(例如FAM)和淬灭染料(例如CY5)的5’核酸酶探针通常设计为其Tm比引物的Tm约高10℃，从而在引物延伸前利于探针与靶序列退火，然后对探针进行切割。这种切割可将报告染料与淬灭染料分离，从而可检测由报告染料散发的染料。在重复的PCR循环中，这些染料散发随产生的扩增子数目的增加而增加，可绘制成生长曲线，从而表明荧光随循环数的增加。探针与模板序列之间的错配可使这种结合不稳定，从而对探针进行切割。
区分“G”和“A”变体的5’核酸酶探针的实例如下反义链5’-FAM-CAGA(C/T)GGGCAGGGCTGGGGCGA-CY5-3’(SEQ ID NO7)如以上实施例所描述，将5’核酸酶探针以终浓度10pmol加到PCR反应混合物中。该探针设计为Tm约为72℃，以在Tm约为65℃的引物之前进行结合。也可通过Oligo 6.32软件设计该探针区的匹配引物，实例如下有义链引物5’-GAGATGGGCACCATCACC-3’(SEQ ID NO8)反义链引物5’-GGCCAAAGTAGGTAGGGT-3’(SEQ ID NO9)使用与前述实施例相同的热循环条件。
可使用可激活报告染料并测定随后的荧光发射的热循环仪，例如COBAS TaqMan 96或ABI PRISM 7700。
后PCR的融解分析另一种区分单碱基对变体间的方法是设计可在变异位点附近进行扩增的PCR引物，在PCR反应后，利用可与目的区域退火的荧光标记的探针产生融解曲线。典型地，将最后一轮扩增后的PCR扩增产物在荧光标记探针的存在下加热到95℃进行变性产生融解曲线。然后将温度快速冷却到40℃以使探针与同源的扩增子区快速再退火。然后将温度慢慢升到80℃，并在每个温度步骤频繁读取荧光值。当温度达到使探针与扩增子解离的点时，则标记探针的荧光发生偏移，可对这种荧光的变化进行检测。探针与扩增子的单碱基对错配使探针比完全匹配时在更早的温度下发生解离或“融解”掉，从而通过其各自的融解温度将两个产物区分开。可通过5’核酸酶实施例中的PCR引物和探针检测法产生融解曲线。
另外，另一种通过杂交探针化学进行的PCR检测法也可用于产生差异融解曲线，但在这种情况下，用两条探针代替一条探针。第一条探针命名为“锚定”探针，设计为其Tm比第二条探针，即“感应”探针的Tm高，锚定探针用3’末端供体染料，例如FAM合成。感应探针5’末端标记受体染料，例如LC640。在PCR退火过程中，这两个探针设计为结合在目的区域，供体探针的3’末端与受体探针的5’末端间隔1-5个核苷酸。在该步骤中，荧光能量从FAM染料转移到LC640受体染料中，因此对LC640染料的发散进行测定。在PCR的下一个步骤中，升高温度，以利于PCR产物的延伸及寡聚探针对的解离，保存探针用于PCR的后续循环中，并随后产生融解曲线。在该情况下，三步PCR的温度条件如下95℃变性步骤20秒58℃退火步骤20秒72℃延伸步骤40秒，共45循环这种PCR反应必须在能够激发FAM染料并能够测定LC640染料散发的仪器上进行，例如LightCycler2.0。
用两条杂交探针作为锚定探针和感应探针，而且也使用5’磷酸酶实施例中所描述的引物来区分两个不同的NS5A变体的预实施例如下锚定探针5’-AGTCTCGGAGATTCGCCCC-FAM-3’(SEQ ID NO10)感应探针5’-LC640-GCCCTGCCC(A/G)TCTG-3’(SEQ ID NO11)已经设计锚定探针的Tm为62℃，而与扩增子完全匹配的感应探针的Tm设计为53℃。一个单碱基对错配可能使Tm值比完全匹配时至少低4℃。在这种情况下，锚定探针与感应探针之间相隔一个单碱基对。
PCR测序可用5’核酸酶反应实施例中所描述的引物(SEQ ID NO8和SEQ IDNO9)及上述PCR条件进行PCR测序。
序列表<110>霍夫曼-拉罗奇有限公司<120>作为干扰素应答标记的NS5A核苷酸序列变体<130>case 22600<160>11<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1338<212>DNA<213>丙型肝炎病毒<400>1tcctggctaa gggacatctg ggactggata tgcgaggtgc tgagcgactt taagacctgg 60ctgaaagcca agctcatgcc acaactgcct gggattccct ttgtgtcctg ccagcgcggg120tatagggggg tctggcgagg agacggcatt atgcacactc gctgccactg tggagctgag180atcactggac atgtcaaaaa cgggacgatg aggatcgtcg gtcctaggac ctgcaagaac240atgtggagtg ggacgttctt cattaatgcc tacaccacgg gcccctgtac tccccttcct300gcgccgaact ataagttcgc gctgtggagg gtgtctgcag aggaatacgt ggagataagg360cgggtggggg acttccacta cgtatcgggc atgactactg acaatctcaa atgcccgtgc420cagatcccat cgcccgaatt tttcacagaa ttggacgggg tgcgcctaca taggtttgcg480cccccttgca agcccttgct gcgggaggag gtatcattca gagtaggact ccacgagtac540
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1 5 10 15Phe Lys Thr Trp Leu Lys Ala Lys Leu Met Pro Gln Leu Pro Gly Ile20 25 30Pro Phe Val Ser Cys Gln Arg Gly Tyr Arg Gly Val Trp Arg Gly Asp35 40 45Gly Ile Met His Thr Arg Cys His Cys Gly Ala Glu Ile Thr Gly His50 55 60Val Lys Asn Gly Thr Met Arg Ile Val Gly Pro Arg Thr Cys Lys Asn65 70 75 80Met Trp Ser Gly Thr Phe Phe Ile Asn Ala Tyr Thr Thr Gly Pro Cys85 90 95Thr Pro Leu Pro Ala Pro Asn Tyr Lys Phe Ala Leu Trp Arg Val Ser100 105 110Ala Glu Glu Tyr Val Glu Ile Arg Arg Val Gly Asp Phe His Tyr Val115 120 125Ser Gly Met Thr Thr Asp Asn Leu Lys Cys Pro Cys Gln Ile Pro Ser
130 135 140Pro Glu Phe Phe Thr Glu Leu Asp Gly Val Arg Leu His Arg Phe Ala145 150 155 160Pro Pro Cys Lys Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Ser Phe Arg Val Gly165 170 175Leu His Glu Tyr Pro Val Gly Ser Gln Leu Pro Cys Glu Pro Glu Pro180 185 190Asp Val Ala Val Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp Pro Ser His Ile Thr195 200 205Ala Glu Ala Ala Gly Arg Arg Leu Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ser Met210 215 220Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gln Leu Ser Ala Pro Ser Leu Lys Ala Thr225 230 235 240Cys Thr Ala Asn His Asp Ser Pro Asp Ala Glu Leu Ile Glu Ala Asn245 250 255Leu Leu Trp Arg Gln Glu Met Gly Gly Asn Ile Thr Arg Val Glu Ser
260 265 270Glu Asn Lys Val Val Ile Leu Asp Ser Phe Asp Pro Leu Val Ala Glu275 280 285Glu Asp Glu Arg Glu Val Ser Val Pro Ala Glu Ile Leu Arg Lys Ser290 295 300Arg Arg Phe Ala Pro Ala Leu Pro Val Trp Ala Arg Pro Asp Tyr Asn305 310 315 320Pro Leu Leu Val Glu Thr Trp Lys Lys Pro Asp Tyr Glu Pro Pro Val325 330 335Val His Gly Cys Pro Leu Pro Pro Pro Arg Ser Pro Pro Val Pro Pro340 345 350Pro Arg Lys Lys Arg Thr Val Val Leu Thr Glu Ser Thr Leu Pro Thr355 360 365Ala Leu Ala Glu Leu Ala Thr Lys Ser Phe Gly Ser Ser Ser Thr Ser370 375 380Gly Ile Thr Gly Asp Asn Thr Thr Thr Ser Ser Glu Pro Ala Pro Ser
385 390 395 400Gly Cys Pro Pro Asp Ser Asp Val Glu Ser Tyr Ser Ser Met Pro Pro405 410 415Leu Glu Gly Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Gly Ser Trp Ser420 425 430Thr Val Ser Ser Gly Ala Asp Thr Glu Asp Val Val Cys Cys435 440 445<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>3gattcgcccc agccctgccc a 21
<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>4ggccaaggca gtaggtaggg t 21<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>5gtagtccggc cgccgcgccc agac24
<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>6cataggtttg cgcccccttg c 21<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述探针<220>
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<223>y是c或t/u<400>7cagaygggca gggctggggc ga 22<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>8gagatgggca ccatcacc 18<210>9<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>9ggccaaagta ggtagggt 18<210>10<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述探针<400>10agtctcggag attcgcccc 19<210>11<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述探针<220>
<221>misc_feature<222>(10)<223>r是a或g<400>11gccctgcccr tctg 1权利要求
1.一种预测感染HCV-1a的人类受试者对干扰素治疗应答的方法，包括a)提供来源于所述人类受试者的HCV-1a多核苷酸，其包含一个部分，所述部分包括NS5A基因937位的核苷酸，和b)测定所述937位的核苷酸是否是G，其中937位G的存在表明所述人类受试者对干扰素治疗持续的病毒学应答的增加的可能性。
2.干扰素在制备用于治疗感染HCV的人类受试者的药物中的应用，其中在所述的感染HCV的人类受试者中，HCV-1a多核苷酸的NS5A基因的937位核苷酸是G。
3.权利要求1中的方法，其中NS5A基因937位核苷酸的检测进一步包含检测感染人类受试者的HCV的毒株型或亚型。
4.权利要求1或3中的方法，其中所述的检测步骤包含实施一种鉴定，所述鉴定能够检测NS5A基因的937位的单核苷酸置换。
5.权利要求1，3或4中的方法，其中所述鉴定或检测步骤包含对包括937位核苷酸的NS5A基因的部分进行测序。
6.权利要求1，3或4中的方法，其中所述鉴定或检测步骤包含序列特异的扩增或引物延伸检测。
7.权利要求1，3或4中的方法，其中所述鉴定或检测步骤包含5’核酸酶反应检测。
8.权利要求1，3或4中的方法，其中所述鉴定检测步骤包含后-PCR融解分析检测。
9.一种预测感染HCV-1a的人类受试者对干扰素治疗应答的方法，包括a)提供来源于所述人类受试者的HCV-1a多肽，其包含一个部分，所述部分包括NS5A蛋白313位的氨基酸，和b)测定所述313位的氨基酸是否是缬氨酸，其中313位缬氨酸的存在表明所述人类受试者对干扰素治疗的持续病毒学应答的增加的可能性。
10.干扰素在制备用于治疗感染HCV的人类受试者的药物的应用，其中在所述的感染HCV的人类受试者中，HCV-1a蛋白的NS5A蛋白的313位氨基酸是缬氨酸。
11.权利要求2或权利要求10中的应用，其中干扰素治疗选自Roferon-A、Pegasys、IntronA或Peg-Intron。
12.一种预测感染HCV-1a的人类受试者对干扰素治疗应答的方法，包括a)提供来源于所述人类受试者的HCV-1a多核苷酸，其包含NS5A基因937位的核苷酸，和b)测定所述937位的核苷酸是否是A，其中937位A的存在表明所述人类受试者对干扰素治疗病毒学无应答的增加的可能性。
13.权利要求12中的方法，其中NS5A基因937位核苷酸的检测进一步包含检测感染人类受试者的HCV的毒株型或亚型。
14.权利要求12中的方法，其中所述检测步骤包含实施一种鉴定，所述鉴定能够检测NS5A基因937位单核苷酸置换。
15.权利要求12到14任何一项权利要求的方法，其中所述鉴定或检测步骤包含对包括937位核苷酸的NS5A基因的部分进行测序。
16.权利要求12到14任何一项权利要求的方法，其中所述鉴定或检测步骤包含序列特异的扩增或引物延伸检测。
17.权利要求12到14任何一项权利要求的方法，其中所述鉴定或检测步骤包含5’核酸酶反应检测。
18.权利要求12到14任何一项权利要求的方法，其中所述鉴定或检测步骤包含后-PC融解分析检测。
19.一种预测感染HCV-1a的人类受试者对干扰素治疗应答的方法，包括a)提供来源于所述人类受试者的HCV-1a多肽，其包含一个部分，所述部分包括NS5A蛋白313位的氨基酸，和b)测定所述313位的氨基酸是否是异亮氨酸，其中313位异亮氨酸的存在表明所述人类受试者对干扰素治疗的病毒学无应答的增加的可能性。
20.一种可用于检测HCV-1a的NS5A基因937位核苷酸置换的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度为14-35个核苷酸，且与包括937位核苷酸的NS5A基因区域的一条链基本互补。
21.权利要求20中的寡核苷酸，其中所述区域的范围是从SEQ ID NO1的908位核苷酸到957位核苷酸。
22.权利要求20中的寡核苷酸，其选自SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO10或SEQ ID NO11。
23.一种用于预测感染HCV-1a的人类受试者对干扰素治疗应答的试剂盒，其包含权利要求20-22任何一项权利要求的寡核苷酸和聚合酶。
全文摘要
描述了用于预测个体对干扰素治疗的应答的方法和试剂，其用于测定HCV－1a NS5A基因937位的核苷酸变异。
文档编号C07K14/18GK1693482SQ20051006852
公开日2005年11月9日 申请日期2005年4月29日 优先权日2004年4月29日
发明者安德鲁·迈克尔·阿克里尔, 卡林娜·安娜·奥尔莱, 莫里斯·佩特森 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司