新型半胱氨酸减少的疏水蛋白融合蛋白、其生产和用途的制作方法

专利名称：：新型半胱氨酸减少的疏水蛋白融合蛋白、其生产和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及新型疏水蛋白融合蛋白、其生产和用途。
背景技术：
：疏7K蛋白是约ioo个氨基酸的小蛋白质，其为丝状真菌的特征蛋白质并且不存在于其它生物体中。最近，在天蓝色链霉菌(5^印to/^CMCO^'CO/or)中发现疏水蛋白类蛋白质，称为"Chaplins"，而且其同样具有高表面活性的性质。Chaplins可以在7K-空气界面组装形成淀粉样原纤维(Classen等人2003GenesDev1714-1726;Elliot等人2003，GenesDev.17，1727-1740)。疏水蛋白以不溶于水的形式分布于多种真菌结构，例如气生菌丝、孢子、子实体的表面。疏水蛋白的基因从子嚢菌(ascomycetes)、半知菌(deuteromycetes)和担子菌(basidiomycetes)中分离而来。某些真菌含有多于一个的疏水蛋白基因，例如普通裂褶菌(5Wi/zop/^〃MWCo附/w朋e)、灰盖鬼伞(C0/7/7VlW5""Viere"51)、构巢曲霉(ylspe/^7/M51fMV/M/flW51)。明显地，多种疏7片蛋白涉及真菌发育的不同阶段。推测所述疏水蛋白负责不同的功能(vanWetter等人，2000，Mol.Microbiol.，36,201-210;Kershaw等人1998，FungalGenet.Biol,1998，23，18-33)。除了为产生气生菌丝减少水的表面张力以外，疏水蛋白的生物学功能还有使孢子疏水化(W6sten等人1999，Curr.Biol.，19,1985-88;Bell等人1992，GenesDev.,6，2382-2394)。此外，疏水蛋白^皮用于内村地衣子实体中的气体通道，并且作为真菌病原体辨别植物表面系统的成分(Lugones等人1999，Mycol.Res.，103，635-640;Hamer和Talbot,1998，Curr.OpinionMicrobiol.,巻1，693-697)。互补实验证明单个类型中的疏水蛋白在某种程度上可以在功能上相互取代。先前公开的疏水蛋白只能以中等产量制备，并且用常用的蛋白质化学纯化和分离方法纯化，目前在遗传方法的辅助下供应更大量的疏水蛋白的尝试尚未成功。发明主题本发明的主题是提供新的疏水蛋白及其生产方法，所述方法使能够经济地生产疏水蛋白并在多种
技术领域：
使用。发明详述本发明涉及通用结构式(I)的多肽其中X可以是任何20种天然存在的氨基酸(苯丙氨酸Phe、亮氨酸Leu、丝氨酸Ser、酪氨酸Tyr、半胱氨酸Cys、色氨酸Trp、脯氨酸Pro、组氨酸His、谷氨酰胺Gln、精氨酸Arg、异亮氨酸Ile、甲疏氨酸Met、苏氨酸Thr、天冬酰胺Asn、赖氨酸Lys、缬氨酸Val、丙氨酸Ala、天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu、甘氨酸Gly)，且在X的指数表示氨基酸数，指数n和m是0-500之间，优选在15-300之间的数，p是1-250之间，优选在1-100之间的数，并且C是半胱氨酸、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、曱硫氨酸或苏氨酸，其中至少4个由C指定的残基为半胱氨酸，附带条件是缩写为Xn或Xm或Xp的肽序列的至少一个是长度至少为20个氨基酸的非天然连接于疏水蛋白的肽序列，该多肽在包被玻璃表面之后使接触角改变至少20。。C1到<:8指定的#^酸优选为半胱氨酸，但是它们也可能被其它相似的大氨基酸(优选丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或甘氨酸)所代替。然而，C1到<:8位置的至少4个、优选至少5个、尤其优选至少6个且尤其至少7个应该包含半胱氨酸。本发明蛋白质中的半胱氨酸可以是还原形式或彼此形成二疏键。尤其优选形成分子内C-C桥，特别是具有至少1个、优选2个、尤其优选3个和特别尤其优选4个分子内二石克键的那些。当如上所述用相似的大氨基酸代替半胱氨酸时，那些彼此之间形成分子内二硫键的C位置的配对最好也被代替。如果在以X指定的位置也使用半胱氨酸、丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸或苏氨酸，可以相应改变通式中单个半胱氨酸位点的数量。尤其有利的多肽是那些具有通式(II)的多肽Xn-C、X3-25-G2國Xo-2画C3誦X5-50-C4誦X2-35画G5-X2-l5-C6曙Xo-2画C7-X3-35-C!8-Xm(II)其中X可以是任何20种天然存在的氨基酸(苯丙氨酸Phe、亮氨酸Leu、丝氨酸Ser、酪氨酸Tyr、半胱氨酸Cys、色氨酸Trp、脯氨酸Pro、组氨酸His、谷氨酰胺Gln、精氨酸Arg、异亮氨酸Ile、甲硫氨酸Met、苏氨酸Thr、天冬酰胺Asn、赖氨酸Lys、缬氨酸Val、丙氨酸Ala、天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu、甘氨酸Gly)，在X的指数表示氨基酸数，指数n和m是2-300之间的数，并且C是半胱氨酸、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸或苏氨酸，其中至少4个由C指定的残基为半胱氨酸，附带条件是缩写为Xn或Xm的肽序列的至少一个是长度至少为35个氨基酸的非天然连接疏水蛋白的肽序列，该多肽在包被玻璃表面之后使接触角改变至少20。。特别尤其有利的是那些具有通式(III)的多肽Xn隱C、X5-9-C2國C3画Xii-39画C4-X2-23-C5画X5-9-C6-C7-X6—l8曙C8-Xm(HI)其中X可以是任何20种天然存在的氨基酸(苯丙氨酸Phe、亮氨酸Leu、丝氨酸Ser、酪氨酸Tyr、半胱氨酸Cys、色氨酸Trp、脯氨酸Pro、组氨酸His、谷氨酰胺Gln、精氨酸Arg、异亮氨酸Ile、甲硫氨酸Met、苏氨酸Thr、天冬酰胺Asn、赖氨酸Lys、缬氨酸Val、丙氨酸Ala、天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu、甘氨酸Gly)，在X的指数表示氨基酸数，指数n和m是0-200之间的数，并且C是半胱氨酸、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸或苏氨酸，其中至少6个由C指定的残基为半胱氨酸，附带条件是缩写为Xn或Xm的肽序列的至少一个是长度至少为40个氨基酸的非天然连接疏水蛋白的肽序列，该多肽在包被玻璃表面之后使接触角改变至少20°。所述本发明的优选实施方案是具有通用结构式(I)、(II)或(III)的多肽，该结构式包含至少一种I类疏水蛋白，优选至少一个dewA、rodA、hypA、hypB、sc3、basfl、basf2疏水蛋白，或其部分或4汙生物。下文的序列表对所述疏水蛋白进行了结构表征。也可能将多个(优选2个或3个)相同或不同结构的疏水蛋白彼此连接，并且连接于并非天然连接疏水蛋白的相应适宜多肽序列上。本发明尤其优选的实施方案是具有SEQIDNO:20、22、24所示的多肽序列的新蛋白质，及其编码核酸序列，具体是SEQIDNO:19、21、23中定义的序列。尤其优选的实施方案还包括由SEQIDNO:20、22或24所示多肽序列起始，通过取代、插入或缺失至少1个至多10个、优选5个、更优选所有氨基酸的5%而产生的蛋白质，所述蛋白质仍然具有起始蛋白质至少50%的生物特性。此处蛋白质的生物学特性指上述接触角的改变，如实施例10中所述。本发明的蛋白质中至少一个缩写为Xn或Xm或Xp位置的多肽序列不是天然连接于疏水蛋白的，该多肽序列包含至少20个、优选至少35个、尤其优选至少50个、和尤其至少100个氨基酸(也指下文中的融合配偶体)。这是为了说明所述蛋白质可能由自然条件下并不以这种形式共同存在的疏水蛋白部分和融合配偶体部分组成。融合配偶体部分可能选自多种蛋白质。对于多数融合配偶体，其也可能连接于一个疏水蛋白部分，例如连接于所述疏水蛋白部分的氨基端(Xn)和羧基端(Xm)或中间(Xp)。然而，也可能例如两个融合配偶体连接于本发明蛋白质的单个位置(Xn或Xm)。尤其优选的融合配偶体部分是能够使本发明的蛋白质包被玻璃表面的多肽序列，并且其引起蛋白质处理的玻璃表面对去污剂处理具有抗性，这在实验部分(实施例10)中有详细描述(例如1%SDS在80。C处理10分钟)。尤其合适的融合配偶体部分是在微生物、特别是大肠杆菌(五.co/,)或枯草芽孢杆菌(5fl"7/船s"6rifc)中天然存在的多肽。此类融合配偶体的实例是序列yaad(SEQIDNO:15和16)、yaae(SEQIDNO:17和18)和硫氧还蛋白。同样高度适用的是所述序列的片段或衍生物，其只含有所述序列的部分、优选10-卯％、尤其优选25-75%。此处优选C末端缺失体，例如仅由N-末端前75个氨基酸组成的yaad片段，或其中与所述序列相比有单个氨基酸或核苷酸改变的序列。例如可以在yaad和yaae序列的C-末端附加另外的氨基酸，特别是2个另外的氨基酸(优选精氨酸、丝氨酸)。也可能优选与天然存在的序列相比，插入到yaae序列中另外的氨基酸，例如SEQIDNO:17和18中的第2号氨基酸(甘氨酸)。其它融合配偶体、尤其是那些在通式(I)的Xp位置的融合配偶体的实例是酶活性结构域、抗微生物结构域、作为受体兴奋剂/拮抗剂的多肽序列、色素、调味剂和芳香剂、金属结合结构域。还可能产生与多种活性化合物和效应子共价结合的特异性偶联位点。例如，在该环中插入另外的赖氨酸，以便在技术人员所公知的异双功能(heterobifunctional)连接的帮助下，通过伯氨基基团(primaryaminogroup)使活性化合物和效应子特异的连接于疏水蛋白分子主链。此外，也可能在两个融合配偶体的连结点处插入另外的氨基酸，导致在核酸水平上新产生或钝化限制性内切酶识别位点。本发明蛋白质的多肽序列还可能通过例如糖基化、乙酰化或通过其它与例如戊二醛化学交联的方法加以修饰。本发明蛋白质的一个特性是当用所述蛋白质包^L4面时改变表面的性质。实验上是通过在以蛋白质包被表面之前和之后测量水滴接触角，并确定两次测量的差别来确定所述表面性质的改变。用于测量接触角的精确实验条件在实施例10中的实验部分说明。在这些条件下，本发明的蛋白质具有^f吏接触角至少增大20。，优选25°，尤其优选30。的性质。目前已知的疏水蛋白中，疏水蛋白部分的极性和非极性氨基酸的位置是保守的，导致特征性的疏水性图谱。根据生物物理学性质和疏水性的差异将目前已知的疏水蛋白分为两类，I类和II类(Wessels等人1994，Ann.Rev.Phytopathol"32,413-437)。I类疏水蛋白组装的膜高度不可溶(即使是升高温度在1%的十二烷基硫酸钠(SDS)中也是如此)，并且只能通过浓缩的三氟乙酸(TFA)或甲酸而再次解离。与之相反，II类疏水蛋白的组装形式较不稳定。它们通过60%浓度的乙醇或1。/。SDS(在室温)即可再次解离。这种对于溶剂和去污剂的高稳定性是疏水蛋白的特殊性质，并且其将本发明的多肽包被与表面上多种蛋白质形成的"非特异性"蛋白质包被区分开来。氨基酸序列的比较揭示，在II类疏水蛋白中C3和C4半胱氨酸之间区域的长度明显小于I类疏水蛋白。此外，II类疏水蛋白比I类疏水蛋白具有更多带电荷的氨基酸。本发明还涉及生产本发明蛋白质的方法。这些多肽可以通过肽合成的成熟技术化学制备，例如通过Merrifield固相合成。然而，尤其有用的是基因工程方法，其中两个分别编码融合配偶体和疏水蛋白部分的核酸序列(优选DNA序列)组合，从而通过组合核酸序列的基因表达在宿主生物体中产生所希望的蛋白质。此处用于所述构建方法的合适的宿主生物体(生产生物体)可以是原核生物(包括古细菌C4rc/mefl))或真核生物，尤其是细菌包括嗜盐菌(/^&6a"^7Vi)和甲烷3求菌(附e^flwococc/)，真菌，昆虫细胞，植物细胞和哺乳动物细胞，尤其优选大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌08"7/附黑曲霉(/1^^^///船"&^)、巴斯德毕赤酵母(尸Zc/^Vi/7aston》、假单胞菌属物种(jRseM^附owass/;ec.)、乳酸杆菌(/flcto^fl"7//)、多形汉逊酵母(/Tff"se/iw/fl/7(/j;附o/7^")、里氏木霉(7Wc/^&r附fl"ew/)、SF9(或相关细胞)等等。本发明还涉及表达构建体的用途，所述表达构建体包含在调控核^列的遗传控制下编码本发明的多肽的核酸序列，并且本发明也涉及包含至少一个所述表达构建体的载体。本发明的构建体优选包含特定编码序列的5，上游启动子和3，下游终止序列，适用的情况下还包含各自与所述编码序列有效连接的其他常用调控元件。"有效连接，，指启动子、编码序列、终止子和适用情况下的其他调控元件的有序排列，从而使每个调控元件能够实现其表达编码序列所需的功能。有效连接序列的实例为寻靶序列以及增强子、多腺苷酸化信号等等。其它调控元件包含可选标记、扩增信号、复制起点等等。合适的调控元件在例如Goeddel，基因表达技术酶学方法185，学术出版社，SanDiego，CA(19卯)中描述。除这些调控序列以外，可能在实际结构基因的上游仍存在对这些序列的天然调控，且适用的情况下可对之进行遗传修饰，从而通过关闭天然调控而增强基因表达。优选的核酸构建体最好还包含一个或多个与启动子功能性连接的上述增强子序列，以增强核酸序列的表达。其他有利的序列，例如其他的调控元件或终止子也可插入到DNA序列的3，末端。在构建体中可能具有本发明的核酸的一个或多个拷贝。如果为篩选所述构建体所需，构建体也可能包含其他标记，例如抗生素抗性或营养缺陷型补偿基因。例如，对本发明方法有利的调控序列存在于启动子如cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq-T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaPBAD)SP6、入-PR启动子或启动子中，这些启动子最好在革兰氏阴性菌中使用。其他有利的调控序列存在于例如革兰氏阳性启动子amy和SP02，和酵母或真菌启动子ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH。也可以^^用人工启动子进行调控。为了在宿主生物体中表达，最好将核酸构建体插入例如能够使基因在宿主细胞中最优表达的载体(例如质粒或噬菌体)。除质粒和噬菌体以外，载体也指技术人员所公知的任何其它载体，即例如病毒(如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒)，转座子，IS元件，噬粒，粘粒，和线性或环状DNA，以及农杆菌系统。这些载体可以在宿主生物体中自主复制或随染色体复制。这些载体构成本发明的其他实施方案。合适质粒的实例是大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHSl、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III"3-Bl、tgtll或pBdCl，链霉菌(5^印to附yc^)的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361，杆菌的pUB110、pC194或pBD214，棒状杆菌(Co/y"Wfl"e/7"w)的pSA77或pAJ667，真菌的pALSl、pIL2或pBB116,酵母中的2a、pAG-l、YEp6、YEpl3或pEMBLYe23,或植物中的pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。所述质粒是可能质粒的一小部分选择。其它质粒是技术人员所公知的，并且能够在例如《克隆栽体》(Eds.PouwelsP.H.等人Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985，ISBN0444卯4018)中找到。为了表达其它存在的基因，核酸构建体也最好包含3，-末端和/或5，-末端调控序列来增强表达，根据宿主生物和基因或所选基因对所述序列加以选择，以达到最佳表达。这些调控序列旨在使基因和蛋白质特异性表达。这意味着取决于宿主生物体，例如基因只在诱导后表达或过表达，或者立即表达和/或过表达。在这点上，优选引入的调控序列或因子具有正面影响，并且增强其被引入的基因的表达。因此，使用强转录信号(例如启动子和/或增强子)在转录水平增强调控元件是有利的。然而，除此之外，也可能通过例如改良mRNA稳定性来增强翻译。在载体的另一实施方案中，包含本发明核酸构建体或本发明核酸的载体也可能以线性DNA的形式被有利地引入微生物中，并通过异源或同源重组的方式整合到宿主生物体的基因组中。此线性DNA可能由线性化载体(例如质粒)组成，或仅由本发明的核酸构建体或核酸组成。为实现生物中异源基因的最佳表达，最好根据生物中特定的密码子使用来修饰核酸序列。通过计算机分析所研究生物的其他已知基因，可以容易的确定密码子的使用。将合适的启动子与合适的编码核苷酸序列和终止信号或多聚腺苦酸信号融合来制备表达盒。为此使用的常规重组和克隆技术见于例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆实验室操作手册，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1989)和T.J.Silhavy，M丄.Berman和L.W.Enquist，基因融合实验，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1984)以及在Ausubel，F.M.等人，现代分子生物学实验方法，GreenePublishingAssoc.和WileyInterscience(1987)中的描述。为了在合适宿主生物体中表达，重组核酸构建体或基因构建体最好插入宿主特异的载体，该栽体能够使基因在宿主中最优表达。载体是技术人员所熟知的，并且能够在例如"克隆载体"(PouwelsP.H.等人，编辑，Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985)中找到。可以利用本发明的载体制备例如由至少一个本发明的载体转化的重组微生物，并且其可用于生产本发明所用多肽。最好将本发明的上述重组构建体引入合适的宿主系统并表达之。在此情况下，优选使用技术人员熟知的常用克隆和转染方法，例如共沉淀、原生质体融合、电穿孔法、逆转录病毒转染等等，以引起所述核酸在特定表达系统中表达。合适的系统在例如现代分子生物学实验方法，F.Ausubel等人编辑，WileyInterscience,NewYork1997，或Sambrook等人，分子克隆实验室操作手册，第二版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989中描述。也可以根据本发明制备同源重组微生物。为此，可制备包含至少一部分本发明的基因或编码序列的载体，适用的情况下，所述编码序列中引入至少一个氨基酸缺失、氨基酸添加或氨基酸取代，从而修饰(例如功能性破坏)本发明的序列(敲除载体)。引入的序列可为例如相关微生物的同源物，或由哺乳动物、酵母或昆虫来源衍生而来。或者，可设计用于同源重组的载体，从而使内源性基因在同源重组时发生突变或其他改变，但仍然编码功能性蛋白质(例如改变上游调控区域由此改变内源性蛋白质的表达)。本发明所用的基因的改变的部分位于同源重组载体中。适合同源重组的载体的构建在例如Thomas,K.R.和Capecchi,M.R.(1987)Cell51:503中描述。适合本发明的核酸或核酸构建体的重组宿主生物体原则上是任何原核或真核生物体。最好使用微生物例如细菌、真菌或酵母作为宿主生物体。革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌，优选肠杆菌科(五rtten^flCte/7'flCefle)、假单月包菌科(i^e"flfo/wo"flw/ffceae)、才艮瘤菌科(i/w'zo6/ttceae)、链霉菌科(/5Vr印to附^cCflcefle)或诺卡氏菌科(iVocfl/^flfce"e)的细菌，特别优选4吏用的细菌为埃希氏菌属(^^&r/c/h'a)、假单胞菌属、链酶菌属、诺卡氏菌属、伯克霍尔德菌属CB"rA:/^/^Wfl)、沙门氏菌属(^Vz/mo/ie//")、农杆菌属或红球菌属(i/ltfrf(7C^CC"S)的细菌。依据宿主生物体，按技术人员公知的方法生长或培养本发明方法中使用的生物体。卩敝生物通常生长在液体培养基中，其中包含碳源(通常以糖的形式)、氮源(通常以有机氮源的形式例如酵母提取物，或例如硫酸铵等盐类)、微量元素(例如铁盐、锰盐和镁盐)、以及适用情况下的维生素，生长温度在0'C到100。C之间，优选10'C到60。C，同时供以氧气。此种情况培养液pH值可以维持或不维持在固定值，即在培养过程中可以调节或不调节。可以进行分批发酵、半分批发酵或连续培养。可以在发酵最初开始时引入营养素，或以半连续或连续方式进行随后加料。可以通过实施例中所描述的方法从生物体中分离酶，或者在反应中使用酶粗提物。可以用重组方法制备本发明的多肽或其功能生物活性片段，通过培养产生多肽的微生物，适用的情况下诱导表达多肽，而且从培养液中分离所述多肽。如果需要，也可以通过此种方法在工业上生产多肽。可以通过已知方法培养和发酵重组孩史生物。例如细菌可以在20-40。C,pH6-9条件下，在TB培养基或LB培养基中繁殖。合适的培养条件例如在T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆:实验室操作手册，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1989)中详细描述。如果本发明使用的多肽并非分泌至培养基中，那么就要破坏细胞，通过已知的多肽分离方法从溶菌产物中获得产品。正如所预期的，通过高频超声、高压(例如在弗氏压碎器中)、渗透、使用去污剂、水解酶或有机溶剂、匀浆等手段，或通过所列出的方法中的多个的组合来破坏细胞。多肽可以用已知的层析方法纯化，例如分子筛层析(凝胶过滤法)，例如Q琼脂糖层析，离子交换层析和疏水层析，以及使用其它常用方法，例如超滤、结晶、盐析、透析和非变性凝胶电泳。合适的方法在例如Cooper，F.G"BiochemischeArbeitsmethoden，[originaltitle:Thetoolsofbiochemistry]，VerlagWalterdeGruyter,Berlin,NewYorkorinScopes,R"蛋白质纯化，SpringerVerlag,NewYork,Heidelberg,Berlin中描述。最好通过使用载体系统或寡核苦酸分离重组蛋白质，所述寡核苷酸以特定核苷酸序列延伸cDNA,从而编码例如有利于纯化的改变的多肽或融合蛋白质。此类合适的修饰的实例是作为锚起作用的"标签"，例如六组氨酸锚的修饰、或能够作为抗原被抗体识别的表位(例如在Harlow，E.和Lane，D"1988，抗体:实验室操作手册，ColdSpringHarbor(N.Y.)Press中描述)。其它合适的标签是例如HA、钩调节蛋白-BD、GST、MBD;几丁质-BD、链霉亲和素-BD-avi-标签、Flag-标签、T7等等。这些锚可以用于将蛋白质附着在固体载体上，例如聚合体基质，例如其可填充到层析柱中，或用于微孔滴定板或其它载体。相应的纯化方法可以从商品化的亲和标签供应商那里获得。在显微镜下可以观察到许多疏水蛋白包被的真菌表面(孢子、子实体、菌丝)，其特征结构称为"小棒(rodlets)"。类似的厚度约为10nm的小棒也可以在疏水蛋白包被的亲水表面检测到(例如玻璃、云母等)(W6sten等人，1993，PlantCell,5，1567-1574)。由于包祐束面的疏水蛋白的特殊性质(例如抗去污剂，例如1%浓度的SDS溶液)，这些蛋白质具有用于许多工业应用的极大潜能。多种专利文件涉及此类应用的实例，此处引用其中关于疏水蛋白的应用。(^动f"说'^我#请乂<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>疏水蛋白(尤其是I类疏水蛋白)在工业上的利用至今还不成功，这是由于缺乏有效的生产和纯化的方法。先前描述的从天然来源(孢子、真菌菌丝等等)提取的方法只能产生亳克级的材料量(例如WO96/41882)。通过重组生产多种生物生产者的途径同样被证明非常复杂，并且不是很令人满意。本发明的疏水蛋白，其融合形式(即与融合配偶体部分一起)以及分离的形式两者都具有所希望的疏水蛋白性质。因此本发明的蛋白质既可能直接用作融合蛋白，又可以在剪切后除去融合配偶体而用作"纯化的，，疏水蛋白。当需要移除融合配偶体时，推荐在融合蛋白中疏水蛋白部分和融合配偶体部分之间掺入潜在的切割位点(蛋白酶的特定识别位点)。尤其合适的切割位点包括通过生物信息学工具能够确定的那些否则将既不存在于疏水蛋白部分也不存在于融合配偶体部分中的肽序列。尤其有用的是例如在甲硫氨酸的BrCN切割或蛋白酶介导的Xa因子切割、肠激酶切割、凝血酶、TEV切割(烟草蚀紋病毒蛋白酶)。实施例实施例1克隆yaad-His6/yaaE-His6的准备工作用寡核苷酸Hal570和Hal571(Hal572/Hal573)进行多聚酶链式反应。所使用的模板DNA是枯草芽孢杆菌基因组DNA,获得的PCR片段包含枯草芽孢杆菌yaaD/yaaE基因的编码序列，和在其末端的Ncol和BgIII限制性切割位点。纯化PCR片段，并用限制性内切酶NcoI和BglII切割。此DNA片段用作插入片段克隆到QiagenpQE60载体中，该栽体预先用限制性内切酶Ncol和BglII线性化。这样获得的载体pQE60YAAD#2/pQE60YaaE#5可以分别用于表达由YAAD::HIS6和YAAE::HIS6组成的蛋白质。Hal570:gcgcgcccatggctcaaacaggtactgaHal571:gcagatctccagccgcgttcttgcatacHal572:ggccatgggattaacaataggtgtactaggHal573:gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc实施例2ayaad-疏水蛋白DewA-His6的克隆用寡核苷酸KaM416和KaM417进行多聚酶链式反应。所使用的模板DNA是构巢霉菌基因组DNA。获得的PCR片段包含疏水蛋白基因dewA的编码序列，和N-末端因子Xa蛋白酶切割位点。纯化PCR片段，并用限制性内切酶BamHI切割。此DNA片段用作插入片段克隆到载体pQE60YAAD#2中，该载体预先用限制性内切酶BglII线性化。这才羊获得的载体#508用于表达由YAAD::Xa::dewA::HIS6组成的融合蛋白质。KaM416:GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGCKaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC实施例2b具有抗菌性质的嵌合体融合蛋白质的制备为了引入具有抗菌性质的肽序列，遵循以下克隆策略从我们的Yaad-DewA表达质粒"pQE60YaaddewAHis"开始，通过半胱氨酸3和4之间的融合PCR将抗菌肽序列插入。图2la)PCR区域YaaD-dewA到半胱氨酸3，包括T7novispirin突出端模板pQE60YaaDdewA6His引物引物l(AATTAACCATGGCTCAAACA)20-mer引物2AGGTTTTTGCAGCAAGCGATCGAGCCGA)74-merPCR条件55。C，1118bplb)PCR区域novispirin突出端到6His/终止模板pQE60YaaDdewA6His引物引物3引物4(CTAATTAAGCTTAGTGATGGT)21-merPCR条件54°C，306bp2)退火PCR将PCRla和lb产物50pmol组合，用Pfu-聚合酶进行退火PCR(95°Cl分钟，72'C5分钟-10个循环)随后加入外部引物(outsideprimers),进行通常的35个循环的PCR。引物引物l(AATTAACCATGGCTCAAACA)20-mer引物4(CTAATTAAGCTTAGTGATGGT)21-merPCR条件53。C，1404bp3)连接载体pQE60YaaDdewA6His用Ncol/Kpnl消化制备凝胶，分离3428bp的条带插入片段退火PCR的产物用NcoI/Kpnl消化制备凝胶，分离1350bp的条带4)转化XL10/TG10化学感受态细胞(chemocomp.cells)图3pQE60YaaDdewACys3GIO譜ispirinla)PCR区域YaaD國dewA到Cys3,包括GIOnovispirin突出端模板pQE60YaaDdewA6His引物引物l(AATTAACCATGGCTCAAACA)20-mer引物5AGGTTTTTGCAGCAAGCGATCGAGCCGA)74-merPCR条件55。C,1118bplb)PCR区域novispirin突出端到6His/终止图4模板pQE60YaaDdewA6His引物引物6引物4(CTAATTAAGCTTAGTGATGGT)21-merPCR条件54°C，306bp-mer2)退火PCR将PCRla和lb产物50pmol组合，用Pfu-聚合酶进行退火PCR(95°Cl分钟，72°C5分钟-10个循环)随后加入外部引物，进行普通的35个循环的PCR。引物引物l(AATTAACCATGGCTCAAACA)20mer引物4(CTAATTAAGCTTAGTGATGGT)21-merPCR条件53°C,1404bp3)连接载体pQE60YaaDdewA6His用Ncol/Kpnl消化制备凝胶，分离3428bp的条带插入片段退火PCR的产物用Ncol/Kpnl消化制备凝胶，分离1350bp的条带4)转化XL10/TG10化学感受态细胞图5蛋白质的纯化和评估与实施例8-10类似。可以测定抗菌性质抗菌作用的测定在6-孔微量滴定板中进行，该滴定板填充相应生长所需的琼脂(LB、YM)。然后将平板培养过夜。在测定中使用的微生物如下枯草芽孢杆菌巨大芽胞杆菌大肠杆菌XU必/weMi膝黄微球菌(M"/owoccm51/"teWS)泛菌(i^f"^a)库特菌(ZTm,幼/fl)假单胞菌属物种肉軒菌(Ow朋6a"e"'w附)白色念珠菌(CVm&V/fffl幼Zcfl"s)尖孑包錄刀菌(F"5W'"/fiftx^5/ww附)除肉杆菌和假单胞菌以外的所有微生物有机体(MO)都在20mlYPD培养基中培养过夜(30。C，200rpm);肉杆菌在TSB中培养，假单胞菌在CASO中培养。将20pl特定细菌或真菌的悬浮液应用于微孔滴定板的每个孔，并轻轻铺平。使悬浮液在某种程度上浸入琼脂。然后将疏水蛋白溶液(同样20jtl)应用于孔的中央；在30。C培养箱中培养琼脂平板。在过夜培养后已经可以〗见测到最初结果通过应用点周围没有生长物来揭示抗菌作用，而缺乏抗菌作用的孔被完全长满。实施例3yaad疏水蛋白RodA-His6的克隆质粒#513的克隆类似于质粒#508,使用寡核苷酸KaM434和KaM435。KaM434:GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGCKaM435:CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG实施例4yaad疏7JC蛋白BASF1-His6的克隆质粒然07的克隆类似于质粒弁508，使用寡核苷酸KaM417和KaM418。使用的模板DNA是人工合成的DNA序列，疏水蛋白BASF1(见附件)。KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGCKaM418:CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG实施例5yaad疏水蛋白BASF2-His6的克隆质粒#506的克隆类似于质粒#508，使用寡核普酸KaM417和KaM418。使用的模板DNA是人工合成的DNA序列，疏水蛋白BASF2(见附件)。KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGCKaM418:CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG实施例6yaad疏水蛋白SC3-His6的克隆质粒#526的克隆类似于质粒#508，使用寡核苷酸KaM464和KaM465。使用的模板DNA是Schyz叩hyllumcommunecDNA(见附件)。KaM464:CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGCKaM465:GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT实施例7yaad疏水蛋白DewA-His6重组大肠杆菌菌抹的发酵将含有表达yaad疏水蛋白DewA-His6的大肠杆菌菌林的3mlLB液体培养基接种于15mlGreiner管中。于37。C在振荡器上以200rpm培养8小时。将1ml此预培养液各自接种于2个1升有塞子锥形瓶中的250mlLB培养基中(+100ng/ml氨千青霉素)，在37。C以180rpm振荡培养9小时。将0.5升的预培养液(相对于水测量OD6。。肌1:10)接种于13.5升的LB培养基(+100jig/ml氨苄青霉素)中，置于20升的发酵罐。在OD6()。nm约3.5时添加140ml的100mMIPTG。3小时以后，将发酵罐冷却到10°C，并通过离心除去发酵液。细胞沉淀用于进一步的纯化。实施例8重组疏水蛋白融合蛋白的纯化(带有C-末端His6标签的疏水蛋白融合蛋白的纯化)100g的细胞沉淀(100-500mg的疏水蛋白)用50mMpH7.5的磷酸钠緩冲液补足到总体积为200ml，并将沉淀重悬。悬浮液用T25型高速分散器Ultraturrax(Janke和Kunkel;IKA-Labortechnik)处理10分钟，随后为了降解核酸，再与500单位benzonase核酸酶(Merck，Darmstadt;orderNo.1.01697.0001)在室温培育1小时。在破坏细胞之前使用玻璃萃取柱(Pl)进行过滤。为了破坏细胞和剪断剩余的基因组DNA，用勻浆器在1500巴进行2次处理(MicrofluidizerM画110EH;MicrofluidicsCorp.)。4夸匀浆液离心(SorvallRC-5B，GSA转子，250ml离心筒，60分钟，4°C，12000rpm，23000g)，上清置于冰上，用100mlpH7.5的磷酸钠緩冲液重悬沉淀。重复3次离心和重悬，在第3次重复时磷酸钠緩冲液中包含1%SDS。重悬以后，将溶液搅拌l小时，然后进行最终离心(SorvallRC-5B，GSA转子，250ml离心筒，60分钟，4°C，12000rpm，23000g)。根据SDS-PAGE分析，疏水蛋白存在于最终离心的上清液部分(图1)。实验显示疏水蛋白可以以包涵体的形式存在于相应大肠杆菌中。50ml含疏水蛋白的上清液应用于以50mMpH8.0的Tris-Cl緩冲液平衡的50ml镍-琼脂糖高性能17-5268-02柱(Amersham)。用50mMpH8.0的Tris-Cl緩冲液洗柱，随后用包含200mM咪唑的50mMpH8.0的Tris-Cl緩冲液洗脱疏水蛋白。为了去除咪唑，溶液用50mMpH8.0的Tris-Cl緩冲液透析。图1描述本发明疏水蛋白的纯化1泳道应用于镍-琼脂糖柱的溶液(l:lO稀释)2泳道流出液=清洗步骤的洗脱液3-5泳道洗脱级分的OD280峰图1中本发明的疏水蛋白分子量约为53kD。一些较小条带代表所述疏水蛋白的降解产物。实施例9具有疏水蛋白表面的包#7评估疏水蛋白或疏水蛋白融合蛋白的包被性质优选以玻璃和聚四氟乙烯(Teflon)分别作为亲水和疏水表面的模型进行评估。标准包被实验玻璃-疏水蛋白浓度1-100pg/mL-玻璃片在50mMpH4醋酸钠+0.1%吐温20中培育过夜(温度80。C)-包蜂皮以后，在蒸馏水中清洗國然后于80。C在l。/oSDS中培育IO分钟-在蒸馏水中清洗聚四氟乙烯(Teflon):-浓度1-100pg/mL-聚四氟乙烯(Teflon)平板在10mMpH8的Tris中培育过夜(温度80。C)-包3皮以后，在蒸馏水中清洗-然后于80。C在1%吐温20中培育10分钟-在蒸馏水中清洗-然后于80。C在l。/oSDS中培育10分钟-在蒸馏水中清洗样品在空气中干燥，测定5pl水滴的接触角(单位为度)，得到如下值，例如根据实施例8以yaad-DewA融合蛋白进行实验(对照无蛋白质；yaad-dewA-his6:100pg/ml融合蛋白西己4禺体)_80°C,ly。SDS处理之后聚四氟乙烯Teflon玻璃对照96.830yaad97.438.7100ng/ml77.776.850fig/ml85.977.910吗/ml83.574.55fig/ml10470.31fig/ml104.973实施例10具有疏水妄白表面的包^L/评估玻璃(窗玻璃，StiddeutscheGlas，Mannheim,Germany):-疏水蛋白浓度100吗/mL画玻璃片在50mMpH4的醋酸钠+0.1%吐温20中培育过夜(温度80°C)-包^f皮以后，在蒸馏水中清洗-然后于80。C在1%SDS的蒸馏水溶液中培育10分钟-在蒸馏水中清洗样品在空气中干燥，且测定5pl水滴的接触角(单位为度)。接触角的测量用Dataphysics接触角系统OCA15十仪器，应用软件为SCA20.2.0.(2002年11月)。根据制造商的说明书进行测量。未处理的玻璃接触角为30±50，以根据实施例8(yaad-dewA-his6)的功能性疏水蛋白包被的玻璃接触角为75±5。。序列表中DNA和多肽序列的序列命名<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>权利要求1.通用结构式(I)的多肽Xn-C1-X1-50-C2-X0-5-C3-Xp-C4-X1-100-C5-X1-50-C6-X0-5-C7-X1-50-C8-Xm(I)其中X可以是任何20种天然存在的氨基酸，n和m是0-500之间的数，p是1-250之间的数，C是半胱氨酸、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸或苏氨酸，有至少4个由C指定的残基为半胱氨酸，附带条件是至少一个缩写为Xn或Xm或Xp的肽序列是长度至少为20个氨基酸的非天然连接至疏水蛋白的肽序列，该多肽在包被玻璃表面之后使接触角改变至少20°。2.根据权利要求l的多肽，其中结构式(I)包含I类疏水蛋白。3.根据权利要求l的多肽，其中结构式(I)包含的疏水蛋白选自dewA、rodA、sc3、hypA、hypB、basfl、basf2组成的组。4.根据权利要求1的多肽，其中结构式(I)包含选自SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14的序列。5.根据权利要求l的多肽，其中Xn或Xm包含选自SEQIDNO:16、18的多肽序列。6.根据权利要求1的多肽，其中Xn或Xm或Xp是(His)w。序列。7.根据权利要求1的多肽，其中结构式(I)包含的多肽选自SEQIDNO:20、22、24组成的组。8.编码权利要求1-7中定义的多肽的核酸。9.产生权利要求l-7中定义的多肽的方法，该方法是通过在宿主生物体中表达权利要求8中定义的核酸，并且，如果合适则在纯化之后，分离由此获得的蛋白质。10.根据权利要求9的方法，其中使用的宿主生物体是大肠杆菌。11.权利要求1-7中定义的疏水蛋白用于表面包被的用途。全文摘要本发明涉及通用结构式(I)的多肽及其生产和用途。文档编号C07K14/37GK101193911SQ200680020577公开日2008年6月4日申请日期2006年6月9日优先权日2005年6月10日发明者C·博尔施韦勒,H·巴尔格,H-G·勒迈尔,M·考罗什,T·萨布科夫斯基申请人:巴斯福股份公司