亲和配体的制作方法

专利名称：亲和配体的制作方法
技术领域：
本发明涉及亲和纯化的技术和材料，特别是亲和色谱，以及用于 这个技术的特定新配体。更特别地的是，本发明涉及用肽亲和色谱在变性条件下捕获和纯化以包涵体形式表达的Npro和Npro突变，Npro融合蛋白或捕获和纯化具有高度聚集倾向的蛋白。
背景技术：
亲和色谱是从粗制的复杂混合物中进行特异分离的最有效技术之 一。由于抗体的高选择性和高亲和性，它已经被成功地用作亲和配体。 这些亲和基质的缺点是它们的相对不稳定性，这可能导致从支持基质 上把抗体滤到产物中。此外，用碱性缓冲液再生(一种生物制药学上 的普通工序)可能导致不可逆变性并且失去结合能力。短肽可以代替 抗体作为亲和配体。这些小分子具有高化学稳定性、有效性、选择性 并且价格低而且通常都是无毒的。在应用于生物制药学时，这些特性 比起蛋白配体来说是个优势。可以从组合肽库或生物学库鉴定针对靶 分子的肽。化学合成组合库包括pin-synthesis,茶袋法(teabag)， SPOT等等；生物系库包括噬菌体展示技术、细菌展示、核糖体技术 等。
在另一方面，大量蛋白在生理条件下表现一种很强的聚集倾向或 它们具有聚集的内在生物学活性，比如朊蛋白或淀粉样肽。为了研究 这些蛋白，需要把它们在离液序列高的(chaotropic)条件下溶解，通 过添加去污剂，应用极端pH (酸或碱)的水溶液，加入有机溶剂比如 乙晴、乙醇、异丙醇、丙醇、嘧啶等。这常常是有问题的，这不是不 可能的，特别是如果在溶解或纯化后要进一步研究的话，就不应该破 坏蛋白质的活性。
用于亲和色谱的普通基质通常是在kosmotrophic或生理条件下但 是不在离液序列高的(chaotropic)条件下结合潜在的结合配偶体(partner)。因此，经常通过应用离液序列高的条件从亲和色谱基质 上洗脱亲和纯化组分。

发明内容
因此，本发明的目的是提供能够在离液序列高的(chaotropic)条件下结合亲和配偶体的亲和配体或亲和材料。优选的，这种材料应该 能用于从离液序列高的(chaotropic)条件下的样品中或起始材料中亲 和纯化蛋白，特别是NPpro、 NPpro突变、NPpro融合蛋白以包涵体形式在变 性条件下表达或者在生理条件下显示聚集的高度倾向的蛋白质。
因此，本发明提供了亲和基质，其包含固相和个以肽键连接这个 固相的亲和配体，其中包含肽键的亲和配体是选择下列配体组
a) 包含分子式X1X2X3X4的肽，其中Xx到X4是氨基酸残基，并且 至少Xi到X4中的两个是W、 Y或F;
b) 包含分子式X5XeX7X8的肽，其中X5到X8是氨基酸残基，并且 至少X5到X8中的一个是W，并且至少X5到X8中的一个是E或D; 且
c) 聚氨基酸(poly-amino acids)由来自由R、 K、 E、 D组成的群 组的氨基酸单体和由Y、 F、 W组成的群组的氨基酸单体组成，优选 poly－KY、 poly-KF、 poly-KW、 poly－R丫、 poly-RF、 poly-RW、 poly-EY、 poly-DY、 poly-EF、 poly-EW、 poly-DF或poly－DW，另外还有个附加条件a)和b)的肽的氨基酸残基数最长为35个并且 c)的聚氨基酸残基数最短为20个。
优选的，a)和b)的肽(这里也指"寡肽")长度为5到12，特 别是6到8个氨基酸残基。优选的，这些寡肽至少含一个带正电荷的 氨基酸。c)的聚氨基酸优选长度为至少35个氨基酸残基，更优选的是 至少50个氨基酸，特别是至少100个氨基酸残基。特别优选的聚氨基 酸是如用于细胞培养的商业上可得到的聚氨基酸如poly-KW， 4:1 (分 子量20.000到50.000道尔顿，SIGMA的产品号P9285) 、 poly-KY， 4:1 (分子量20.000至U 50.000道尔顿，SIGMA的产品号P4695) 或poly-KF， 1:1 (分子量20.000至U 50.000道尔顿，SIGMA的产品 号P3150).
本发明的亲和配体可被化学修饰，特别是乙酰化、酯化、酰胺化、 氧化、减少或提供一个连接子分子。
亲和配体优选的通过共价键连于固相基质上。本发明的亲和配体
和基质对于这里所描述的自我蛋白酶具有高亲和力，特别是结合Npra、
它的衍生物和融合蛋白(它们可以包涵体的形式表达)。特别地，这
些配体或亲和基质在离液序列高的(chaotropic)条件下和在 kosmotmpic (非离液序列高的的、生理的，正常的)条件下结合Npra、 它的衍生物和融合蛋白，至少是例如融合蛋白的NT。的部分。本发明 的亲和配体在变性条件下结合Np「°、 NP「。的衍生物和融合多肽具有高度 的特异性。在本发明的范围内，这样的亲和配体直接识别本发明的融 合多肽中具有自身蛋白水解功能的部分。
对于固相材料而言，所有已经用于本领域的材料都是合适的。优 选地，固相选自以下色谱材料，支持物特别是基于纤维素、琼脂糖、 丙烯酰胺、聚(苯乙烯一二乙烯苯)或乙烯乙二醇甲基丙烯酸酯共聚 物、微滴定板(microtiter plates)、硝酸纤维膜、微芯片、玻璃板、 或金属包被的支持物。
根据本发明可以用不同类型的固相支持物，如基于以下物质的支 持物纤维素、琼脂糖(S印harose或Macro-Pr印凝胶)、葡聚糖 (S印hadex凝胶)、丙烯酰胺(S印hacryl, Trisacryl凝胶)、硅胶 (TSK、 SW凝胶)、多聚苯乙烯一二乙烯基苯(Source或Poros 凝胶)、乙烯乙二醇甲基丙烯酸酯共聚物(Toyopearl HW、 TSK、 PW、 fractogel EMD凝胶)或混合物，特别是琼脂糖或葡聚糖的混合物(Su-perdex gel)。经美国主管当局(competent American authorities)(负 责食品和药物管理的FDA)或欧盟机构(European Union agencies) 核准的人或兽医可用的支持物是优先选用的。此外，本发明(支持物 被认为是功能化的)选择的支持物必须能结合，特别是共价结合亲和 配体。固相基质可包含，基质骨架，任何己知的被应用在蛋白质和其 它生物分子的固相分离的天然的或合成的和有机的或无机的基质，如 天然或合成的多聚糖如琼脂和琼脂糖；纤维素、纤维素醚类如羟基纤 维素、羧甲基纤维素；淀粉；树脂如胍尔豆胶(也称树胶糖guar gum)、 阿拉伯树胶、印度树胶(gum ghatti)、黄氏树胶(也称耆胶、刺梧桐树胶gumtragacanth)、刺槐豆月交(locust bean gum)、黄原胶树 脂(xanthangum);果胶；粘液素；葡聚糖；几丁质；聚氨基葡萄糖； 藻酸盐；角叉(莱)胶；肝素；凝胶；合成的聚合物如聚酰胺如聚丙 烯酰胺和聚甲基丙烯酰胺；聚酰亚胺；聚脂；聚醚；聚合的乙烯基复 合物如聚乙烯醇(polyvinylal- cohols)和聚苯乙烯；聚烯烃
(polyalkenes);无机材料如二氧化硅包括无定形二氧化硅和石英； 硅石；金属硅酸盐、可控有孔玻璃和陶瓷(controlled pore glasses and ceramics);金属氧化物和硫化物，或这些天然的或合成的和有机的 或无机的材料的结合物。
基质骨架优选的选择琼脂、琼脂糖、纤维素、纤维素醚如羟丙基 纤维素、羧甲基纤维素、聚酰胺如聚(甲基)丙烯酰胺、聚乙烯醇
(polyvinylalcohols)、硅酸盐(silicas)和可控有孔玻璃(controlled pore glasses)。
特别需要的用作基质骨架的固相材料如琼脂或琼脂糖珠如瑞典
Pharmacia Biotech公司的Sepharose禾卩Superose珠，美国Biorad 公司的Biogel A;基于珠的葡聚糖，如Sephadex (Pharmacia Biotech 公司)；基于珠和膜的纤维素，如捷克斯洛伐克的Secheza公司的 Perloza纤维素；合成珠如Pharmacia Biotech公司的Sephacryl禾口 Superdex;合成的有机聚合体珠，如美国Toso-Haas公司Fractogel; 美国Perceptive Biosystems的POROS介质、Biorad公司的 Bio-Rex、 Bio-Gel P禾n Macro Prep， TESSEK公司的HEMA和 Separon以及美国BioSepra公司的Hyper D禾口 Trisacryl介质，美国 3M公司的Enzacryl禾卩Azlactone;硅酸盐材料的珠子如英国 Bioprocesing公司的可控有孔玻璃一PROSEP和BioSepra公司的 Spherocil;以珠子或膜的形式存在的包被了硅的合成物如美国Arbor Technologies公司的ACTI-DISK、 ACTI-MOD禾tl CycloS印。
典型的，固相基质骨架还有所致功能化的固相基质可以以下形式 存在如不规则粒子或球形的珠子、膜或薄片、铸型的表面(moulded surfaces)或棒状。此外固相材料可全部或部分透过或完全不可透过蛋 白质的。本发明的一个特别有趣的实施方案是用于制备目的的基质的 形状为范围在1到10000 Mm大小的不规则或球形的珠子，优选的是10到1000μm;如10到60μm是用于更高要求的应用，比如从50 到500μm，优选的是50到300μm。
一种特定的基质形式是以包含密度控制颗粒的聚集块(conglomerate) 形式存在的一种密度可控基质。这些聚集块特别适合大规模操作，比如液化或膨胀床色谱，也用于在非装柱的不同的分批次色谱 技术例如在搅拌桶里的单批次吸附。
本发明的亲和配体可吸附于固相材料，是通过任何类型的己知用 于该目的的共价键，或者通过本发明的亲和配体和固相材料间的直接化学反应或通过用合适的已知本身可以用来连接基质骨架和配体的试 剂来使固相材料或配体在先激活。这种合适的激活剂的实施例是表氯醇、表溴醇(epibromohydrin)、烯丙基縮水甘油醚；双环氧化物如丁二醇二縮水甘油醚(butanedioldiglycidylether);卤代的脂肪族化合物如二氯丙醇、二乙烯基砜；羰基二咪唑、醛类如戊二醛、苯醌/溴 化氰；高碘酸盐如间位高碘酸钠；碳化二酰亚胺；氯三嗪如氰尿酰氯； 磺酰氯如甲苯磺酰氯和tresyl氯；N-羟基琥珀酰亚胺；2-氟-1-甲基吡啶甲苯-4-磺酸盐；唑酮；马来酰亚胺(也称顺丁烯二酰亚胺)；二硫吡啶和酰肼。在这些中，留下不同于单键的空间基团SPI的激活试剂是优选的如表氯醇、表溴醇、烯丙基縮水甘油醚、双环氧化物、卤 代脂肪族化合物、乙烯基砜、醛、苯醌、溴化氰、氯三嗪、唑酮、马 来酰亚胺(也称顺丁烯二酰亚胺)、二硫吡啶和酰肼。
特定的激活试剂是环氧化合物，如表氯醇、烯丙基縮水甘油醚和丁二醇二縮水甘油醚(butanedioldiglycjdylether)。
对于本发明范围内的肽亲和色谱来说，任何对肽配体固定有用的 基质都可以使用。优选使用德国达姆施塔特的Merck公司的Fractogel epoxy(M)或同样优选"单片色谱介质"(monolithicchromatography medium) CIM-epoxy。配体可直接固定到化学激活的色谱基质的骨架 或通过一个间隔子或连接子固定。在后面的情况下间隔子连接到色谱基质上，随后为了结合配体，所述的间隔子被化学激活。优选用 Fractogel epoxy基质和间隔子结合。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，间隔子是由色谱基质先 和二氨基二丙胺(diaminodipropylamine) (DADPA)反应随后再和琥珀酸酐(succinicanhydride) (SA)反应产生的。这样使得间隔子末端的羧基被化学激活并且优选连到一个氨基末端。配体通过其所包括的反 应基团固定在基质或间隔子上。在肽配体的情况下这样反应基团可以 是氨基、羧基或巯基。本发明的肽在基质或间隔子上的锚定特别优选 的是通过酰胺键。
优选地，本发明的亲和基质(特别作为色谱材料提供的)就如上 面a)和b)定义的寡肽配体或上面c)定义的多聚氨基酸。
就象这里用到的术语"寡肽"应该指类似蛋白(proteinaceous) 的复合物，至少包括三个氨基酸。通常这种寡肽的长度为35个氨基酸， 优选4到20个氨基酸残基。
因此，在本发明的一个优选的实施方案中亲和色谱系统使用寡肽 配体的长度为5到12个氨基酸，优选6到8个氨基酸，特别是包含色 氨酸残基。在离液序列高的(chaotropic)条件下上述配体有选择的结 合到融合多肽具有自我蛋白水解功能的部分并且在转为或在 cosmotropic条件下保持结合。
这种亲和色谱的形式是利用某种多肽特异结合到其它多肽，就象 例如从抗体所知道的。寡肽也能够作为亲和配体。这些分子具有高化 学稳定性、有效性、选择性、低的价格并且它们通常无毒性。特别是 当应用于生物制药学过程时这些特性被认为是优点。就象本领域的人 都知道的那样，直接结合靶分子的肽配体在某种程度上可从组合肽库 或生物学文库中鉴定出来。本发明是在离液序列高的(chaotropic)条 件下扫描肽配体。
本发明的这些亲和配体己经证明在变性条件下(如4 M尿素)可 特异地结合NP「Q和NP「。-融合蛋白(和其中突变的蛋白或包含突变的蛋白)
本领域已知的肽合成的方法适合于制备本发明的寡肽配体。优选 的肽配体是通过SPOT合成法、PIN合成法、茶袋法合成(teabag synthesis)、混合禾口分离法(mix and split method)(在Ruiwu Liu 等在Experimental Hematology 31 (2003) 11-30有描述)或PELICAN 方法(Joseph A. Buettner等在Int.丄Peptide Protein Res. 47 (1996)， 70-83有描述)合成的。 一些连接子在化学上能被应用于锚定第一个氨基酸。在本发明的一个优选的实施方案中，分别产生配体，然后固定 在色谱基质上。在本发明另一个优选的实施方案中肽配体是直接在色 谱基质上合成的。
寡肽配体具有高度特异性。在本发明范围内合成的寡肽的特点是具有在变性条件下有选择的结合Npro、 Npro衍生物和融合多肽的能力。在本发明的范围内这种寡肽配体直接结合本发明融合多肽具有自我蛋 白水解功能的部分。
在本发明的另一个优选的实施方案中寡肽配体的氨基酸序列是选自包含下歹廿序歹U的纟且VSIFEW、 AVSIEW丫、 AVSFIWY、 VSFIWYK、 ASRFWYA、 AF丫TWYA、 AFYRWYK、 AFY眼Y、 AFYRWYA、 AVSIFEWY、 AVSRW丫、 ASRFWY、 AFYRWYAA、 AFYRWY、 ASRFWYAA、 AFYRW丫AA和AF丫SWYAA.
在本发明范围内的寡肽配体的N末端可以是游离的或是封闭的， 封闭是可以被激活的，如通过乙酰化(ac(et)ylation)。
本发明最优选的一个实施方案是其中天然的序列为SEQ ID NO 5 中的CSFV Npro的衍生物(因这个突变的氨基酸序列有个在残基53到 57的"EDDIE"模体(而不是野生型的"RGDIR"))，这个突变体(和 包含这个模体的其它突变)在这里命名为"EDDIE"突变)用来和寡肽配 体结合，该寡肽配体选自包含ASRFWYA、 AFYTW丫A、 AFYRW丫K、 AFYRWY和AFYR-WAY的组。
因此，优选的亲和配体选自VSDDWY、 VSEDWY、 VSIDW丫、 VSYDWY、 VSVDW丫、 VSWDWY、 VSYDW丫、 VSFDWY、 VSDEWY、VSEEWY、VSIEWY、VS丫EW丫、 VSVEWY、 VSWEW丫、 VS丫EW丫、 VSFEWY、DDDDWY、 DDEDW丫、 DDIDWY、 DD丫DWY、 DDVDWY、 DDWDWY、 DDYDWY、 DDFDWY、 VSIFWE、 FSIFEW、 WSIFEW、 VSL隨、VSLIDW、 VSLIEW、 VSL匿、FSLEEW、 VSDLDW、 VSDLEW、 VSYIDW、 VSYIWE(所有的这些肽在pH5.5时结合NPr。)、 VSIDWY、 VSIEWY、 VSI-WWY、 VSYIIWY、 VS丫IW丫、 VSVIWY、 VSFIWY、 VSFIWE、 VSIFEW、 VSIFWE、 FSIFEW、 WSIFEW、 VSLIWY、 VSLIDW、 VSLIEW、 VSLIWE、 FSLIEW、 WSLIEW、 FSYFEW、 FSFYEW、WSFYEW、FSYIEW、WSYIEW (所有的这些肽在pH7.3时结合 Npro)、AFYTWYA、AFYRWYK、AFYRWY、AFYRWYA、AFFRWYA、AFGRWYA、AFHRWYA、AFAYA、AFLRWYA、AFMRWYA、AFNRWYA、AFPRWYA、AFQRWYA、AFRRWYA、AFSRWYA、AFTRWYA、AFVRWYA、AFYRWYA、AFYFWYA、AFYGWYA、AFYLWYA、AFYMWYA、AFYNWYA、AFYPWYA、AFYTWYA、AFYVWYA、AFYWWYA、AFYYWYA、AKWFRYA、VSRNWY、ASRAYA、ASRFWYA、FSRAYA、VFRAYA、VWRNWYA、VYRNWYA、VSRAWYA、VSRFWYA、VSRWWYA、VSRYWYA、VSRNFYA、VSRNYYA、VSRAFA、VSRNWWA(所有的这些肽对于在53到57位氨基酸残基处的EDDIE模体的Npra 突变具有特异的高亲和性)、Ac-AFYTWYAK、 Ac- AFYRWYKK、Ac-AFYRWYK、Ac-AFYRWYAK、Ac-AFFRWYAK、Ac-AFGRWYAK、Ac-AFHRWYAK、Ac-AFIRWYAK、AC-AFLRWYAK、AC-AFMRWYAK、AC-AFNRWYAK、AC-AFPRWYAK、AC-AFQRWYAK、AC-AFRRWYAK、AC-AFSRWYAK、AC-AFTRWYAK、AC-AFVRWYAK、AC-AFYRWYAK、AC-AFYFWYAK、AC-AFYGWYAK、AC-AFYLWYAK、AC-AFYMWYAK、AC-AFYNWYAK、AC-AFYPWYAK、AC-AFYTWYAK、AC-AFYVWYAK、AC-AFYWWYAK、AC-AFYYWYAK、AC-AKWFRYAK、AC-VSRNWYK、AC-ASRNWYAK、AC-ASRFWYAK、AC-FSRNWYAK、AC-VFRNWYAK、AC-VWRNWYAK、AC-VYRNWYAK、AC-VSRAWYAK、AC-VSRFWYAK、AC-VSRWWYAK、AC-VSRYWYAK、AC-VSRNFYAK、AC-VSRNYYAK、 AC-VSRNWFAK、 AC-VSRNWWAK、 YWKA、 AC-YWKAK、 YKYA、AC-YKYAK、YWRA、Ac-YWRAK、ARWY、Ac-ARWYK、YWRA、Ac-YWRAK (所有这些肽由于N端的乙酰化和C端的赖氨酸化提高了固定到底物的能力)。
本发明的亲和基质的一个特性是它特异地结合到瘟病毒(Npro)或Npro突变和Npro融合蛋白的自我蛋白酶Npro这些蛋白和本基质的结合是如此有效以至于这些蛋白通常也在非离液序列高的
(non-chaotropic)条件下结合。因此，本发明的基质是特异设计的可
以在离液序列高的或非离液序列高的条件下使固相和亲和配体有效的 结合瘟病毒(NP「。)或NP「Q突变和NPro融合蛋白两者的自我蛋白酶Np「。。
根据另一方面，本发明涉及从液相起始制剂中蛋白质的亲和结合 方法，其中所述的蛋白质在离液序列高的条件下与本发明的亲和基质 相互作用，借以所述蛋白质结合所述基质并且从所述的液相起始制剂 中分离。
术语"kosmotrope"(秩序制订者(order-maker))禾卩"离液剂 (chaotrope)"(秩序破坏者(disorder-maker))最初分别指得是 稳定或不稳定蛋白质和膜的溶质。后来分别指得是增加和减少水结构 的表观相关特性(apparently correlating property)。这些特性随环境 变化、定性方法和研究的水和层(solvation shell)而变化。对于 kosmotrope， 一个可选的术语是"补偿性溶质"，因为它们可以弥补 渗透性应激的细胞中高盐成分引起的不利效应，该高盐成分破坏了水 的天然氢键网络。氢键结合的程度和强度可能分别被溶质独自改变， 但是其中任何一个可能被或者已经被用作秩序形成的标准。然而，氢 键形成的质量是至关重要的。Kosmotropes的秩序效应可能与它们的 漫射旋转是相悖的，这就导致产生了比较低水合的chaotropes更广泛 的紊乱连接区域，这些区域是在周围有大量水的更多的紊乱。大多数 kosmotropes不引起大规模的水网状结构形成。
离子性的kosmotropes (或"抗离液剂(antichaotropes)"，以将它 们与非离子性kosmotropes区别)应该与非离子性kosmotropes区别对 待，主要是因为周围水分子的方向和极化排列。通常，离子行为符合 霍夫曼序列。低电荷密度的大的单电荷离子(例如SCN—、 H2P04 —、HS04—、 HC03—、 厂、C厂、N03—、 NH4+、 Cs+、 K+、 (NH2)
3C+(胍盐)或(CH3)4N^四甲基铵)离子；与水的相互作用比水一水相互
作用更弱，因此不干扰周围水的氢键结合)是离液剂；然而，高电荷 密度的小的或多电荷离子是kosmotropes (例如S042—、 HP042_、 Mg2+、 Ca2+、 Li+、 Na+、 H+、 OH—或HP042—，与水的相互作用 比水一水相互作用更强，因此可以破坏水一水氢键)。对于阳离子，单
电荷离液序列高的离子半径大于1.06A;对于阴离子，大于1.78A。因 此，在离子性kosmotropes附近的水分子之间的氢键比在离子性离液剂 附近更容易被破坏。对于卤化物离子F—、 Cl-、Br—或I—周围水氢键 的拉曼分光镜研究显示水氢键结合的总的程度会随着离子大小的增加 而增加；在HDO: D20中的IR研究显示这些卤化物离子周围的氢键 再定位缓慢，而且随着分子增大会越来越慢。溶质使其周围的一些氢 键增强(结构形成；例如kosmotropic阳离子将加强由内层水分子给 予的氢键)，同时破坏一些其它氢键不是不合理的(结构破坏；例如 kosmootropic阳离子将削弱内层水分子接受的氢键)。等同于其它一些 因子，带有净电荷的分子可以比没有带净电荷的分子更强的结合水分 子；就像两性离子和阳离子氨基酸之间的差异所显示的一样。
通过强离子水合到弱离子水合转变的强水—水相互作用可以将弱 的水合离子(离液剂，K+， Rb+， Cs+， Br"， 1"，胍盐+)"推至" 弱水合表面，在这里的离子—水水合作用强度大约与在大体积溶液(具 有在强的一边Na+作为边界和在弱的一边Cr作为边界)中的水一水相 互作用强度相同。两种重要的离液剂(胍盐和硫氰酸根离子)的中子 衍射研究发现其具有很弱的水合作用，这支持了其优选与蛋白质而不 是水发生相互作用的假设。不同于(In contract to) kosmotropes，由 于前者的低电荷密度，离子和非离子的离液剂的特性之间没有明显的差异。
借助盐保证生物大分子的稳定性要求kosmotropic阴离子和离液 序列高的阳离子的混合物。
离液剂可破坏水的氢键结合网络，因此高分子有更大的自由并且 促进蛋白质的延伸和变性。Kosmotropes是稳定化溶质，其可增加水 的有序性(比如多羟基醇、海藻糖、三甲胺氮氧化物、甘氨酸三甲 铵乙内酯、ectoine、脯氨酸或其它两性离子)；而离液剂可以生成较 弱的氢键结合，降低水的有序性，增加其表面张力并使大分子的结构 不稳定(比如高浓度的盐酸胍和尿素)。最近的研究表明尿素可以 弱化氢键结合和疏水相互作用，但是葡萄糖作为kosmotrope可以增强 这些特性。因此，在缺乏足够水的情况下，当尿素分子少于最佳水合 (每分子尿素结合约6—8摩尔水)的尿素自身氢键和蛋白质(显然涉
及肽连接)时，蛋白质会更加疏水并且因此更加容易与蛋白质其它位 点相互作用，并导致局部的脱水变性。胍盐是平面离子，可能在其边 缘周围形成弱的氢键，但是可能与蛋白质羧酸盐形成强的氢键离子对， 类似于通常的四元结构的精氨酸一羧酸盐连接。另外，胍盐具有相当 强的疏水表面，可能与类似的蛋白表面相互作用并导致蛋白质的变性。 两种变性剂可能通过疏水位点之间的滑行引起蛋白质肿胀和变性并且 随之插入氢结合水中完成变性。
通常溶质的kosmotropic/离液序列高的特性决定于水的物理特性， 经常是在必要的高浓度。应用诸如NMR或振动波谱可以发现结构程度 的变化。稳定蛋白质的溶质(kosmotropes)可增加氢键结合的程度(减 少质子和170自旋晶格驰豫的次数(Spin lattice relaxation times))， 然而NMR化学位移可能增加(表现为较弱的结合，例如两性离子 kosmotrope，三甲胺氮氧化物)或减少(表现为强的结合，例如多 羟基的kosmotrope，海藻糖)。海藻糖显示了在化学位移和驰豫时间 (relaxation time)的减少，而蛋白稳定剂(NH4J2S04)表现一个更 低程度的减少，而NaCL显示在化学转变上的减少时，蛋白去稳定剂 KSCN显示了驰豫时间的增加和化学转变的减少。振动波谱可能应用 5200 cm—1 (v2 + V3联合)附近的近IR波长，当氢键结合很强时，其转 变向波长更长的方向(较少的波数)。
最重要的kosmotropes之一是非还原糖a， a-海藻糖。或许受关 注的是海藻糖有一个比还原性糖更稳定的结构，因为其缺乏旋光改变， 或者其它通用的非还原二糖，蔗糖，其缺乏呋喃环。
因此，术语"离液序列高的条件"必须个别的考虑液体起始制剂 的的特性(例如溶液、悬液、乳状液、两或三相液体系统等)，尤 其是当制备中有超过一相的情况时，对于制剂的水相的特性要关注。 优选的本发明的离液序列高的条件是指那些相应的1_7M的尿素，尤 其是2—6M(优选在缓冲盐溶液中，比如8.0g NaCI， 0.2g KCI， 1.44g Na2HP04， 0.24g KH2P04 ad 1000 ml with A. dest.， pH 7.4 with HCI)。对应的离液序列高的条件可用上述的方法确定，也可应用霍夫 曼序列的理论。在起始液体中添加不同的物质时必须要分别的检测以获得优化的结合/非聚集的条件。例如还原剂的使用应该被优化，可用0.05至U 50 mM的二硫苏糖醇(DTT)，尤其是0.1至U 10 mM的二硫 苏糖醇(DTT)。而且，如上所述，去污剂的添加也可影响起始制备的离 液序列高的特性。
优选的，当结蛋白质结合在所述的基质上时，结合到基质的蛋白 质进一步被加工。这样的进一步加工可能优选的是化学衍生、络合、 降解等，尤其(在具有自身催化部分的融合蛋白的情况下)是自我蛋 白水解。这进一步的加工可能也优选在比起始体系中更低的离液序列 高的条件下进行。通常情况下，这些进一步的加工步骤以来于加工反 应的优化条件，其要与将亲和基质上的蛋白质结合到亲和配体上的亲 和力保持的需要之间平衡。
为了提供可溶的被结合和可选择的被加工的蛋白质来说，其必须 从载体上洗脱下来，如果融合蛋白包含自我蛋白水解部分和目的蛋白 部分，则至少融合蛋白的目的蛋白部分要洗脱下来。有许多方法可以 做到这点。在融合蛋白具有自身催化部分的情况下，通过自我蛋白水 解反应进行洗脱。在这种情况下，自我蛋白酶部分保留在亲和基质上。 在其它情况下，结合到基质上的蛋白质或所述的被加工的蛋白质保留 在基质上，优选的是在用较低离液序列高的洗脱缓冲液作为起始制备 的液相。优选的，至少融合蛋白的自我蛋白水解部分保留在基质上。
在另一方面，蛋白质能被保存在亲和基质上并作为一个固定部分， 例如固定化的酶。但是，由于是非共价结合，所以蛋白质对固体表 面的结合力并不是很强。如果固定蛋白质具有酶活性的话，在工业化 方法中，固定的酶是可用的，其可以提供活性(酶解的，催化的)表 面。
根据本发明的优选实施方案，蛋白质是异源的重组多肽，包含自 我蛋白水解部分和目的蛋白部分，目的蛋白部分在非离液序列高的条 件下可以被所述的自我蛋白水解部分切割，特别是融合蛋白其自我水 解部分是在变性条件下以包涵体形式表达的瘟病毒(NPpro)的自我蛋白酶 或(NPpro)突变和(NPpro)融合蛋白。
根据以上描述方法的优选实施方案，融合多肽包含CSFV的自我 蛋白酶(NPpro)的衍生物，其中除了至少一个半胱氨酸残基如上所述被取 代外，至少有一个碱性氨基酸被一个酸性氨基酸残基取代。
对于一个CSFV的自我蛋白酶NPro衍生物进一步优选的是，其中除了至少一个半胱氨酸残基如上所述被取代外，还有至少一个下列氨基酸被改变H5、 K16、 N35、 R53、 G54、 R57、 L143、 K145或 R150。在一个优选实施例的衍生物中，改变的氨基酸有谷氨酸(E) 取代53位精氨酸(R)、天冬氨酸(D)取代54位甘氨酸(G)、谷氨酸(E) 取代57位精氨酸(R)或谷氨酰氨(Q)取代143位亮氨酸(L)。
因此，在另一个方面，本发明涉及以上描述的方法的进一步优选， 其中融合多肽包含一个CSFV的自我蛋白酶NP「。的衍生物，该衍生物 中除了至少一个半胱氨酸残基如上所述被取代外，下列氨基酸被取代 谷氨酸(E)取代精氨酸(R) 53、天冬氨酸(D)取代甘氨酸(G) 54、谷氨 酸(E)取代精氨酸(R) 57或谷氨酰氨(Q)取代亮氨酸(L) 143。
在本发明另一个优选的实施方案中，CSFV的自我蛋白酶NP「。的 衍生物包含下列氨基酸序列。
SEQ ID NO 3:
(1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEV HPQSTLKLPHDRGEDDIETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKP GPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFEEVTKRIGRVTGSDGKLYH lYVEVDGEILLKQAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC-(168)。
因此，在另一方面，本发明也涉及上述方法，其中融合多肽包含 具有SEQ ID NO 3序列的CSFV的自我蛋白酶Npra的衍生物。
在另一方面，本发明涉及瘟病毒的天然发生Np「°的衍生物，其与 瘟病毒天然发生的Np「°比较，除了聚合性降低，更接近中性的等电点 (pl)进一歩增强了可溶性。
如上所述确定可溶性。
因此，本发明涉及一个CSFV的自我蛋白酶NPro的衍生物，其中，除了至少一个半胱氨酸残基如上所述被取代外，至少一个亲水氨基酸 残基取代一个疏水残基。
因此，在另一个方面，本发明也涉及以上描述的方法，其中融合 多肽包含一个CSFV的自我蛋白酶NT。的衍生物，在这个衍生物中除 了至少一个半胱氨酸残基如上所述被取代外，至少一个亲水氨基酸残 基取代一个疏水残基。
在本发明中，优选的是一个CSFV的自我蛋白酶Npro的衍生物， 其中除了至少一个半胱氨酸残基如上所述被取代外，而且至少下列氨基酸中的一个被取代V24、 A27、 L32、 G54、 L75、 A109、V114、 V121、 L143、 1155和F158。 一个优选的实施例是在衍生物中，下列氨基酸被苏氨酸(T)取代丙氨酸(A) 109、缬氨酸(V)114、异 亮氨酸(l) 155和苯丙氨酸(F)158。
因此，在另一方面，本发明优选的涉及以上所述的方法，其中融 合多肽包含CSFV的自我蛋白酶Npro的衍生物，其中除了至少一个半胱氨酸残基如上所述被取代外，下列氨基酸被苏氨酸(T)取代丙氨 酸(A) 109、缬氨酸(V)114、异亮氨酸(l) 155和苯丙氨酸(F)158。另 外，在本发明中更优选的CSFV的自我蛋白酶Npro的衍生物包含下列氨基酸序列。
SEQ ID NO 4:
(I)-MELNHFELL丫KTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVH PQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKP GPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKRIGRVTGSDGKLYH IYVEVDGEILLKLAKRGTPRTLKWTRNTTNCPLWVTSC-(168)。
因此，在另一方面，本发明更优选的涉及以上所述的方法，其中 融合多肽包含具有SEQ ID NO 4序列的CSFV的自我蛋白酶Npro的衍生物。
在本发明中，更优选的是一个CSFV的自我蛋白酶Npro的衍生物， 其中除了至少一个半胱氨酸残基如上所述被取代外，下列氨基酸也被 取代苏氨酸(T)取代丙氨酸(A) 109、缬氨酸(V)114、异亮氨酸(l) 155或苯丙氨酸(F)158，谷氨酸(E)取代精氨酸(R) 53，天冬氨酸(D) 取代甘氨酸(G)54，谷氨酸(E)取代精氨酸(R)57，谷氨酰氨(Q)取代亮 氨酸(L) 143。
因此，在另一方面，本发明更优选的涉及以上所述的方法，其中 融合多肽包含CSFV的自我蛋白酶Npro的衍生物，其中除了至少一个 半胱氨酸残基如上所述被取代外，下列氨基酸也被取代苏氨酸(T) 取代丙氨酸(A) 109、缬氨酸(V)114、异亮氨酸(l) 155和苯丙氨酸(F)158，谷氨酸(E)取代精氨酸(R)53，天冬氨酸(D)取代甘氨酸(G) 54， 谷氨酸(E)取代精氨酸(R) 57，谷氨酰氨(Q)取代亮氨酸(L) 143。
根据本发明，最优选的CSFV的自我蛋白酶NPpro的衍生物包含下
列氨基酸序列
SEQ ID NO 5:
(1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEV HPQSTLKLPHDRGEDDIETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGI丫IKP GPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKRIGRVTGSDGKLYH IYVEVDGEILLKQAKRGTPRTLKWTRNTTNCPLWVTSC-(168)。
因此，在另一个最优选的方面中，本发明也涉及以上所述的方法， 其中融合多肽包含具有SEQ ID NO 5序列的CSFV的自我蛋白酶Npra 的衍生物。
在另一个同样优选的方面中，本发明涉及如以上所述的异源蛋白 质生产方法，其中融合多肽包含具有SEQ ID NO 5序列的CSFV的自 我蛋白酶NP「o的衍生物，其中除了苏氨酸(T)取代天冬酰氨(N) 35外， 用丝氨酸(S)取代苏氨酸(T) 158。
在另一个优选的方面，本发明涉及以上所述的异源蛋白质的产生 方法，其中融合多肽包含具有SEQ. ID NO. 32序列的CSFV的自我蛋 白酶NP「Q的衍生物，该衍生物除了谷氨酸(E)取代丙氨酸(A)28外，也 有苯丙氨酸(F)取代丝氨酸(S) 71和组氨酸(H)取代精氨酸(R) 150。
优选的，在本发明的方法中，CSFV的自我蛋白酶N^的衍生物 融合的蛋白质包含至少三个胰岛素原的起始氨基酸，更优选的是胰岛 素原，进一步更优选的是人胰岛素原，最优选的是人重组胰岛素原， 这可以用来生产胰岛素原。
根据本发明优选，如果CSFV的自我蛋白酶N^的衍生物具有除 了至少一个半胱氨酸残基如上所述被取代外，有至少下列一个氨基酸 被取代精氨酸(R)53、甘氨酸(G)54、精氨酸(R)57、苏氨酸(T) 109, 114, 155， 158和亮氨酸(L) 143。本发明中CSFV的自我蛋白酶Npra 优选的衍生物具有除了至少一个半胱氨酸残基如上所述被取代外，有 下列氨基酸被取代谷氨酸(E)取代精氨酸(R)53，天冬氨酸(D)取代甘 氨酸(G)54，谷氨酸(E)取代精氨酸(R) 57，丝氨酸(S)取代苏氨酸109、114、 155、 158，谷氨酰氨(Q)或天冬酰氨(N)或天冬氨酸(D)或丝氨酸 (S)或组氨酸(H)取代亮氨酸(L) 143。
在另一个实施方案中，在非离液序列高的条件下，当本发明中的 融合蛋白结合在亲和基质上时，融合蛋白的自我蛋白水解部分应该是 失活的或者以一个未切割形式存在。因而，仅仅应用了其亲和特性而 不是其自我蛋白质水解特性；不过，CSFV的的N^的那些衍生物， 或者是它们自身或者是由于它们连接到融合蛋白的耙分子部分，在结 合到本发明的亲和基质上时，也没有表现出自我蛋白水解的活性；甚 至在非离液序列高的条件下(生理性的，"正常的")也没有，这些 衍生物也被表述为自我蛋白质水解部分。
优选的，自我蛋白质水解部分选自
SEQ ID NO 1: (Npr0)
<sequence>see original document page 22</sequence>
SEQ ID NO 2:
<sequence>see original document page 22</sequence>
SEQ ID NO 3 :
<sequence>see original document page 22</sequence>
SEQ ID NO 4:
<sequence>see original document page 22</sequence>GKLYHIYVEVDGEILLKLAKRGTPRTLKWTRNTTNCPLWVTSC-(168)
SEQ ID NO 5: ("EDDIE"-mutant)
(1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVH PQSTLKLPHDRGEDDIETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPG PVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKRIGRVTGSD GKLYHIYVEVDGEILLKQAKRGTPRTLKWTRNTTNCPLWVTSC-(168),
SEQ ID NO 6:
(I)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGTPSEVH PQSTLKLPHDRGEDDIETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGI丫IKPG PVY丫QDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKRIGRVTGSD GKLYHIYVEVDGEILLKQAKRGTPRTL隨TRNSTNCPLWVTSC-(168)，
SEQ ID NO 7:
O)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTEGRPLFGTPSEVH PQSTLKLPHDRGEDDIETTLRDLPRKGDCRFGNHLGPVSGIYIKPG PVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKRIGRVTGSD GKLYHIYVEVDGEILLKQAKRGTPHTLKWTRNSTNCPLWVTSC-(168),
SEQ ID 8:
(1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVH PQSTLKLPHDRGEDDIETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGI丫IKPG PVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDESQFEESTKRIGRVTGSD GKLYHIYVEVDG日LLKSAKRGTPRTLKWSRNSTNCPLWVTSC-(168)和
SEQ ID 9:
(1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGTPSEVH PQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKP GPVY丫QD丫TGPV丫HRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSD GKLYHIYVCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNSTNCPLWVTSC-(168).
在生理条件下，许多蛋白质高度倾向于聚合或者它们内在的生物
学活性就是聚集，比如朊蛋白或淀粉样肽的聚集原理。为了研究这
些在离液序列高的条件下必须是可溶性的蛋白质，可在极端pH (酸或
碱)的水溶液存在时，添加去污剂和有机溶剂，比如乙腈、乙醇、 异丙醇、丙醇或嘧啶等。高度倾向于聚集的淀粉样肽涉及大量疾病。 主要的淀粉样物质和包括蛋白或肽如下总结(影响中枢神经系统的条 件用斜体书写)
临床综合症 纤维组分阿尔茨海默病αβ肽(1-40、 1-41、 1-42、 1-43); 微管相关蛋白
海绵状脑病 朊病毒(全长或片段)帕金森病突触核蛋白(野生型或突变体)
Fronto-temporal dementias 微管相关蛋白(野生型或突变体)
Familial Danish dementiaADan肽
Familial British dementia ABri肽
Hereditary cerebral haemorrhage with 半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cystatin C)amyloidoses
肌萎縮性(脊髓)侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis) 过氧化物岐化酶(野生型或突变体)
齿状核红核苍白球丘脑下核萎縮 ( Dentatorubro-pallido-luysian atrophy) Atrophin 1(多聚谷氨酰胺链)
亨廷顿病 Huntingtin(多聚谷胺酰胺链)
小脑性共济失调(Cerebellar ataxias) Ataxins(多聚谷胺酰胺链)
Kennedy disease雄激素受体(多聚谷胺酰胺链)
Spino cerebellar ataxia 17 TATA盒结合蛋白(多聚谷胺酰胺链)
初级系统性淀粉样病变 Ig轻链(全长或片段)次级系统性淀粉样病变 血清淀粉样蛋白A(片段)家族性地中海热 血清淀粉样蛋白A(片段)
老年全身性淀粉样变性(Senile systemic amyloidosis)转甲状腺素蛋白(野生型或其片段)家族性淀粉样多神经病I (Familial amyloidotic polyneuropathy) 转甲状腺素蛋白(超过45个变体或其片段)血液透析相关淀粉样疾病 (Hemodialysis-related amyloidosis) β2-微球蛋白家族性淀粉样多神经病川(Familial amyloid polyneuropathy ) 阿朴脂蛋白A-1(片段)芬兰遗传系统性淀粉样变性(finnish凝胶蛋白(突变蛋白的片段) hereditary systemic amyloidosis)
ll型糖尿病 前胰岛淀粉样多肽(片段) 甲状腺髓样癌(Medullary carcinoma of前降钙素(全长或片段) the thyroid)
Atrial amyloidosis 心房禾ll钠因子 溶菌酶系统性淀粉样变性(Lysozyme溶菌酶(全长、突变) systemic amyloidosis)
胰岛素相关淀粉状蛋白(Insulin-related胰岛素(全长) amyloid)
人纤维蛋白原a链淀粉样病变 纤维蛋白原(a链变体及片段)
另一类蛋白质，膜蛋白涉及所谓的膜脂双层。生物膜的功能是作 为与外界相隔的界面、细胞之间的分割和细胞内腔隙的边界。因此， 生物膜涉及多种疾病，比如高胰岛素血症、肾性尿崩症、充血性心 衰、肝硬化、囊肿性纤维化、高和低血压、非水肿、癫痫症和白内障。
大约30℃已测序的基因编码膜蛋白。然而，仅仅30个膜蛋白的结构 在原子分辨率水平被解析，而可溶性蛋白质已经有3000个晶体结构， 这是因为通过去污剂溶解的膜蛋白很难产生适合于X衍射的三维晶 体。在蛋白质数据库中现存的67个膜蛋白结构中，52个是来源于细 菌蛋白，这说明细菌膜蛋白比植物或动物膜蛋白更容易表达、纯化和 结晶。目前的挑战是解决较高等生物膜蛋白的晶体结构并进行功能、 动力学和与配体相互作用的研究。对于多种疾病来说，膜蛋白是重要 的药靶。优选的，这些蛋白质("靶蛋白")以融合蛋白形式结合于 亲和基质上。如果靶蛋白以固定形式出现时，融合分子的自我蛋白质 水解部分应该是失活的或为非切割形式。因而，自我蛋白质水解部分 是作为一个标签在非离液序列高的条件下固定靶蛋白于亲和基质上。
朊病毒病，比如人不同的Creutzfeldt-Jakob疾病(vCJD)和羊瘙 痒病的特征就是在脑组织中有异常淀粉样蛋白PrP&沉积。通过PrPe 的构象改变，Prpse经由感染的人和动物的脑组织传播引起神经退化和 死亡。几年来，许多特异识别Prpe或可同时识别PrPe和Prpse的抗 体在基础研究中已经被发展起来。然而，PrPSe的特异抗体却没有出现。
膜蛋白(跨膜蛋白(内在蛋白))P —桶膜蛋白出现在革兰氏阴 性菌、线粒体和叶绿体的外膜中。P —桶膜蛋白的跨膜序列疏水性低于 a—螺旋膜蛋白，这可能是两类膜蛋白折叠和膜装配通路完全不同的主 要原因。 一些(3 —桶膜蛋白可以在体外自发再折叠成脂质双分子层。尽 管脂类和蛋白分子伴侣可以帮助其在合适的靶膜上组装，这些蛋白也 具有这种能力。其他重要的膜蛋白是超抗原。
本方法非常适合于(和非必须的被固定)那些高度倾向于聚集(在 生理条件下)并且不能应用标准的方法，尤其是亲和纯化技术进行纯 化的完整蛋白质。既然本发明中的亲和基质能够在离液序列高的条件 下结合蛋白质，则本方法就可能通过亲和色谱纯化这些困难的蛋白质， 尤其是那些与人类疾病相关的蛋白质。因此，在本发明的一个优选的 实施方案中，结合到本发明中的亲和基质上的蛋白质是或者包含在生 理条件下具有高度倾向于聚集的一个蛋白质或蛋白质一部分，尤其是
以下一些蛋白质，包括A(3肽、微管相关蛋白(Tau)朊蛋白、突触 核蛋白(a曙synuclein)、微管相关蛋白(Tau) 、 ADan肽、ABri肽、 半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cystatin C)、A卩肽、过氧化物歧化酶、Atrophin 1、 Huntingtin、 Ataxins、雄激素受体、TATA盒结合蛋白、lg轻链、 血清淀粉样蛋白A、转甲状腺素蛋白、(S2—微球蛋白、阿朴脂蛋白A-l、 凝胶蛋白、前胰岛淀粉样多肽、前降钙素、心房利钠因子、溶菌酶、 胰岛素、纤维蛋白原、其全长蛋白或特异片断、突变体、剪接体或多 聚谷氨酰胺链(polyQ-expansion)。
根据根本发明的一个优选实施方案，本方法可用来制备异源多肽， 也包括结合本发明中亲和基质的操作。优选的，这个方法进一步包含 所述多肽的纯化。
在本发明的一个优选实施方案中，提供是目的异源蛋白的亲和结 合的方法，其中所述的多肽以融合瘟病毒自我蛋白酶Npro。或其衍生物 的融合多肽表达，其中所述的融合多肽在离液序列高的条件下与一个 肽接触，这个肽在这种的条件下可以特异结合瘟病毒自我蛋白酶Npra 或其衍生物，并且其所述的肽是结合于固相上的。
本发明的亲和配体在离液序列高的条件下可以选择性的结合瘟病 毒(Npro)或Npra—突变体和前两者的NPro。融合多肽的自我蛋白酶Npro，并
且在改变为kosmotropic条件时或在kosmotropic条件下也可保持这种 特异性的结合。本发明的亲和配体的特性是蛋白质的结合特异性，尤 其是在离液序列高的条件下对Npro、 Npro突变体、融合多肽和高度 聚集蛋白质的结合。这个特性表明它们可以用于在离液序列高的条件 下要求蛋白质的特异结合的任何实验。另外，特异结合在改变为 kosmotropic条件时或在kosmotropic条件下也可保持。因此，以上描 述的肽可以用在要求结合变性目的分子和在再折叠和重建 (renaturisation)过程中保持结合的实验中。因此，以上所述的肽能 用于诸如变性条件下NPrc的捕获和纯化、肽亲和色谱、其它形式的 亲和纯化或涉及配体和蛋白质在离液序列高的条件下相互作用的亲和 分析。
例如高度倾向于聚集的蛋白质可融合NPro或NPro-突变体，然后 融合蛋白被纯化；或者将离液序列高的条件下表达的蛋白粗提物与固化了本发明中亲和配体的表面孵育。然后，离液序列高的条件逐渐被适合进一步反应的过程或分析的条件取代。例如
A. 离液序列高的条件被生理缓冲液取代，并且免疫反应通过抗体或抗体片断直接与蛋白质特定结构域反应而进行。这种策略可以使高 度倾向于聚集的蛋白质的免疫反应顺利进行。
B. 离液序列高的条件被取代并且进行一个特定的化学反应以修饰蛋白质结构。实施例包括氨基酸侧链的氧化、磷酸或硫酸基的加入、合成的天然形式聚合体的加入(例如PEGIyation)、肽链加入使蛋 白分子产生分支、对于在生理性溶液或缓冲液中不溶的蛋白质添加染 料。
C. 通过融合NPr。或NPr。-突变体，膜蛋白可以单分子重构。分子标签固化在针对这个融合蛋白的本发明的亲和配体，并且在4M尿素存 在时，也可以结合。随后通过去污剂和脂质双层除去尿素。当融合多肽结合至色谱系统中时，未结合的污染成分很容易被洗 脱下来。这些污染成分可能是，诸如宿主细胞多肽和核酸，其包裹于 或吸附于包涵体，溶解后混于多肽溶液中，也有一些是酶解破碎的细 胞中的残余成分。洗涤之后，融合多肽仍旧结合在柱子上，以便在纯化系统中进行如下步骤
融合多肽在离液序列高的的失活条件下结合基质。为了诱导再折叠，改变为kosmotropic条件。
在一个优选的实施方案中，融合多肽的再折叠是通过改变缓冲液 来实现从离液序列高的条件到kosmotropic条件的转变的。
缓冲液可以逐渐或瞬间改变到kosmotropic条件。在本发明一个 优选的实施方案中，离液序列高的缓冲液和kosmotropic缓冲液之间 的转变是通过缓冲体系的应用瞬时实施的。在本发明另一个同样优选 的实施方案中，缓冲液的转变是逐渐实施的。
如果缓冲液转变伴随一个温度调节器，则融合多肽在柱子上的结合和/或所述融合多肽的再折叠和切割可能很方便。例如这能通过一个冷/热温控套实现。因此，在一个优选的实施方案中，冷/热温控套就是温度调节器；更优选的，在使用前，缓冲液可以预热到所需温度。 通过这种方法就得到了如此的温度调节器。
在一个填料床中，随着条件的改变，融合多肽开始再折叠，并且具有自我蛋白水解功能的部分开始激活。结果导致融合目的蛋白的C 端多肽从被自我蛋白水解特异性的特定位点切割下来，从而产生了目的多肽的同源性N端。根据融合多肽再折叠所需的时间，kosmotropic缓冲液流动相的速率要被降低，或者当全部离液序列高的从填料床中 流出后就停止。当再折叠完成之后，kosmotropic缓冲液进一步洗涤， 使游离的目的多肽从填料床中流出来。融合多肽的N端自我蛋白水解 部分，以及未切割的融合多肽通过传统的方法洗脱，比如高盐浓度、 pH改变或NaOH以再生色谱填料。填料床要用可从吸附物上洗脱自我 蛋白酶的缓冲液洗涤以再生。这些缓冲液包含酸或碱或有机溶剂。在 用起始缓冲液/离液序列高的缓冲液重新平衡之后，填料床可以用于下 一个循环。
另一方面，在正确再折叠的时候，融合蛋白保持自我催化的失活 状态，例如采用在自我蛋白水解部分和融合蛋白的目的蛋白部分之 间引入合适的连接序列或者采用失活突变体来实现，自我蛋白酶突变 体没有或具有低的自我蛋白水解活性。例如，在这两个部分之间可以 引入三肽连接序列(氨基酸1、 2和3)，其在位置1和也是优选的在 位置2和3是碱性氨基酸((R、 K、 H)、酸性氨基酸(D、 E)、大的疏水氨基酸(V、 L、 I、 M)或芳香族氨基酸(F、 Y、 W)，以阻止自身蛋白
切割。失活自我蛋白酶衍生物的实施例是
Npro R53E, G54D, R57E, T59M, D92N' A109S, C112E， V114S V121K， C134E， C138E, L143N， 1155S， F158S
("MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVH PQSTLKLPHDRGEDDIETMLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKP GPVYYQNYTGPVYHRAPLEFFDESQFEESTKRIGRVTGSDGKLYH IYVEVDG日LLKNAKRGTPRTLKWSRNSTNCPLWVTSC-(168),
Npro R53E， G54D， R57E， P87L, A109S, C112E， V114S' V121N, T122A，C134E， C138E' L143E， M55S, F158S
(1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVH PQSTLKLPHDRGEDDIETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPG LVYYQD丫TGPVYHRAPLEFFDESQFEESTKRIGRNAGSDGKLYHI YVEVDGEILLKEAKRGTPRTLKWSRNSTNCPLWVTSC- (168)和
Npro R53E, G54D, R57E, A109S， C112E， V114S， V121N， C134E' C138E'L143Q, I155S, F158S
(1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVH PQSTLKLPHDRGEDDIETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGI丫IKPG PVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDESQFEESTKRIGRNTGSDGKL丫HI 丫VEVDGEILLKQAKRGTPRTLKWSRNSTNCPLWVTSC- (168)。
在这个实施方案中，目的蛋白以具有类似天然结构的被固定的功 能活性形式出现，当然没有不希望的聚集发生的风险。这种被固定或
被捕获的目的蛋白可能用来进行科学研究，比如免疫学的研究、内 源性研究、荧光分析或其它生理性的或药学上感兴趣的分子的相互作 用研究。
因为切割效率没有所需要的那样高，如果必要的话，可以将从再 生步骤中洗涤下来的未切割融合多肽二次上样于本发明的另一个色谱 循环体系中。
部分或完全再折叠的游离目的多肽非必需通过不同缓冲液的选择 来获得。在本发明的范围中，流出液中的目的多肽是部分或优选完全 再折叠。在本发明的一个实施方案中，融合多肽的自我蛋白水解活性 部分的再折叠可能是完全的，但是目的多肽仍有部分未再折叠。这种 情形的发生，例如当目的多肽具有非常复杂的构象，比如二聚体或三聚体，或者包含辅酶或辅因子。这种目的多肽的完全再折叠可能 要求特定的条件。因此，在这种情况下，再折叠的完成是一个多步骤 的过程，需要特殊的条件，比如质子强度和pH或再折叠过程中添加 的去污剂的完全去除。
只要保证融合多肽结合在柱子上，任何条件的改变均包含在本发 明的范围之中。
本发明也揭示了寡肽配体和以上描述的CSFV的N^衍生物在本 发明中的应用。本发明也涉及寡肽和以上描述的CSFV的NPro衍生物 在本发明中的应用。
根据另一方面，本发明涉及这里定义的用于亲和结合的亲和配体 的应用，尤其是瘟病毒(NPro)自我蛋白酶NPro或NPro-突变体和NPr。融 合蛋白的结合。
本发明的另一方面涉及结合瘟病毒(NPro)自我蛋白酶NPro或Npro-
突变体的亲和配体或亲和基质，以及NPr。融合蛋白在变性条件下以包
涵体形式表达，优选的上述的配体符合a)和b)的条件，尤其是以上 列出的这些寡肽特定的实施方案；或者结合瘟病毒(NPro)或NPro-突变体 自我蛋白酶NPro的亲和基质，并且NPro融合蛋白在变性条件下以包涵 体形式表达，优选的基质通常在这里被说明。
参考下列实施例进一步描述本发明，它们仅仅是例子并且没有限 制。特别是本实施例涉及本发明的优选实施方案。
具体实施例方式
实施例1一亲和色谱 1.1.1色谱设备
在实施例1中，色谱在AKTA 100 Explorer色谱系统(Amersham Biosciences)中进行。预制的肽亲和吸附剂装填在HR 5柱子中(5 mm j.d, Amersham Biosdences)。胶体积约1ml。
1.1.2寡肽配体的制备
在实施例1中应用的寡肽通过下述方法生产
固相肽合成在433A肽合成仪上进行(Applied Biosystems， Vienna, Austria),用1 —羟基一1H—苯丙三氮唑/N， N'— 二环己基碳二亚胺 (HOBt/DCC )作为Fmoc保护氨基酸(Bachem, Bubendorf, Switzerland)的激活。肽在4-羟甲基-苯氧基聚苯乙烯-1 %二乙烯基苯树 脂上合成(HMP树脂，Wang树脂)。侧链的保护基团是酪氨酸、丝氨 酸和苏氨酸的叔丁基(t-Bu)，谷氨酸和天冬氨酸的OtBu，赖氨酸和 色氨酸的叔丁氧羰基(Boc)，半胱氨酸、组氨酸、天冬酰氨和谷氨酰氨 的三苯甲游基(Trt)。为了第一个氨基酸的耦联，用4一二甲基氨基 吡啶(DMAP)作为催化剂。耦联第一个氨基酸之后，通过使用安息香酐 完成加帽步骤。用20^piperidin去除Fmoc基团的保护。侧链的去保 护和从树脂上切割是通过与含有95X三氟乙酸(TFA)、 2.5%水和2.5 ^三异丙基硅烷(TIS)的切割混合物反应而实现的。用二氯甲垸(DCM) 洗涤之后，粗制的肽通过重复的乙醚沉淀结合冻干法进行纯化。肽应 用P 3500泵(Amer- sham Biosciences, Uppsala, Sweden)在Luna 15 p C18(2) 250 x 21.2 mm柱子(Phenomenex， Torrence， CA, USA) 上通过RP-HPLC进一歩纯化，使用5-50%的乙腈水溶液(0.1% TFA) 线性梯度，速度为30 ml/min。纯度通过在HP 1090液体色层分析仪 (Hewlett Packard, USA)上进行分析型RP-HPLC来确定，应用Luna 3口 C18(2) 100 x 4.6 mm柱子(Phenomenex)，每分钟1%乙腈线性 梯度。同源性和同一性由基质辅助激光解吸附离子化一飞行时间质谱 (ThermoBioanalysis, Hempstead, UK沐确定。
1.1.3亲和基质的制备
在实施例1中使用的亲和基质通过下述方法制备
将10g Fractogel epoxy (M) (Merck, Darmstadt' Germany)与 50ml 1M的二氨基二丙胺(DADPA)室温反应48小时。反应之后，将胶 用50ml 10mM HCL洗涤，再用50ml水洗涤3次。将胶重悬在水中， 用0.1MNaOH调节pH值到7.0，再加入2g的琥珀酸酐。轻柔的摇荡 混匀30分钟之后，用10 M NaOH调节pH值到7.0，然后再加入2g 的琥珀酸酐。30分钟摇荡之后，用50 ml 0.1 M NaOH和50ml磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤胶，再用50ml的水和20%乙醇洗涤3次。真空干燥后，胶保存在4℃。
1.1.4羧基激活和肽固定
实施例1中的亲和基质按照如下方法激活
按照在1.1.3中描述的方法，用DADPA-SA spacer修饰1 g湿 Fractogel，并且用5ml乙腈洗涤2次。用3 ml 0.1 M琥珀酸醯亚氨一 三氯碳酸乙酯(Succinimidyl-trichloroethylcarbonate)和0.1 M三乙胺溶解在乙腈中3小时进行激活。随后用乙腈和1 mMHCL洗涤。肽 AFYRWYA溶解在PBS中，浓度为3 mg/ml。迅速将5ml肽溶液加入 胶中并反应24小时。肽VSFIWYK溶解在含0.1 M三乙胺的二甲基甲 酰胺中(DMF) 。 5ml肽溶液迅速加入胶中并反应24小时。耦联产量 通过耦联前后样品的RP-HPLC来确定。
肽固定在CIM-epoxy基质上。
肽溶解在含0.15 M NaCI， pH为10.0的100 mM Na2C03缓冲液中。CIM基片被厂家按照在一个筒里边，通过一个Pl泵(Amersham Biosciences)将肽溶液缓慢的泵入循环系统，室温循环48小时。耦联 产量通过耦联前后样品的RP-HPLC来确定。耦联之后，剩余的环氧基团可以用pH10.0的0.5 M乙醇胺作用48小时来封闭。
1.1.5融合多肽的表达
重组E. coli HMS174 (DE3)在10L的发酵罐中表达的融合多肽包含带有6个组氨酸标签的N端自我蛋白酶Npro和融合有GFPmut3.1从C端。融合多肽包含如下的氨基酸序列
1 MHHHHHHELN HFELLYKTSK QKPVGVEEPV YDTAGRPLFG NPSEVHPQST LKLPHDRGRG 60
61 DIRTTLRDLP RKGDCRSGNH LGPVSGIYIK PGPVYYQDYT GPVYHRAPLE FFDEAQFCEV 120
121 TKRIGRVTGS DGKLYHIYVC VDGCILLKLA KRGTPRTLKW IRNFTNCPLW VTSCSGTMRK 180
181 GEELFTGWP ILVELDGDVN GHKFSVSGEG EGDATYGKLT LKFICTTGKL PVPWPTLVTT 240
241 FGYGVQCFAR YPDHMKQHDF FKSAMPEGYV QERTIFFKDD GNYKTRAEVK FEGDTLVNRI 300
301 ELKGIDFKED GNILGHKLEY NYNSHNVYIM ADKQKNGIKV NFKIRHNIED GSVQLADHYQ 360
361 QNTPIGDGPV LLPDNHYLST QSALSKDPNE KRDHMVLLEF VTAAGITHGM DELYK
细菌宿主细胞，比如表达菌株采用常规微生物培养的方法进行 培养。菌株通常是在营养培养基中从一个单克隆开始生长，但是也可能用冷冻保存的细胞悬液(细胞库)。菌株通常要进行多级培养以获 得足够量的菌体来提供进一步的使用。
小规模培养可以在摇瓶中进行，通常使用复合培养基(比如LB 肉汤)。然而，也可以用规定的培养基(比如柠檬酸盐培养基)。 宿主菌用单克隆接种或者从冷冻培养的细胞悬液，小体积预培养的温 度对于随后表达的结果通常并不是关键的，所以按照惯例可以在一个相对高的温度下进行(例如30℃或37℃)。大体积培养(比如500ml)时，特别关键的是要保证好的通风条件(与内容物相比更大体积的摇 瓶，高速的摇荡)。如果希望以包涵体的形式表达，则通常在较高温度下进行(例如30℃或37℃)。 一些诱导体系特别适合产生包涵体 (例如采用trp， lac, tac或phoA启动子)。当细菌生长至对数生长 期后期(通常在摇瓶中的光密度为0.5到1.0)时，即可加入诱导剂 (例如吲哚丙烯酸、异丙基-P-D-硫代半乳糖苷—PTG)继续培养1-5小时。在这段时间内，大多数的Npro融合多肽以包涵体形式存在 于细菌细胞质中。随后收菌并进行进一步的操作。
大规模培养时，多级系统包含多级生物反应器(发酵罐)，优选 利用规定的营养培养基以改善本方法的工程控制。另外，在特定的营 养培养基(补料分批)中可能极大的增加菌体的数量和最终的产物量。 另外，本方法类似于摇瓶。例如发酵的初始阶段和主要阶段采用的 培养温度与在摇瓶中相似。初始的发酵从由一个单克隆或冷冻培养的 菌液经摇瓶扩增后得到的所谓发酵种子加入发酵罐后开始。在发酵中 必须保证好的通风和足够量的诱导剂浓度，尤其是在其主要发酵阶段。 然而，在一些情况下，发酵的诱导阶段明显要比在摇瓶中诱导更长。 最终的细胞再用于进一步的处理。
1.1.6包涵体分离
收菌之后，用2500 ml、pH为8.0的50mM Tris/HCI， 5 mM EDTA、 1 %Triton X-IOO的溶液重悬菌体(850g湿重)。冷冻的悬液的通过 APV-2000高压均质器3次(压强值设定为800巴)以破碎菌体。通 过均质器的悬液在冰上冷却并且再通过超声仪进一步破碎。将破碎后 的匀浆进行低速离心(JLA 10.500， 7500 rpm， 30 min)得到包含重组融 合多肽的包涵体。
1.1.7包涵体溶解
沉淀重悬在50 mM Tris/HCI， 5 mM EDTA， 1 。/。Triton X-100,pH 8.0的溶液中并离心。重复该步骤。水洗涤步骤之后，沉淀重悬在 水中。获得的包涵体储存在一2CTC中备用。包涵体在室温按照1: 5比 例用50 mM Tris/HCI， 10 M尿素，50 mM DTT， pH 7.3的溶液稀释。 离心去除不溶成分。得到浓度约15 mg/ml的多肽。多肽溶液用50 mM Tris/HCI， 100mMNaCI， 4M尿素，pH7.3的溶液稀释，使其浓度 为2 mg/ml。
1.1.8融合多肽结合色谱柱
0.5 ml多肽溶液上样于Fractogel- DADPA-SA-VSFIWYK (0.5 x 5cm)基质，该基质上不同肽的制备和耦联按照1.1.2和1.1.3中的描述 进行。柱子用50mMTris/HCI， 100mMNaCI， 4M尿素，pH 7.3的 溶液平衡，应用50 cm/h的线性流速。样品注入之后，流速增加到150 cm/h。
1.1.9未结合污染物的洗涤
未结合的组分用5倍柱体积的平衡缓冲液洗涤。然后用4.5柱体 积的再折叠缓冲液(0.5 M Tris/HCI,， 2 mM EDTA， 3 % glycerol, 5 mMDTT， pH7.3)进行洗涤。
1.1.10再折叠、切割和洗脱
从离液序列高的条件改变为cosmotropic条件之后，停止流动， 使融合多肽在色谱树脂上再折叠25小时。用有活性的自我蛋白酶切割 C端融合的GFPmut3.1。再用再折叠缓冲液以50cm/h的低速洗脱， 得到纯化的有天然的GFPmut3.1，并用荧光测定和SDS-PAGE鉴定。
1.1.11再生
用0.1 M NaOH以50cm/h的低速再生色谱树脂。
实施例2—亲和基质的制备
2.1通过耦联C端赖氨酸一碘乙酸酐衍生物与带有巯基的基质来 制备肽亲和基质。
300mg的N乙酰肽Ac-AFYRWYAK溶解在3ml含65u I 二异丙 基胺的二甲基甲酰胺(DMF)中。溶液在冰上冷却。然后，将130mg的 碘乙酸酐溶解在1.5 ml DMF中并且加入至肽溶液中。1分钟后，加入 1ml蚁酸终止反应。然后用水稀释溶液使DMF的终浓度为30。X。然 后溶液通过前述的准备好的RP-HPLC纯化。 一部分冻干并用质谱分 析。如上所述制备10g的Fractogel-DADPA。随后用PBS缓冲液洗涤 胶3次。然后将胶与溶解在PBS缓冲液终的10 mg/ml imminothiolan (IT)反应2小时。250 mg肽碘乙酸衍生物溶解在15 ml 20 mM MES (pH 6.0 ，含30% DMF)缓冲液中。然后将该溶液与胶反应3小 时。耦联产量用RP-HPLC分析耦联前后的样品来确定。胶上剩余的 巯基用1 mg/ml碘乙酸溶液作用2小时来封闭。这样制备的基质就是 Fractogel画DADPA-IT-AFYRWYAK。
2.2带有多聚赖氨酸和色氨酸的配体的亲和基质制备
用pH 11.0并含有150 mM氯化钠和10 mM三乙胺的20mM碳 酸钠耦联缓冲液洗涤10 g Fractogel epoxy 3次。100mg多聚(赖氨 酸，色氨酸)，按照4: 1(PolyKW, Sigma)溶解在10ml耦联缓冲液中
并且与胶反应48小时。耦联效率通过测定耦联前后多聚(赖氨酸，色 氨酸)溶液在280nm处的光吸收来确定。然后胶与0.5 M乙醇胺反应 以封闭剩余的环氧基团。这样制备的基质就是Fractogel-polyKW。
这里描述的方法可选择用Acti- gel B i)ltraflow 4环氧基来进行。 这样制备的基质就是Actigel-polyKW。
而且，这里描述的方法可以用环氧Sepharose6B来进行。这样制 备的基质就是Sepha- rose-polyKW。
实施例3:亲和色谱
3.1 NproEDDIE-6His包涵体提取物NproEDDIE-6His的制备
1 MELNHFEIiY KTSKQKPVGV EEPVYDTAGR PLFGNPSEVH PQSTLKLPHD RGEDDIETTL 60
61RDLPRKGDCR SGNHLGPVSG IYIKPGPVYY QDYTGPVYHR APLEFFDETQ E"EETTKRIGR 120
121 VTGSDGKLY HIYVEVDGEI LLKQAKRGTP RTLKWTRNTT NCPIjWVTSCS VDKLAAALEH 180
181 HHHH 185
溶解在50 mM Tris ， 100 mM NaCI ， 4 M尿素，10 mM a-monothioglycerol (MTG)， pH 7 . 3中的NproEDDIE-6His包涵体粗 提物上样于用50 mM Tris ， 100 mM NaCI， 4 M尿素，pH7 . 3的 缓冲液以25和150 cm/h的线性流速分别洗涤并预平衡好的 Fractogel-DADPA-IT-AFYRWYAK ( 0. 5 x 5 cm)中。应用体积为5ml， 蛋白浓度约为2 mg/ml的样品上样。以150 cm/h的线性流速，用5倍 柱体积的平衡缓冲液洗涤未结合组分，然后用10倍柱体积的50 mM Tris， 1 M NaCI， 8M尿素，pH 7.3的溶液在相同的流速下洗脱。 用10倍柱体积的0.2 M NaOH流过以再生柱子。宿主菌的成分用 SDS画PAGE确定。
3.2 NproEDDIE-6His包涵体提取物的纯化
溶解在50 mM Tris， 100 mM NaCI， 4 M尿素，10 mM MTG， pH 7.3溶液中的粗制NproEDDIE-6His包涵体提取物上样于用50 mM Tris, 100mMNaCI， 4M尿素，pH 7.3的缓冲液以25禾卩150 cm/h 的线性流速分别洗涤并预平衡好的Fracto- gel-poly-KW (0.5 x 5 cm) 中。应用体积为5ml，蛋白浓度约为2 mg/ml的样品上样。以150 cm/h 的线性流速，用5倍柱体积的平衡缓冲液洗涤未结合组分，然后用10 倍柱体积的50 mM Tris， 1 M NaCI， 8 M尿素，pH 7.3的溶液在相 同的流速下洗脱。用10倍柱体积的0.2 M NaOH进行再生柱子。宿主 菌的成分用SDS-PAGE确定。
3.3 NproEDDIE-6His包涵体提取物的纯化
从E. coli HMS 174 (DE3)细胞匀浆中获得的带有GFPmut3.1的 粗制NproEDDIE-6His包涵体提取物用以上描述的方法在 Fractogel-DADPA-IT-AF丫RWYAK中进行亲和色谱。流过和洗脱的样 品被收集起来并用SDS-PAGE进行靶蛋白和污染物的分析。
实施例4—检测系统。
这个检测系统是通过一个肽配体结合以共价键形式固定到膜上的 Npro-EDDIE来实现的Npro-EDDIE融合蛋白的通常检测体系。融合蛋 白结合在包含肽的膜上，而且融合蛋白可以通过其内在特性来检测， 例如GFP自发荧光、针对融合蛋白的抗体、融合蛋白的结合特性。 这种膜(本发明亲和基质的优选实施例)特别适合结合那些在水溶液 中不溶或溶解性差并且很难检测的蛋白质。优选尿素溶解本发明中的 蛋白质。
在这种情况下，本发明的自我蛋白酶被用到，其活性可能被连接 子、失活突变体或失活缓冲液或缓冲液成分(在需要的时候及时加入 的成分)所抑制。
固化有肽AFR*WAY (*表示20个蛋白原氨基酸中的每一个)的 膜与浓度为1 mg/ml的粗制6xHis-NproEDDIE-GFPmut3.1包涵体提 取物在50mMTris， 300 mM NaCI， 4M尿素，12.5 mM 二硫苏糖醇 (DTT)， pH7.3的溶液中孵育1小时。5分钟后用孵育缓冲液洗涤，条 件改变为1 M Tris， 0.25 M蔗糖，2 mM EDTA， 10 mM DTT， pH 7.3，这可以使融合GFPmut3.1再折叠。肽的GFP荧光用Typhoon 扫描器检测(Amersham Biosciences),激发光谱为488 nm，发射光谱 为520 nm，采用了 315、 350或400 V的不同光电倍增器电压。
实施例5—应用生物素标记抗Npro肽的检测系统
这个检测系统是通过将具有生物素标记的肽结合膜上的 Npro-EDDIE融合蛋白来实现的Npro-EDDIE融合蛋白的一般检测体 系。这种检测是通过辣根过氧化酶标记的抗生蛋白链菌素来进行的。
包含Npro-EDDIE和C端融合多肽的融合蛋白在大肠杆菌中的过 表达是通过直接标记Npro-EDDIE的肽来检测的。发酵产生的大肠杆 菌细胞匀浆溶解在10 M尿素中。匀浆点样在硝酸纤维素膜上。然后将 膜晾干并用溶解在磷酸缓冲液中的3 。/。溶菌酶封闭1小时。然后将膜 与含有10|jg/ml的生物素标记AFYRWYAK的溶液孵育1小时。再将 溶解在含1 M氯化钠的PBS缓冲液中的辣根过氧化酶标记的抗生蛋白 链菌素加入并反应15分钟，随后用孵育缓冲液洗涤3次，接着用Super Signal West Pico化学发光检测系统(Pierce, Rockford， IL，美国)和 Lumilmager (Boehringer, Mannheim,德国)进行检观(J。
实施例6—Npro突变体融合蛋白的制备 10ml
上述的从IBs中提取的融合蛋白6HisNPro-SGT-GFPmut .3.1溶
液，
上述的从IBs中提取的6HisNPro溶液，和 上述的从旧s中提取的6HisNPro-EDDIE溶液，
被上样到
-Fractogel-DADPA-SA-VSIFEW柱子，
-Fractogel-DADPA-SA-AVSIEWY柱子，
-Fractogel-DADPA-SA画AVSFIWY柱子,和
-Fractogel-DADPA-SA-VSFIWYK柱子，
每一个用50 mM Tris， 100mMNaCI， 4M尿素，pH 7.3的缓冲 液预平衡。上样之后，用15倍柱体积平衡缓冲液洗涤柱子。用加入 500 mM NaCI的平衡缓冲液进行洗脱。在色谱中收集的组分用 SDS-PAGE检观"用BSA和溶菌酶作为对照蛋白质。
包涵体的制备
表达包含N端自我蛋白酶Npro和6His-tag和GFPmut3.1 (见以 上的1.1.5)的的融合蛋白的重组E. coli HMS 174 (DE3)在一个10L的 发酵罐中培养。收菌之后，菌体(湿重850 g)重悬在2500 ml的50 mM Tris， 5mMEDTA， I %Triton X-100， pH 8.0的溶液中。冷冻的悬
液的通过APV-2000高压均质器3次(压强值设定为800巴)以破碎 菌体。通过均质器的悬液在冰上冷却并且再通过超声仪进一步破碎。 将破碎后的匀浆进行低速离心(JLA 10.500， 7500 rpm， 30 min)得到包 含重组融合蛋白的包涵体。沉淀重悬在50 mM Tris， 5mM EDTA， 1% Triton X-100， pH 8.0的溶液中并离心。重复该步骤。水洗漆之后，沉 淀重悬在水中。8.9 %干重的580ml包涵体悬液储存在一20。C备用。 用50 mM Tris， 10 M尿素，50 mM DTT， pH 7.3的缓冲液将包涵体 悬液在室温按照1: 5稀释。通过离心去除不溶物。获得15mg/ml的 浓度。蛋白溶液用50 mM Tris， 100 mM NaCI， 4 M尿素，pH 7.3 的缓冲液稀释至浓度为约2 mg/ml。
权利要求
1.包含固相的亲和基质和包含连到该固相的肽键的亲和配体，其中包含肽键的亲和配体是选自下列配体的组a)包含式X1X2X3X4的肽，其中X1到X4是氨基酸残基，并且至少X1到X4中的两个是W、Y或F；b)包含式X5X6X7X8的肽，其中X5到X8是氨基酸残基，并且至少X5到X8中的一个是W，并且至少X5到X8中的一个是E或D；且c)聚氨基酸，由R、K、E、D组成中的氨基酸单体和由Y、F、W组成的氨基酸单体组成该聚氨基酸，优选poly-KY、poly-KF、poly-KW、poly-RY、poly-RF、poly-RW、poly-EY、poly-DY、poly-EF、poly-EW、poly-DF和poly-DW，上述配体的附加条件为a)和b)的肽的氨基酸残基数最长为35个并且c)的聚氨基酸残基数最短为20个。
2. 根据权利要求1的亲和基质，其中a)和b)的肽长度为5到12， 特别是6到8个氨基酸残基。
3. 根据权利要求1或2的亲和基质，其中该亲和配体被化学修饰， 特别是被乙酰化、酯化、酰胺化、氧化、减少或提供连接子分子。
4. 根据权利要求1到3的亲和基质，其中固相是选自色谱材料， 特别是基于纤维素、琼脂糖、丙烯酰胺、聚(苯乙烯一二乙烯苯)或 乙烯乙二醇甲基丙烯酸酯共聚物、微滴定板、硝酸纤维膜、微芯片、 玻璃板、或金属包被的支持物。
5. 根据权利要求1到4的亲和基质，其亲和配体选自VSDDWY、 VSEDWY、 VSIDWY、 VSYDWY、 VSVDWY、 VSWDW丫、 VS丫DW丫、 VSFDWY、 VSDEW丫、 VSEEWY、 VSIEWY、 VS丫EWY、 VSVEWY、 VSWEWY、 VSYEWY、 VSFEWY、 DDDDWY、 DDEDW丫、 DDIDWY、 DDYDWY、 DDVDWY、 DDWDWY、 DDYDWY、 DDFDWY、 VSIFWE、 FSIFEW、 WSIFEW、 VSLIWY、 VSLIDW、 VSLIEW、 VSL匿、 FSLEEW、 VSDLDW、 VSDLEW、 VSYIDW、 VSYIWE、 VSIDWY、 VSIEWY、 VSIWWY、 VSIIWY、 VSYIWY、 VSV'iWY、 VSFiWY、 VSF匿、VSIFEW、 VSIFWE、 FSIFEW、 WSIFEW、 VSL隨、 VSLIDW、 VSLIEW、 VSLIWE、 FSLIEW、 WSLIEW、 FSYFEW、 FSFYEW、 WSFYEW、 FS丫IEW、 WSYIEW、 AFYTWYA、 AFYRWYK、 AFYRWY、 AFYR- WYA、 AFFRWYA、 AFGRW丫A、 AFHRWYA、 AFIRWYA、 AFLRW丫A、 AFMRWYA、 AFNRW丫A、 AFPRWYA、 AFQRWYA、 AFRRWYA、 AFSRWYA、 AFTRWYA、 AFVRWYA、 AF丫RWYA、 AFYFW丫A、 AFYGW丫A、 AFYLWYA、 AFYMWYA、 AFY隨YA、 AFYPWYA、 AF丫TW丫A、 AF丫VWYA、 AFYWWYA、 AFYYWYA、 AKWFRYA、 VSR隨Y、 ASRNWYA、 ASRFWYA、 FSR隨YA、 VFR隨YA、 VWRNWYA、 VYR隨YA、 VSRAWYA、 VSRFWYA、 VSRWW丫A、 VSR丫WYA、 VSRNFYA、 VSRNYYA、 VSRNWFA、 VSRNWWA、 Ac- AFYTWYAK 、 Ac-AFYRWYKK 、 AC-AF丫RWYK 、 AC-AF丫RW丫AK 、 AC-AFFRWYAK 、 AC-AFGRW丫AK、 Ac-AFHRWYAK、 AC-AFIRW丫AK、 AC-AFLRW丫AK、AC-AFMRW丫AK AC-AFQRWYAK AC-AFTRWYAK AC-AFYFWYAK AC-AFYMWYAK AC-AF丫TWYAK AC-AFYYWYAK AC-ASRNWYAK AC-VFRNWYAK AC-VSRAWYAK AC-VSR丫WYAKAC-AFNRWYAK AC-AFRRWYAK AC-AFVRWYAK AC-AFYGW丫AK AC-AFYNW丫AK AC-AF丫VWYAK AC-AKWFR丫AK AC-ASRFWYAK AC-VWRNWYAK AC-VSRFWYAKAC-AFPRW丫AK 、AC-AFSRW丫AK 、AC-AF丫RWYAK 、AC-AFYLW丫AK 、AC画AFYPWYAK 、AC画AF丫WWYAK 、AC-VSR隨YK 、AC-FSRNWYAK 、AC-VYRNW丫AK 、AC-VSRWWYAK 、AC國VSRNYYAK 、 AC- YWKAK、 YKYA、、 AC-VSRNFYAK 、 AC-VSRNWFAK、 AC國VSRNWWAK、 YWKA、 Ac-YKYAK、 丫WRA、 Ac-YWRAK、 ARW丫、 Ac-ARWYK、 丫WRA和 Ac-YWRAK 。
6. 根据权利要求1到5的任何一个的亲和基质，其中亲和配体是 共价连接到固相上的。
7. 用于从液体起始制剂亲和结合蛋白的方法，其中所述的蛋白在 离液序列高的条件下与权利要求1到6的任一项所述的亲和基质接触， 借以所述的蛋白结合到所述的基质并且从所述的液体起始制剂中分离。
8. 根据权利要求7的方法，其中结合到基质的所述的蛋白当结合 到所述的基质时被进一步处理。
9. 根据权利要求7或8的方法，其结合到基质的所述的蛋白或所 述的处理后的蛋白从基质中洗脱，优选通过应用具有较低的离液序列 高的洗脱缓冲液作为液体起始制剂。
10. 根据权利要求7到9任一项的方法，其中所述的蛋白质是异 源的重组多肽，其包含自我蛋白水解部分和由目的蛋白组成的部分， 目的蛋白部分在非离液序列高的条件下被所述的自我蛋白水解部分剪 切，特别地，其中自我水解部分是瘟病毒(NP「o)的自我蛋白酶或NP「。突 变和Np「°融合蛋白的融合蛋白在变性条件下以包涵体形式表达。
11. 根据权利要求10的方法，其中所述的自我蛋白水解部分是选自SEQ ID NO 1:GKLYHIYVCVDGCIIiLKLAKRGTPRTIjKWIRNPrNCPLWVTSC- (168 ) seq id no 2:gklyh工yvevdgei:l:lklakrgtprt:lkw工rnftncp;lwvtsc- (168) SEQ ID NO 3 -(l) me:lnhfe:l:lyktskqkpvgveepvydtagrp:lfgnpsevhpqst:lkIiPhdrgedd工ett:lrDliPRKGDCRSGNHIjGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPIjEFFDEAQFEEVTKRIGRVTGSD GKIiYHIYVEVDGEIIjIjKQAKRGTPRTIiKWIRNFTNCPIiWVTSC- (168), SEQ ID NO 45(1) MELNHFEIiljYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPIiFGNPSEVHPQSTiLKIiPHDRGRGDIRTTIjRGKLYHIYVEVDGEIIjIjKIiAKRGTPRTIjKWTRNTTNCPIiWVTSC- (168 ), SEQ ID NO 5:GKLYHIYVEVDGEIliKQAKRGTPRTIiKWTRNTTNCPLWVTSC- ( 168) SEQ ID NO 6:GKLYHIYVEVDGEII^KQAKRGTPRTiLKWTRNSTNCPIjWVTSC- (168) SEQ ID NO 7:gklyhiyvevdgeikl罪krgtpht:lkwtrnstncp:lwvtsc- ( 168 ) SEQ ID 8:GKIiYHIYVEVDGEIKLKSAKRGTPRTLKWSRNSTNCPIiWVTSC- (168) and SEQ ID 9:gklyhiyvcvdgci;l:lk;lakrgtprt:lkwirnstncp:lwvtsc- ( i68).
12.根据权利要求7到10任一项的方法，其中所述的蛋白是或包 含在生理条件下具有高度聚集倾向的蛋白或蛋白部分，特别是选自以下蛋白Ap肽、微管相关蛋白朊蛋白、突触核蛋白、微管相关蛋白、ADan肽、ABri肽、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、A(3肽、过氧化物歧化酶、 Atrophin 1、 Huntingtin、 Ataxins、雄激素受体、TATA盒结合蛋白、 lg轻链、血清淀粉样蛋白A、转甲状腺素蛋白、转甲状腺素蛋白、(32 一微球蛋白、阿朴脂蛋白A-I、凝胶蛋白、前胰岛淀粉样多肽、前降钙 素、心房利钠因子、溶菌酶、胰岛素、纤维蛋白原、其全长蛋白或特 异片段、突变体、剪接体或多聚谷氨酰胺链。
13. 制备异源多肽的方法，包括实施根据权利要求7的结合。
14. 根据权利要求13的方法，其中进一步包含所述的多肽的纯化。
15. 亲和结合目的异源肽的方法，其中所述的多肽表达为瘟病毒 自我蛋白酶Npra或其衍生物的融合多肽，并且其中所述融合多肽在离 液序列高的条件下与在这样条件下特异结合瘟病毒自我蛋白酶Np「°或 其衍生物的肽接触，并且其中所述的肽结合到固相上。
16. 权利要求1到6中的任一项限定的亲和配体用于亲和纯化的 用途，特别是用于结合瘟病毒(Np「。)的自我蛋白酶NP「。或NT突变体 和N^融合蛋白。
17. 用于结合瘟病毒(Np「°)的自我蛋白酶NP「Q或NP「o突变体和 NP「。融合蛋白的亲和配体，优选的配体如权利要求1 a)和b) 、2和5 中所限定的。
18. 用于结合瘟病毒(Np「°)的自我蛋白酶NP「。或NP「。突变体和 NP「。融合蛋白的亲和基质，优选的是权利要求1到6的基质。
全文摘要
本申请公开了包括固相和包括耦合到固相上的肽键的亲和配体的亲和基质，其中该包括肽键的亲和配体选自下述配体a)包含式X₁X₂X₃X₄的肽，其中X₁到X₄是氨基酸残基，并且至少X₁到X₄中的两个是W、Y或F；b)包含式X₅X₆X₇X₈的肽，其中X₅到X₈是氨基酸残基，并且至少X₅到X₈中的一个是W，并且至少X₅到X₈中的一个是E或D；且c)聚氨基酸，由R、K、E、D组成中的氨基酸单体和由Y、F、W组成的氨基酸单体组成该聚氨基酸，优选poly-KY、poly-KF、poly-KW、poly-RY、poly-RF、poly-RW、poly-EY、poly-DY、poly-EF、poly-EW、poly-DF和poly-DW，上述配体的附加条件为a)和b)的肽的氨基酸残基数最长为35个并且c)的聚氨基酸残基数最短为20个。
文档编号C07K17/06GK101208357SQ200680014329
公开日2008年6月25日 申请日期2006年4月25日 优先权日2005年4月26日
发明者A·荣格鲍尔, B·奥尔, C·啊赫谬勒, M·赛弗特, P·威时纳, R·哈恩, W·卡尔 申请人:桑多斯股份公司;奥地利勃林格殷格翰有限公司