专利名称：一种雷莫拉宁的纯化方法
技术领域：
本发明涉及抗生素雷莫拉宁的制备，特别涉及一种雷莫拉宁的纯化方法。
背景技术：
雷莫拉宁(Ramoplanin，A/16686)提纯的传统方法是通过常规前处理步骤用盐酸将产生雷莫拉宁菌株，如Actinoplanes sp.ATCC 33076的发酵产物调pH至3.5，分离得到菌丝体和发酵液。其中菌丝体用有机溶剂，如甲醇等低级醇或氯仿等提取，得到含有目的物的粗提液，真空浓缩得到浆状物，即雷莫拉宁的粗提液浓缩物，再用正丁醇萃取多次，合并萃取液后，再反复用石油醚析出沉淀并分离其，真空干燥得到粗品；而发酵液也用正丁醇萃取，然后用同样方法制得粗品。该粗品反复用混合溶剂氯仿∶乙醇∶水(体积比4∶7∶2)处理，得到油状物，加水结晶并固液分离，得到的固体和液体还需不同溶剂多步处理后，得到较纯的粗品再湿法上硅胶柱纯化；例如上述的固体用不同的有机溶剂(如甲醇、正丁醇、乙醚等)反复处理，得到较纯的粗品后再溶于乙腈与水的混合物，然后湿法上硅胶柱，用不同溶剂(乙腈与水混合物，以及乙腈与0.1N盐酸混合物)作为流动相洗柱子，用薄层色谱法检测，收集目的洗脱液(USP 4328316)。可见其过程复杂，有机溶剂使用量很大，污染严重，且由于萃取次数多，造成损失而收率低。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术中的缺陷，提供一种步骤简化、明显减少有机溶剂使用量的雷莫拉宁的纯化方法。
本发明通过下列技术方案来解决上述技术问题。一种雷莫拉宁的纯化方法，其包括将雷莫拉宁的粗提液浓缩物先与部分硅胶混合，挥干溶剂，再将得到的固体混合物置于以硅胶为填充物的柱子上端进行柱层析，其中依次用丙酮、甲醇水溶液、以及甲醇与酸水的混合物作为流动相。
其中，该甲醇与酸水的体积比较佳地为1∶4～4∶1。甲醇含量太高或者太低的话，雷莫拉宁和其他的杂质分离效果不明显。所说的酸水选自盐酸，硫酸、醋酸和磷酸等；通常选用其稀溶液，其浓度优选为0.01mol/l～1mol/l。
而该甲醇水溶液中甲醇与水的体积比优选1∶4～4∶1。甲醇比例太低的话，有些杂质洗脱速度慢；反之，甲醇比例太高，有些杂质也不容易洗脱下来。
更佳地，该硅胶柱中粗提液浓缩物(未挥发溶剂前)占其与硅胶总重量的百分比不超过10％，超过以后，多余量的产物无法被吸附，从而会被开始的丙酮溶剂洗脱下来，无法达到分离的目的。该百分比更佳地为3～8％(根据实施例改的)。而粗提液浓缩物先与部分硅胶混合时，“部分硅胶”的用量是指能够将粗提液浓缩物完全混合吸附后便于上柱的量，大约是和粗提液浓缩物等量就可以了，一般不会超过3倍。
而本发明所说的雷莫拉宁的粗提液浓缩物可根据现有技术制备，如参照上述专利文献所公开的有关内容。本发明选用下列具体步骤制得将产生雷莫拉宁菌株，如ATCC33076的发酵产物用酸调pH至3.5，离心得到菌丝体和发酵液；其中菌丝体再用极性有机溶剂浸泡半小时以上，然后离心得到上清液，浓缩至浆状物即得该雷莫拉宁的粗提液浓缩物。
当然，根据上述专利文献所知，本发明的雷莫拉宁的粗提液浓缩物也可将发酵液直接浓缩至浆状物制得。
其中，所述的酸优选草酸，所述的极性有机溶剂为甲醇或乙醇。
利用上述本发明的干法硅胶柱纯化方法，可分部收集上述不同流动相的流出液，HPLC跟踪检测，收集目的物含量达到85％以上的流出液，浓缩至干得到雷莫拉宁。则纯度达到85％以上，而收率达到90％以上。可见，本发明纯化方法步骤简单，有机溶剂使用量明显减少，并具有较高的收率和纯度。
具体实施例方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。
下面实施例中所用的雷莫拉宁的粗提液浓缩物选用下列步骤制得参照现有技术，如上述美国专利文献的例1发酵培养ATCC 33076菌株，然后发酵产物用草酸调pH至3.5，离心得到菌丝体，再用极性有机溶剂甲醇或乙醇(1L/kg菌丝体)浸泡菌丝体半小时以上，然后离心得到上清液，浓缩至浆状物(通常体积为上清液的1/10～1/20)即得该雷莫拉宁的粗提液浓缩物。
其中下列实施例中的收率由纯化得到的雷莫拉宁/上述上清液(w/w)计算得到。
实施例1取雷莫拉宁的粗提液浓缩物5g，与5g硅胶搅拌混合，挥干溶剂，再将得到的固体混合物置于以50g硅胶为填充物的柱子的上端(柱高×直径20cm×3cm)，分别用丙酮，甲醇与水(v/v，1∶4)的混合物，以及甲醇与0.1mol/l的盐酸水溶液(v/v，1∶4)混合物作为流动相，流速1ml/min，分部收集流出液，采用常规HPLC跟踪检测(方法同现有技术USP 4427656)，收集目的物含量达到85％以上的流出液，浓缩至干得到纯化的雷莫拉宁。收率为93％，纯度达到85％。
实施例2取雷莫拉宁的粗提液浓缩物5g，与7.5g硅胶搅拌混合，流动相中甲醇与水体积比为4∶5，甲醇与酸水(0.5mol/l的硫酸)的体积比为4∶5，余同实施例1。制得雷莫拉宁收率为94％，纯度达到89％。
实施例3
取雷莫拉宁的粗提液浓缩物3g，与5g硅胶搅拌混合，流动相中甲醇与水体积比为4∶1，甲醇与酸水(1mol/l的醋酸)的体积比为4∶1，余同实施例1。制得雷莫拉宁收率为93％，纯度达到87％。
实施例4取雷莫拉宁的粗提液浓缩物2g，与4g硅胶搅拌混合，流动相中甲醇与水体积比为2∶1，甲醇与酸水(0.01mol/l的磷酸)的体积比为2∶1，余同实施例1。制得雷莫拉宁收率为92％，纯度达到86％。
上述实施例中柱层析用硅胶(200～300目)，青岛海洋化工厂产品，余试剂均为常规市售产品。
权利要求
1.一种雷莫拉宁的纯化方法，其包括将雷莫拉宁的粗提液浓缩物与部分硅胶混合，挥干溶剂，再将得到的固体混合物置于以硅胶为填充物的柱子上端进行柱层析，其中依次用丙酮、甲醇水溶液、以及甲醇与酸水的混合物作为流动相。
2.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于该甲醇与酸水的体积比为1∶4～4∶1。
3.如权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于所说的酸水选自盐酸，硫酸、醋酸和磷酸。
4.如权利要求3所述的纯化方法，其特征在于该酸水浓度为0.01mol/l～1mol/l。
5.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于该甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为1∶4～4∶1。
6.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于该硅胶柱中粗提液浓缩物占其与硅胶总重量的百分比不超过10％。
7.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于该雷莫拉宁的粗提液浓缩物可由下列步骤制得将产生雷莫拉宁菌株的发酵产物用酸调pH至3.5，离心得到菌丝体和发酵液；其中菌丝体再用极性有机溶剂浸泡半小时以上，然后离心得到上清液，浓缩至浆状物；或者将发酵液直接浓缩至浆状物即得该雷莫拉宁的粗提液浓缩物。
8.如权利要求7所述的纯化方法，其特征在于所述的酸为草酸，所述的极性有机溶剂选自甲醇和乙醇。
全文摘要
本发明公开了一种雷莫拉宁的纯化方法，其包括将雷莫拉宁的粗提液浓缩物与部分硅胶混合，挥干溶剂，再将得到的固体混合物置于以硅胶为填充物的柱子上端进行柱层析，其中依次用丙酮、甲醇水溶液、以及甲醇与酸水的混合物作为流动相。本发明的提纯方法步骤简单，有机溶剂使用量明显减少，并具有较高的收率和纯度。
文档编号C07G11/00GK101024662SQ20061002415
公开日2007年8月29日 申请日期2006年2月24日 优先权日2006年2月24日
发明者李继安, 徐斌 申请人:上海医药工业研究院